Name: העשרה ואיתור הפרסטרידיום של רעלים בדגימות מזון קמעונאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: למדו שיטה לאיתור Clostridium perfringens בדגימות מזון קמעונאי, עם דגש על זיהוי טוקסינוטיפים B ו-D המייצרים את הרעלן אפסילון. הפרוטוקול מבוסס על העשרה ללא צורך בתאים אנאירוביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה לא קיבל שום מימון ספציפי ממגזר הציבורי, המסחרי או לא-למטרות רווח.

הערה: ג. פרטיגנס נחשב לסיכון ביולוגי ברמת בטיחות 2 (BSL2). למרות שלא כל דגימות המזון יכילו את הג, יש להתייחס לכל הדגימות המתורבתות ככאלה. יש לענוד את כל אמצעי הזהירות וציוד ההגנה הנאותים (PPE) בכל עת. טהרים כל החומר לפני סילוק.
1.הכנת RPM שונה 4,15
<ol><li>לשלב 30 g/L נוזל thioglycolate בינוני, 60 g/L ג'לטין, 5 g/L peptone, 5 g/L גלוקוז, 5 g/L אשלגן פוספט dibasic, 3 g/L תמצית שמרים, 1.5 g/L נתרן כלוריד, 0.5 g/L ברזל סולפט במים מיווים עד שווה התפזרו. אנחנו בדרך כלל עושים 1 קבוצות L.</li>
	<li>אוטוקלב ב 121 ° c עבור 15 דקות.</li>
	<li>אפשר להתקרר כ 40 ° c.</li>
	<li>לאחר RPM הוא קריר, להוסיף D-ציקלוסרין לריכוז הסופי של 440 mg/L. הערה: ריכוזי המלאי של D-ציקלוסרין הומס במים סטריליים ב-50 מ"ג/mL עשויים להיות מאוחסנים ב-20 ° c לשימוש עתידי.</li>
	<li>העברה באופן כסטי 10 מ ל של RPM עד 15 מ ל שפופרות חרוט. RPM ניתן להכין בקבוצות ומאוחסנות ב -4 ° c עד חודש אחד.</li>
	<li>מעבר ל37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.</li>
</ol>2. אוסף דוגמאות ודגירה RPM
<ol><li>הובלה מזון למעבדה תחת טמפרטורות הסביבה בתוך 1 h. ניתן להעביר מזון באריזות מקוריות או במכולות סטרילי. אם לא בודקים מיד, ניתן לאחסן את המזון ב-20 ° צ' עד לשימוש. שים לב לסוג המזון ולמדינת המקור בהתאם לתווית האריזה, אם הוא זמין, וכן כל מידע רלוונטי אחר.</li>
	<li>הסר כ 1.0 – 2.0 גר' מזון והעברה לצלחת פטרי סטרילית או שווה ערך. . עם סכין גילוח סטרילי או אזמל</li>
	<li>האיחסן לתוך 10 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS) ב 15 מ"ל צינור חרוט. . תערבב היטב<ol>
<li>כדי לבחור עבור תאים וגטטיבי, להעביר 5 מ ל של תערובת מזון PBS לתוך שפופרת של 15 מ ל בצורת חרוט 10 מ ל של RPM. . תאבטחו את המכסה בחוזקה</li>
		<li>כדי לבחור עבור נבגים, לחמם את הנותרים 5 מ ל של תערובת מזון PBS ב 85 ° c עבור 15 דקות ולאחר מכן להעביר לצינור 15 מ"ל המכיל 10 מ ל של RPM. . תאבטחו את המכסה בחוזקה</li>
	</ol>
</li>
	<li>מערבולת ולהפוך את המזון-RPM התרבויות כדי להבטיח ערבוב מלא.</li>
	<li>חותם הדוק את צינורות חרוט ולעטוף מכסים עם סרט פרפין או ניילון לעטוף כדי להבטיח סביבה אנאירובית.</li>
	<li>דגירה לילה (ב) ב 37 ° c.</li>
	<li>למחרת בבוקר הערה כל עכירות או תסיסה בצינורות RPM.</li>
</ol>3. הציפוי "סנדוויץ '"
<ol><li>החיסונים על התרבויות RPM לתוך TSC אגר באמצעות טכניקת "סנדוויץ '" (איור 2) המתואר להלן.</li>
	<li>הכינו TSC נאגר לפי הוראות היצרן.<ol>
<li>הכינו את שכבת הבסיס של צלחות TSC על ידי העברת 10 מ ל של TSC מותכת אגר כדי מנות פטרי סטרילי ולאפשר לגבש. אלה עשויים להיות מוכנים בשלב מתקדם ומאוחסן ב -4 ° c. יש לוודא שלוחות מחוממים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
		<li>עבור השכבה העליונה של לוחית TSC, לשמור על הנותרים TSC אגר מותכת ב 40 ° c. הערה: למרות שנקודת ההיתוך של אגר היא מעל 85 ° c, אגר מותכת מתקשה סביב 32-45 ° צ'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בזהירות לאחזר את התרבויות ON RPM ולהעביר 100 μL לבסיס TSC אגר. בגלל תסיסה, יש תרבויות שעלולות להיות תחת לחץ. הקפידו ללבוש את כל הPPE המתאים.</li>
	<li>הפיצו את סל ד באמצעות חרוזי זכוכית מעוקר או spreader תא.</li>
	<li>אפשר RPM להיות "נספג" לתוך TSC אגר עבור 5 – 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>העברה בזהירות של 20 מ ל של מותכת, 40 ° c מעלות צלזיוס לצלחת באמצעות מצפטה סרוולוגית.</li>
	<li>להחליף את מכסה צלחת פטרי ולאפשר TSC אגר כדי לחזק לחלוטין בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>היפוך צלחת פטרי ו הדגירה ב 37 ° c ON.</li>
	<li>אם מדלל סדרתי רצוי, לבצע דילול של התרבויות ON RPM לתוך טרי, מחומם מראש התחמם לפני החיסון TSC אגר.</li>
</ol>4. תת-הנפה של מושבות סולפיט-הפחתת
<ol><li>למחרת בבוקר, להסיר צלחות מתוך החממה ולבחון את הצמיחה חיידקי. חיידקים אירוביים עשויים להיות נוכח על פני השטח של אגר. חיידקים אנאירובית ימצאו גדל מוטבע בתוך אגר. סולפיט-להפחתת חיידקים להפוך סביב אגר שחור. ניתן לקבל מושבות של הפראגנים יהיו שחורים ומשובצים באגר.</li>
	<li>
ג. הפרתוגנים החשודים במושבות יהיו חיוביים להפחתת סולפיט והוא יופיע שחור, מוטבע בתוך אגר. באמצעות הטפטפת סטרילי, להשתמש יחיד, "לקטוף" את המושבות השחורות מן אגר ולהעביר 10 מ ל של סל ד טרי ב 15 מ"ל שפופרת חרוט. חשוב כי האוויר מן הטפטפת להיות מגורש לפני פירסינג אגר.</li>
	<li>אם יש כמות צפופה של גידול בקטריאלי אירובית על פני השטח של הצלחת, להשתמש מגרד תא סטרילי להסיר מושבות מאזורים נבחרים. מספר רב של מושבות החשודים במושבות ניתן לדגום מלוחית ה-tsc באותה הצלחת לתוך התרבויות הנפרדות של RPM.</li>
	<li>שפופרת מאובטח היטב בצינור חרוט ולעטוף בסרט פרפין או ניילון לעטוף. . מופעל ב-37 ° c</li>
</ol>5. הפקת דנ א
<ol><li>להסיר על התרבויות RPM ולבחון סימנים של צמיחה כולל עכירות ותסיסה.</li>
	<li>להפוך בעדינות את התרבות RPM לפזר חיידקים שיוחסו ופתוח בזהירות. העבר 1 מ ל של התרבות לצינור מיקרוצנטריפוגה.</li>
	<li>צנטריפוגה במהירות העליונה (כ 15,000 x g) עבור 10 דקות כדי חיידקים גלולה.</li>
	<li>לשטוף את הגלולה עם 1 מ ל של הערוץ הסטרילי.<ol>
<li>בנסיבות מסוימות, ג'לטין לא מתעכל יהיה ליישב על גבי חיידקים לפלטד. כדי להסיר את הג, "מוך" מחוץ לג על ידי הגאתה בעדינות עם PBS באמצעות מיקרופיפטה. בזמן שהוא משאיר. את הגלולה החיידקית ללא פגע</li>
		<li>הסירו את תערובת הPBS-ג'לטין. בשאיפה עדינה השהה מחדש את הגלולה החיידקית הנותרת עם 1 מ ל של PBS טרייה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צנטריפוגה את הגלולה החיידקית מחדש במהירות הגבוהה ביותר עבור 10 דקות ומתה בזהירות את הסופרנטאנט.</li>
	<li>באופן מיידי לבצע חילוץ DNA באמצעות ערכת החילוץ DNA ופרוטוקול שנוצר במיוחד עבור ה-DNA החילוץ מחיידקים גראם חיוביים (לראות את הטבלה של חומרים).</li>
	<li>השתמש ב-DNA חילוץ מיד או לאחסן ב-20 ° c עד ניתוח ה-PCR.</li>
</ol>6. זיהוי הפרשגנים באמצעות ה-PCR
<ol><li>כדי לקבוע אם התרבויות הן חיוביות עבור C. שולי רעלים רעילות, לבדוק DNA שחולצו עבור גנים שונים רעלן באמצעות ה-PCR. הערה: מכיוון שאנו מעוניינים בעיקר ב-אפסילון רעלן הפקת זנים B ו-D C. פרשגנס, אנו מעריכים את נוכחותם של הגנים אלפא, בטא, ו אפסילון הרעלן. . התחל מופיע בשולחן 2 התחל עבור ה-DNA ריבוזומבית של 16 s משמשים כבקרת חילוץ DNA. ניתן להשתמש בצבעי יסוד נוספים כדי לבדוק רעלים מסוג A עד G וניתן למצוא אותם בספרות המפורסמת2,12,13.</li>
	<li>השימוש שחולצו בעבר ג. א. ה. DNA כשליטה חיובית. פקד זה מבטיח שכל הרכיבים של תגובות ה-PCR פועלים. אנו משתמשים ב-DNA שחולצו מ -C פרשגנס סוג B (atcc 3626) כמו שליטה חיובית שלנו. לגדול ATCC 3636 ON ב-RPM ב 37 ° צ' ו לחלץ DNA באמצעות אותן שיטות שתוארו בשלבים 5.1 – 5.7. חנות DNA שחולצו ב-20 ° צ' עד השימוש.</li>
	<li>הגדר את תנאי ה-PCR כדלקמן: 94.0 ° צ' למשך 3 דקות; 94.0 ° צ' עבור 30 ס מ; 47.9 ° צ' עבור 30 s, 72.0 ° צ' עבור 1 דקות (חזור על שלבים 2 – 4 עבור 35 מחזורים); 72.0 ° c במשך 10 דקות.</li>
	<li>כדי לאשר את מוצרי ה-PCR, הפעל את תגובות ה-PCR ב-1.8 g/100 מ"ל ג'ל באמצעות טכניקות סטנדרטיות. גדלי המוצר הצפויים של ה-PCR מפורטים בטבלה 2. תוצאות ה-PCR האופייניות מוצגות באיור 3.</li>
</ol>

<ol><li>Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+perfringens%3A+toxinotype+and+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Clostridium perfringens: toxinotype and genotype.</a> Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).</li>
<li>Rood, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+Clostridium+perfringens+toxin-based+typing+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme.</a> Anaerobe. , (2018).</li>
<li>Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+sheep-multiple+sclerosis+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">A review of the sheep-multiple sclerosis connection.</a> Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).</li>
<li>Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Clostridium+perfringens+type+B+in+an+individual+at+first+clinical+presentation+of+multiple+sclerosis+provides+clues+for+environmental+triggers+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease.</a> PLoS One. 8, 76359(2013).</li>
<li>Wagley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Clostridium+perfringens+epsilon+toxin+associated+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis.</a> Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).</li>
<li>Linden, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+perfringens+Epsilon+Toxin+Causes+Selective+Death+of+Mature+Oligodendrocytes+and+Central+Nervous+System+Demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination.</a> MBio. 6, 02513(2015).</li>
<li>Popoff, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsilon+toxin%3A+a+fascinating+pore-forming+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin.</a> FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).</li>
<li>Lee, C. A., Labbe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+Enterotoxin-+and+Epsilon-Positive+Clostridium+perfringens+Spores+in+U.S.+Retail+Spices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices.</a> Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).</li>
<li>Wen, Q., McClane, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enterotoxigenic+Clostridium+perfringens+type+A+isolates+in+American+retail+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).</li>
<li>Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Clostridium+perfringens+in+retail+chicken+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers.</a> Anaerobe. 21, 67-68 (2013).</li>
<li>Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+Clostridium+perfringens+in+American+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Incidence of Clostridium perfringens in American foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).</li>
<li>Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Clostridium+perfringens+type+C+enteritis+in+pigs+using+a+DNA+amplification+technique+%28PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medicine%2C+Series+B%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR).</a> Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).</li>
<li>Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+test+for+differentiation+of+five+toxin+types+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens.</a> Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).</li>
<li>Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+clostridium+perfringens+during+simulated+transport+and+stability+of+some+plasmid-borne+toxin+genes+under+aerobic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Veterinaria+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions.</a> Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).</li>
<li>Erickson, J. E., Deibel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+medium+for+rapid+screening+and+enumeration+of+Clostridium+perfringens+in+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).</li>
<li>Regan, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epsilon+toxin-producing+Clostridium+perfringens+strains+in+American+retail+food%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food.</a> Anaerobe. 54, 124-127 (2018).</li>
</ol>

אין הגילויים.

כאן אנו מתארים שיטה כדי לזהות את השכיחות של C. שכיחות בדגימות מזון קמעונאי עם subculturing מוגבלת, ללא שימוש במערכת קאמרית אנאירובית. שיטה זו משתמשת בשילוב של טכניקות כדי להגביר את הזיהוי של C. פרסוגנים מדגימות מזון. על-ידי שימוש בגירסה ששונתה של מדיית RPM, אנו מאפשרים את התפתחותם הסלקטיבית של C. פרמיגנס. על ידי sandwiching את סל ד מחוסן בין שכבות של TSC אגר, אנחנו מסוגלים לזהות ולבודד אנאירובית, סולפיט הפחתת חיידקים מאפיין של C. פרצוגנים. כדי לאשר את נוכחותו של C. pergens, סולפיט המושבות מושבות הם תת-תרבותית לתוך סל ד טרי. הגרסה ששונתה או RPM מאפשר לנו בקלות לחלץ DNA מתרבויות, המאפשר אישור PCR של גנים הרעלן ספציפיים. אישור לקבלת דגימות מזון מזוהם ניתן להשיג בתוך שלושה ימים.
בניסויים מוקדמים, דגימות מזון היו פשוט מחוסן לתוך RPM ו-DNA שחולצו מן התרבויות. שיטה זו הביאה לגילוי של C. פרסוגנים במספר מצומצם של דגימות (נתונים לא מוצגים). למרות RPM הוא סלקטיבי לצמיחה c. pergens , זה לא בלעדי עבור c. פרמיגנס צמיחה. אחר, גראם חיובי, D-cycolserine חיידקים עמידים עדיין יכול לגדול RPM. אנו שיערו כי זיהום על ידי מינים חיידקים אחרים אולי ירדו הגילוי שלנו של C. pergens זנים על ידי הפחתת רגישות של ניתוח ה-PCR שלנו הראשון שלנו בתרבות RPM. צעד מכריע בהגברת הזיהוי של הטכניקה הייתה הכללה של טכניקת ה סנדוויץ ' של tsc אגר. זה איפשר לנו להבדיל ולבחור עבור המושבות אנאירובית, סולפיט הפחתת מושבות, מאפיין של C. פרסגנס. צעד מפתח בתהליך זה הוא להבטיח כי השכבה העליונה של TSC אגר מותכת הוא ב 40 ° c. למרות שזנים של C. pergens יכול לצמוח בטמפרטורות מוגברת (46 – 48 ° c)15,16, תוספת של אגר מותכת בטמפרטורות מוגברת מפחית במידה ניכרת את כמות התרבויות ששוחזרו, בעיקר כנראה בשל מוות התאים .
קיימות מספר מגבלות פוטנציאליות לשיטה זו. כפי שהוזכר קודם לכן, לא RPM או TSC אגר בוחרת או מבדיל עבור C. פרצוגנים באופן בלעדי, המאפשר צמיחה של זנים חיידקיים אחרים להיות בדגימות מזון. זה עשוי להפחית את הרגישות של האפשרות לבחור עבור C. הפרגנים בלבד. עם זאת, זוהי מגבלה נפוצה כמעט כל טכניקות culturing. אימות הגנוזה של מבודד מטוהר הוא השיטה הטובה ביותר לזיהוי בוודאות של C. פרפיגנס ומינים חיידקיים אחרים. מגבלה נוספת של מחקר זה היא כי אנחנו לא לבדוק את הבודד מטוהר. במתכוון עשינו את זה כדי להגביל את כמות subculturing, כמו subculturing חוזרת הוא חשש לגרום הפסד פלמיד. מכיוון שאיננו מבודדים לטוהר, ייתכן כי מספר רב של מרבית הרעלים עלולים להיות נוכחים באותה דוגמית או תת-תרבות. אם החוקרים רוצים לקבל מבודד מטוהרים, שיטות טיהור סטנדרטי ניתן להשתמש בתרבות RPM האחרון שמתואר בשיטה זו; זה דורש בדרך כלל את השימוש של תאים אנאירובית. למרות ששימש במקור לבידוד c. פרסוגנים ממזון, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות ולבודד c. פרסוגנים מהמון מקורות. במיוחד, יישום אחד כזה של שיטה זו היא לבדוק דגימות צואה של בני אדם (או בעלי חיים) כי הם חשודים נגועים עם C. פרצוגנים ורעלים החיידקים כדי להבין טוב יותר את מקור הזיהום.

קלוסטרידיום פרצגנס (ג. פרצגנס) הוא גראם חיובי, אנאירובי, יוצר נבג, חיידק בצורת מוט שנמצא אוביקוויטיבי בסביבה. זן זה של חיידקים נושאת גנים המקודדים במשך מעל 17 רעלים, היסטורית, התאפיין בחמישה רעלים (A-E) מבוסס על נוכחות של ארבעה גנים הרעלן שונים: אלפא, בטא, אפסילון, ו הרעלן איודה (שולחן 1)1. לאחרונה, הוצע כי זו ערכת הקלדה צריך להתרחב כדי לכלול את הסוגים F ו-G, אשר הנמל C. pergens בידור (cpe) ו-netb הרעלן, בהתאמה2. עם זאת, נדרש מחקר נוסף לפני מערכת זו מזימות מקובלת רשמית. בעוד גן אלפא רעלן הוא בהחלט ממוקם כרומוסומלית, הגן CPE ניתן למצוא הן על כרומוזום ו פלמידים. לעומת זאת, הגנים הנותרים של הרעלים מצויים בפלמידים שונים בגודל שונה. אנו מעוניינים במיוחד בשכיחות של C. pergens סוגים B ו D כמו זנים אלה לייצר אפסילון רעלן, חזק מאוד, הנקבוביות להרכיב רעלן, אשר הוצע לשחק תפקיד מפעילה טרשת נפוצה (MS) בבני אדם3 ,4,5,6,7. כיצד אנשים הופכים נגועים או הכובש על ידי זנים אלה אינו ידוע. הסבר אפשרי אחד הוא באמצעות צריכת מוצרי מזון מזוהמים. כדי לעזור לענות על שאלה זו, ביקשו לקבוע את השכיחות של שונים של C. הפרגנים רעלים בדגימות המזון האמריקאי.
הנוכחות של C. pergens רעלים בדגימות המזון האמריקאי הוא למד לעתים קרובות דורש שימוש של מערכות מכולה אנאירובית ושלבים רבים sub-culturing8,9,10,11 . למרות שפעולות sub-culturing רבות נחוצות כדי לקבל מבודד מטוהר, שיטה זו יכולה להוביל לאובדן של פלמידס לאורך זמן12,13,14, ואולי להשפיע על גילוי של גנים רעלן בשלבי המועברות . כולל הגן הרעלן של אפסילון ביקשו לפתח שיטה קלה, עם פחות צעדים תת-שלבי, לתרבות בררנית C. פרפוגנים ללא שימוש בתאים אנאירובית, צנצנות או שקיות. בקצרה, דגימות מזון מחוסנו לתוך מדיה פרטוגנס מהירה (RPM) לילה (ב), אז "דחוקה" לתוך TSC אגר ו מודב. המושבות שנחשדו כאלה הם משני מתורבתים לאחר מכן לתוך סל ד ומודגרות שוב ושוב . ה-DNA מופק ו-PCR המבוצעים כדי לקבוע גנוטיפ (איור 1). בחרנו להשתמש RPM כפי שהוא הוכח כדי להגדיל את ההתאוששות של C. pergens זנים מתוך דגימות מזון לעומת מדיה רגילה אחרים15. בנוסף, RPM השתמשו בהצלחה כדי לבודד את אפסילון מייצר סוג B זן מחולה MS4. אנו משתמשים בגירסה ששונתה של RPM במקום בגירסה המקורית כדי לאפשר חילוץ קל DNA. בעוד שיטה זו מאפשרת זיהוי קל של גנים הרעלן בתוך דגימות, ייתכן שמדגם בודד יכיל יותר C. pergens toxinotype. מכיוון שהשיטה שלנו לא לבודד זנים מטוהרים באמצעות סיבובים מרובים של טיהור, זיהוי של רעלים מרובים מדגם אחד אינו אפשרי. עם זאת, טכניקות טיהור סטנדרטיות (בדרך כלל יורד על צלחות TSC או לוחות דם אגר) ניתן להחיל בסוף הפרוטוקול שלנו כדי להשיג תרבויות מטוהרים.

<table><tbody><tr><td>D-Cycloserine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6880</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>סיגמא מדעי החיים</td><td>D9434-250G</td><td></td></tr><tr><td>צנרת העברה חד פעמית</td><td>בכל מותג</td><td></td><td>בחר אחד עם קצה דק כמו צנרת העברה חד פעמית Thermo Scientific 137116M/EMD</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & ערכות רקמות</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>הערה: ערכות מיצוי DNA ופלסמיד רבות הוערכו, ערכה זו נתנה את התוצאות הרצויות ביותר.</td></tr><tr><td>חממה יבשה</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוזל תיוגליקולט בינוני</td><td>רמל</td><td>R453452</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר</td><td>סיגמא מדעי החיים</td><td>G1890-500G</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים בודדים</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ברזל (II) סולפט הפטהידרט</td><td>סיגמא מדעי החיים</td><td>F8633-250 גרם</td><td></td></tr><tr><td>ליזוזים מחלבון ביצת עוף</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>נחוץ למיצוי DNA, לא מסופק בערכה</td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>כל פרפילם</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מותג או ניילון נצמד</td><td>פפטון כלשהו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקזאין וחלבונים אחרים מן החי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70173-100G</td><td></td></tr><tr><td>בסיס אגר Perfringens (TSC + SFP)</td> <td>Oxoid</td><td>CM0587</td><td>Make TSC agar בהתאם להוראות</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222-100G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7653</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים סטרילי</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מפזר תאים סטרילי</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנות פטרי סטריליות</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אספקה וציוד לאלקטרופורזה של ג'ל</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq&nbsp; PCR מאסטר מיקס קיט</td><td>Qiagen</td><td>201443</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler לתגובת PCR</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70161-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

העשרה ואיתור הפרסטרידיום של רעלים בדגימות מזון קמעונאי

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

קלוסטרידיום פרפיגנס (ג. פרפיגנס) הוא מפיק רעלים פורה וגורם למגוון רחב של מחלות במארחים שונים. ג. פרהגנס מסווג לחמישה רעלים שונים, A דרך E, מבוסס על כרכרה של ארבעה גנים הרעלן העיקריים. השכיחות וההפצה של הרעלים השונים הללו הם בעלי לימודים שונים, במיוחד הpervasiveness שלהם במזון הקמעונאי האמריקאי. עניין מיוחד לנו הם הסוג B ו-D זנים, אשר מייצרים אפסילון רעלן, רעלן קטלני ביותר הציע להיות הגורם הסביבתי של טרשת נפוצה בבני אדם. כדי להעריך את הנוכחות של C. pergens רעלים שונים בדגימות מזון שונים, פיתחנו שיטה קלה באופן סלקטיבי תרבות חיידקים אלה ללא שימוש במערכת מכולה אנאירובית רק מעורבים שלושה צעדים culturing. מזון נרכש מחנויות מכולת מקומיות ומועבר למעבדה בתנאי הסביבה. דגימות הם כתוש ומחוסן לתוך שונה מדיה הפרטוגנים מהירה (RPM) ו מודבטים לילה ב 37 ° c בצינור אטום, אטום חרוט. תרבויות לילה מחוסנת על שכבה תחתונה של טריקטוז סולפיט ציקלוסרין (TSC) אגר, ולאחר מכן מצופה בשכבה העליונה של מותכת TSC אגר, יצירת סביבה "דחוקה", אנאירובית. לוחות אגר מודבטים לילה ב 37 ° c ולאחר מכן מוערך עבור המראה של שחור, סולפיט להפחתת המושבות. ג. הפרטוגנים-מושבות החשודות מוסרות מ-tsc אגר באמצעות מדרומי עיניים סטריליים, ומחוסן לתוך RPM ו-sub-תרבותי לילה ב 37 ° c בצינור אטום חרוט. ה-DNA מופק מתוך תת-תרבות RPM, ולאחר מכן ניתח עבור נוכחות של C. הפרשגנים הרעלן באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR). בהתאם לסוג המזון שנדגם, בדרך כלל 15-20% של דגימות מבחן חיובי עבור C. פרשגנס.

באמצעות שיטה זו, 15 – 20% של המזונות שנדגמו שלנו מבחן חיובי C. פרסוגנים. בעוד רוב הזנים הם חיוביים עבור toxinotype A, הבחנו בהצלחה הן סוג B ו-D בדגימות מזון. בעיתון שפורסם בעבר בדקנו סך של 216 דגימות מזון שנרכשו מניו יורק החנויות הקמעונאיות16 (שולחן 3). דגימות אלה כללו דגימות בשר שונות (בשר בקר, כבש, חזיר טלה), דגימות עוף (עוף והודו), ודגימות פירות ים (בקלה, סלמון, רכיכה, מכיש, פלאנדר, דיונון, אמנון, טונה, ודגים שונים). התוצרת ודגימות החלב נבדקו גם הם. של 216 דגימות, 34 (16%) היו חיוביות ל -C. פרפראגנים. של 34 C. הפרהגנים דגימות חיוביות, 31 דגימות (91.2%) הכיל את הרעלן אלפא, מדגם אחד (2.9%) הכיל את אלפא, בטא, אפסילון הרעלן, ושתי דגימות (5.9%) הכיל את האלפא. והרעל אפסילון
מעניין, גילינו גם כי C. פרשוגנים היה נפוץ יותר כמו תאים וגטטיבי לעומת הנבגים. עשרים וחמש דגימות הושוו לנוכחות של וגטטיבי C. שולי תאים או נבגים. נבגים נבחרו על ידי מחממים דגימות מזעזע ב 85 ° c עבור 15 דקות. מתוך 25 דגימות נבדק, 16% היו חיוביים עבור וגטטיבי C. הפרטגנים זנים לעומת 4% עבור נבגים. זה מצביע על כך שהוא עשוי להיות יעיל יותר לבדוק רק תאים וגטטיבי במקום שניהם.
<img alt="דיאגרמת זרימת עבודה של ניתוח PCR של דגימת מזון למיצוי DNA מתאים/נבגים בשיטת הלם חום." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: מבט כולל על הפרוצדורה. דגימות המזון מדולולות. ומדולל בתוך הערוץ הסטרילי מחצית מדגימת ה-PBS-פוד מחוסנת לתוך RPM כדי לבחור עבור תאים וגטטיבי. מדגם ה-PBS-פוד הנותר מזועזע מחום ב-85 ° c במשך 15 דקות כדי לבחור לנבגים לפני החיסון לפני החיסונים. תרבויות מודבטים על 37 ° c ומצופה לתוך TSC אגר. TSC אגר הוא מודב ב 37 ° צ' ושחור, התרבויות להפחתת סולפיט הם תת תרבותית לתוך סל ד טרי. תרביות סל ד מתורבת הם מודבטים ב 37 ° c ו-DNA מופק לבצע גנוהקלדה באמצעות ה-PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תרשים אלקטרופורזה של ג'ל שכבתי; שכבות TSC ו-RPM להפרדת DNA בצלחת פטרי." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: סכמטית של טכניקת הסנדוויץ ' TSC אגר. מדיית RPM המכילה את החיידקים של C. pergens מצופים בין שתי שכבות של tsc אגר על מנת לקדם את הסביבה אנאירובית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תוצאות אלקטרופורזה; להקות DNA; זיהוי מינים; תרשים ג'ל; סולם 250-750 נ&quot;ב." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: תוצאות ה-PCR שנבחרו. תמונות לדוגמה של תוצאות הגנוטיפ של c. פרשגנים משבעה סוגים שונים של מזון, ושליטה חיובית של c. פרשגנס סוג B. סולם משקל מולקולרי (הנתיב הראשון של כל ג'ל) שימש לקירוב הגודל של תוצאות ה-PCR בזוגות בסיס (bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">טוקנוטיפ</td>
			<td>אלפא</td>
			<td>בטא</td>
			<td>אפסילון</td>
			<td>איודה</td>
			<td>CPE</td>
			<td>הוצאת רשת</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">וקמה</td>
			<td>קצת</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">מוצע</td>
			<td>F</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">+ הווה -לא נוכח +/-ייתכן או לא להיות נוכח</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1: מבט כולל על מבני הגנוסוגים. תרשים של שילובים של רעלים המיוצר על ידי כל C. פרשגנס toxinotype.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>יעד</td>
			<td>פריימר זוגות</td>
			<td>מוצר ה-PCR הצפוי (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td>אלפא</td>
			<td>שאלה: המנון מועצת התיירות R: CCT CCT החתול CCT GTA AG</td>
			<td>325</td>
		</tr>
<tr>
<td>בטא</td>
			<td>מועד הבית של החתול CTG R: GCA GCA משחק המשחק</td>
			<td>196</td>
		</tr>
<tr>
<td>אפסילון</td>
			<td>F: GCG GTG ATA להתחייבויותיו לאווירית R: אמנות עכשווית מעשה TGT CTT למעשה</td>
			<td>655</td>
		</tr>
<tr>
<td>שנות ה-RNA</td>
			<td>F: אגה GTT TGA TGA CTC A R: משחק מחלקה T</td>
			<td>ל1300</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: מוצרי ה-PCR התחל והצפוי עבור גנים הרעלן הנבחרים. התחל בשימוש בשלב ההקלדה. של הPCR
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3" rowspan="2">סוג מזון</td>
			<td colspan="2">סוג א</td>
			<td colspan="2">סוג ב'</td>
			<td colspan="2">סוג ג</td>
			<td colspan="2">סוג ד</td>
			<td colspan="2">ג. perf +</td>
		</tr><tr><td colspan="2">אלפא רעלן חיובי</td>
			<td colspan="2">אלפא, בטא, ו-אפסילון הרעלן חיובי</td>
			<td colspan="2">אלפא ורעלן ביתא חיובי</td>
			<td colspan="2">אלפא ו אפסילון הרעלן חיובי</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr><tr><td colspan="2"></td>
			<td>n</td>
			<td>n</td>
			<td>%</td>
			<td>n</td>
			<td>%</td>
			<td>n</td>
			<td>%</td>
			<td>n</td>
			<td>%</td>
			<td>n</td>
			<td>%</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">בשר</td>
			<td>בשר</td>
			<td>38</td>
			<td>8</td>
			<td>21</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>9</td>
			<td>24</td>
		</tr><tr><td>כבש</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>חזיר</td>
			<td>15</td>
			<td>2</td>
			<td>13</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>מעורב</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>100%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>יניים</td>
			<td>64</td>
			<td>11</td>
			<td>17</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>12</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">עופות</td>
			<td>עוף</td>
			<td>19</td>
			<td>מיכל 5</td>
			<td>26</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>מיכל 5</td>
			<td>26</td>
		</tr><tr><td>טורקיה</td>
			<td>7</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>יניים</td>
			<td>26</td>
			<td>מיכל 5</td>
			<td>19</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>מיכל 5</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td rowspan="11">פירות ים</td>
			<td>קלה</td>
			<td>4</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>מעורב</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>סלמון</td>
			<td>11</td>
			<td>2</td>
			<td>18</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>מיכל שלפיש</td>
			<td>32</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>כיש</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>75%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>3</td>
			<td>75%</td>
		</tr><tr><td>פלאונדר</td>
			<td>12</td>
			<td>4</td>
			<td>33%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
			<td>33%</td>
		</tr><tr><td>דיונון</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>אמנון</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>טונה</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>אחרים</td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>13</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>יניים</td>
			<td>100</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">חלב</td>
			<td>פרה</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>עז</td>
			<td>4</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>חלב</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>יניים</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">ייצר</td>
			<td>ירקות</td>
			<td>12</td>
			<td>1</td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>פירות</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>הרב</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>יניים</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>6</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>כולל</td>
			<td></td>
			<td>216</td>
			<td>31</td>
			<td>14</td>
			<td>1</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>0.90%</td>
			<td>34</td>
			<td>16</td>
		</tr></tbody></table>שולחן 3: השכיחות של הפרזגנים השונים של ה-C. בדיקות רעלים ב-216 מזון. דוגמה לתוצאות שהתקבלו בעת שימוש בשיטה זו כדי לבדוק מזון קמעונאי עבור C. פרשגנס. טבלה זו שונתה מתוך כתב היד הקודם של ריגן ואח '16.

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות שונים Clostridium הפרסטריגנים טוקנוסוגים של מזון מקומי נרכש, במיוחד אפסילון רעלן ייצור סוגי זן B ו-D, ללא שימוש בתאי אנאירובית.

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized ...

פיתחנו שיטה קלה לבדיקת דגימות מזון עבור C perfringens טוקסינוטיפים שונים. אנו מעוניינים במיוחד בשכיחות של רעלנים B ו- D המייצרים את רעלן אפסילון. הפרוטוקול שלנו מאפשר העשרה קלה וזיהוי של רעלנים C perfringens שונים ללא שימוש בתאים אנאירוביים או אינקובטורים עם תת-culturing מוגבל.שיטה זו יכולה לשמש גם לבדיקת אדמה, מים, דגימות צואה ועוד. הדגימו את ההליך יהיו זוהא אנואר וסמנתה ריגן, טכנאים מהמעבדה. התחל על-ידי הכנת אמצעי perfringens מהיר שונה, או סל"ד.מערבבים את החומרים לפי הוראות כתב היד, ומקלים את התערובת ב-121 מעלות במשך 15 דקות. אפשר את המדיום להתקרר כ 40 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף D-ציקלוזרין לריכוז סופי של 440 מיליגרם לליטר. מעבירים את הסל"ד ל-15 מיליליטר צינורות חרוטיים, ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס עד חודש.לפני השימוש, מחממים את המדיום ל 37 מעלות צלזיוס. בעת איסוף דגימות לבדיקה, מעבירים את המזון למעבדה בהתאם לכיווני כתב היד. אם לא בודקים מיד, ניתן לאחסן את המזון במינוס 20 מעלות צלזיוס.שימו לב לסוג המזון ולארץ המוצא, כמו גם לכל מידע רלוונטי אחר. כדי לבדוק את המזון, להעביר כ 1-2 גרם לצלחת פטרי סטרילית, טחון דק עם סכין גילוח סטרילי או אזמל. לחסן אותו לתוך 10 מיליליטר של PBS בצינור חרוט 15 מיליליטר, ומערבבים היטב.בחר עבור תאים צמחיים על ידי העברת חמישה מיליליטר של תערובת מזון PBS לצינור חרוט 15 מיליליטר עם 10 מיליליטר של סל"ד וסגירת המכסה בחוזקה. בחר נבגים על ידי חימום חמשת המיליליטרים הנותרים של התערובת ל 85 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ואז להעביר אותו לצינור עם סל"ד ולסגור את המכסה בחוזקה.כדי להבטיח ערבוב מלא, מערבולת ולהפוך את תרבויות סל"ד מזון. לאחר מכן, לאטום בחוזקה את הצינורות חרוט לעטוף את העפעפיים עם סרט פרפין כדי ליצור סביבה אנאירובית. הדגירה את הצינורות לילה ב 37 מעלות צלזיוס ולציין כל ערוב או תסיסה בבוקר שלמחרת.הכן טריפטוז סולפיט Cycloserine או TSC אגר על פי כיוון היצרן, ולאחר מכן להשתמש בטכניקת כריך כדי לחסן אותו עם תרבויות סל"ד לילה. הכן את שכבת הבסיס של הצלחות על ידי העברת 10 מיליליטר של אגר מותך מנות פטרי סטריליות ומאפשר לו לחזק. שמרו על שאר ה-TSC Agar ב-40 מעלות צלזיוס לשכבה העליונה, והעבירו בזהירות 100 מיקרוליטרים של תרבות הסל"ד הלילית לבסיס אגר.תרבויות מסוימות עשויות להיות תחת לחץ עקב תסיסה, כדי להיות בטוח ללבוש את כל ציוד מגן אישי המתאים. מורחים את ה אינוקולין עם חרוזי זכוכית סטריליים או מפזר תאים, ולאפשר סל"ד להיספג לתוך אגר במשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה סרולוגית להעביר בזהירות 20 מיליליטר של TSC אגר מותך לצלחת.החלף את מכסה צלחת פטרי ולאפשר TSC אגר להתגבש לחלוטין בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להפוך את המנה דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס לילה. במידת הצורך, בצע דילול סדרתי של תרבות סל"ד לפני חיסון לתוך TSC אגר. לאחר הדגירה, לבדוק צלחות לצמיחה חיידקית.חיידקים אירוביים עשויים להיות נוכחים על פני השטח של אגר, בעוד חיידקים אנאירוביים יוטבעו אגר. חיידקים מפחיתים סולפיט יהפכו את אגר הסובבת שחור, ו אפשרי C perfringens מושבות יהיה שחור מוטבע אגר. אם יש כמות צפופה של צמיחת חיידקים אירוביים על פני השטח של הצלחת, השתמש מגרד תאים כדי להסיר מושבות מאזורים נבחרים.השתמש בטפטפת עיניים סטרילית חד-השתמשית כדי לתלוש את המושבות החשודות C perfringens מן אגר, הקפד לגרש את האוויר לפני פירסינג אגר. מעבירים את המושבות ל-10 מיליליטר של סל"ד טרי בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. ניתן לדגום מושבות מרובות מאותה לוח לתרבויות סל"ד נפרדות.לאבטח היטב את מכסי צינור חרוט, לעטוף אותם בסרט פרפין, ו דגירה אותם לילה ב 37 מעלות צלזיוס. C perfringens הוא אורגניזם BSL 2. חשוב להשתמש באמצעי זהירות נאותים בכל עת, במיוחד בעת פתיחת תרבויות סל"ד לילה כדי לטהר בזהירות ולהיפטר מדיה משומשת.למחרת, להסיר את תרבויות הלילה ולבחון אותם עבור חרפת ותסיסה, ולאחר מכן להמשיך עם מיצוי DNA. בעדינות להפוך את תרבות סל"ד כדי לפזר את כל החיידקים מיושבים בזהירות לפתוח את הצינור. מעבירים מיליליטר אחד לצינור מיקרוצנטריפוגה ומעבירים את החיידקים על ידי צנטריפוגה.לשטוף את גלולה עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי. אם ג'לטין מעוכל התיישב על גבי החיידקים, להתפיג אותו על ידי תסיסה עם PBS. יש לאסוף בעדינות את הג'לטין וה-PBS ולהשעות מחדש את גלולת החיידקים הנותרת עם מיליליטר אחד של PBS טרי.חשוב להסיר כל ג'לטין גלולה עם הפרעה מוגבלת של גלולת התא. כישלון בהסרת ג'לטין עלול לעכב מיצוי DNA ו- PCR. צנטריפוגה החיידקים במשך 10 דקות בזהירות לשאוף את supernatant.לאחר מכן לבצע מיצוי DNA באמצעות ערכה שתוכננה במיוחד עבור חיידקים חיוביים גרם. השתמש בדנ"א באופן מיידי או אחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס. בצע PCR על ה-DNA שחולץ כדי לקבוע אם התרבויות חיוביות עבור C perfringens רעלנים.השתמש ב- C perfringens DNA כפקד חיובי כדי להבטיח שכל חברי ההנהלה של PCR פועלים. הפעל את PCR על פי הוראות כתב יד ולנתח את המוצרים עם אלקטרופורזה ג'ל agarose. פרוטוקול זה שימש לבדיקת סך של 216 דגימות מזון שנרכשו מחנויות קמעונאיות בניו יורק.הדגימות כללו דגימות בשר שונות, דגימות עופות ודגימות פירות ים. C perfringens סוג B שימש כפקד חיובי. נמצא כי 15 עד 20% ממזונות שנדגמו נמצאו חיוביים עבור C perfringens.מתוך 34 הדגימות החיוביות, 31 דגימות הכילו את רעלן האלפא, מדגם אחד הכיל את רעלן אלפא, בטא ואפסילון. ושתי דגימות הכילו את רעלן האלפא והאפסילון. פיתחנו שיטה קלה לבדיקת דגימות מזון עבור C perfringens טוקסינוטיפים שונים.אנו מעוניינים במיוחד בשכיחות של רעלנים B ו- D המייצרים את רעלן אפסילון.

enrichment-detection-clostridium-perfringens-toxinotypes-retail-food

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

פרוטוקול לזהות trichothecenes (mycotoxins של דאגה לבריאות האדם) בשיטת ההקרנה החדשה שפותחה על בסיס שיטת immunochemical תחרותי זיהוי סופי אלקטרוכימיים מודגם.

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה דבק, סרט המבוסס על מדגם של עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו איתור מהיר של כל...

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

מקור: Anwar, Z., et al. העשרה וזיהוי של רעלנים של קלוסטרידיום פרפרינגנס בדגימות מזון קמעונאיות. J. Vis. Exp. (2019).בסרטון זה, חיידקים מפחיתי סולפיט מתורבתים במדיום אגר המכיל סולפיט, שם הם גדלים בצורה אנאירובית ומפחיתים סולפיט למימן גופרתי, ויוצרים משקעים שחורים עם יוני ברזל. מושבות שחורות מבודדות מעומק האגר בטכניקות אספטיות ומועברות למדיום טרי להמשך דגירה אנאירובית.

תת-תרבית של חיידקים אנאירוביים מפחיתי סולפיט מתרבית אגר

מקור: Pava-Ripoll ואחרים. זיהוי פתוגנים חיידקיים המועברים במזון מזבובי לכלוך בודדים. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון הזה מדגים שיטה מבוססת PCR שמגבירה DNA חיידקי מטרה מדגימות זבובים מועשרות באמצעות טבליות ייחודיות לפתוגן, ומאפשרת זיהוי פלואורסצנציה בזמן אמת וניתוח עקומת התכה לאישור נוכחות פתוגנים המועברים במזון בחרקים בודדים.

זיהוי מבוסס PCR של פתוגנים המועברים במזון מדגימות זבובים מועשרות

Assay qPCR פותח לצורך זיהוי של O157 החיידקים Escherichia: H7 מיקוד סמן גנטי ייחודי, Z3276. QPCR היה בשילוב עם טיפול monoazide propidium (PMA) לגילוי תא חי. פרוטוקול זה כבר שונה ומותאם לפורמט צלחת 96 היטב לטיפול קל ועקבי של דגימות רבות...

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

המטרה הכללית של מחקר זה הייתה כדי להדגים את מנגנון זיהום לחצות הפוטנציאלי של חיידקי ליסטריה הפתוגן במזון בהגדרת מעדנייה הקמעונאי. מתודולוגיה זו ניתן ליישם במגוון רחב של סביבות שונות כדי לעקוב אחר זיהום הפתוגן.

מעקב מיקרוביאלית זיהום בסביבות קמעונאיות באמצעות פלורסנט אבקה - קמעונאות מעדני סביבת דוגמא

פרוטוקול הכולל ריכוז משולב, העשרה וזיהוי קולורימטרי של נקודת קצה של פתוגנים הנישאים במזון בכמויות גדולות של מים חקלאיים מוצג כאן.  המים מסוננים באמצעות Modified Moore Swabs (MMS), מועשרים במדיה סלקטיבית או לא סלקטיבית, והזיהוי מתבצע באמצעות התקנים אנליטיים מבוססי נייר (μPAD) המשובצים במצעים קולורימטריים אינדיקטיביים חיידקיים.

מבוסס נייר Colorimetric איתור של<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt;,<em&gt; סלמונלה</em&gt; Spp., ו<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; מכמויות גדולות של מים לחקלאות

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לסנתז nanosensors תפקודית עבור ניידים, חסכוני, זיהוי מהיר של דווקא בחרו חיידקים פתוגניים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטי ואופני פליטת קרינה פלואורסצנטית.

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

פרוטוקול לפיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA הכוללת של אלקטרודות פחמן חלקיקי-לאחרונה, המסך המודפס מיוצב חומצה, זהב polylactic לזהות ויבריו parahaemolyticus מוצג.

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

קמפילובקטר הוא הגורם המוביל לדלקת גסטרואנטריטיס חיידקית המועברת במזון ברחבי העולם. למרות שמפעלים נוקטים צעדים להפחתת השכיחות בכל המתקנים שלהם, מוצרים מזוהמים מגיעים באופן עקבי לצרכנים. הטכניקה שפותחה בשתים עשרה השנים האחרונות נותנת מענה למגבלות של השיטות הקיימות לבידוד וגילוי קמפילובקטר spp. מבשר נא.

איתור ובידוד של קמפילובקטר spp. מבשר נא

למדו שיטה לאיתור Clostridium perfringens בדגימות מזון קמעונאי, עם דגש על זיהוי טוקסינוטיפים B ו-D המייצרים את הרעלן אפסילון. הפרוטוקול מבוסס על העשרה ללא צורך בתאים אנאירוביים.

העשרה ואיתור הפרסטרידיום של רעלים בדגימות מזון קמעונאי

גלה סרטונים נוספים