Name: שיטות מחקר לכלורופלסט: בדיקת מיקוד, מיקום ואינטראקציות של חלבוני כלורופלסטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 45 s
Description: חקור שיטות מחקר מתקדמות לכלורופלסט ב-Arabidopsis thaliana, כולל ייבוא חלבונים in vitro ו-in vivo, שבריר תת-תאי ו-BN-PAGE. כלים אלו מאפשרים ניתוח מיקוד חלבונים ואינטראקציות לביוטכנולוגיה צמחית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Jarvis, P., López-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Fitzpatrick, L. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+a+high+yield+of+Arabidopsis+chloroplasts+capable+of+efficient+import+of+precursor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins.</a> Plant Journal. 27 (1), 59-65 (2001).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Current Biology. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Lee, J., Kang, H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+import+into+chloroplasts+using+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying protein import into chloroplasts using protoplasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+physiologically+active+thylakoids+and+their+use+in+energy-dependent+protein+transport+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+chloroplast+sub-compartments+from+Arabidopsis+for+the+analysis+of+protein+Localization+by+immunoblotting+or+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of chloroplast sub-compartments from Arabidopsis for the analysis of protein Localization by immunoblotting or proteomics.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Salvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT_CHLORO%3A+the+first+step+when+looking+for+information+about+subplastidial+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AT_CHLORO: the first step when looking for information about subplastidial localization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1829, 395-406 (2018).</li>
<li>Shanmugabalaji, V., Douet, V., Agne, B., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+chloroplast+translocon+protein+complexes+using+the+TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the TAP tag.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ycf2-FtsHi+heteromeric+AAA-ATPase+complex+is+required+for+chloroplast+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Ycf2-FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import.</a> Plant Cell. 30 (11), 2677-2703 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thylakoid+membrane+protein+complexes+by+blue+native+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., Hirohashi, T., Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+preprotein+translocon+at+the+outer+envelope+membrane+of+chloroplasts+by+blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the preprotein translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts by blue native PAGE.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (3), 363-371 (2006).</li>
<li>Chen, L. J., Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+megadalton+TOC-TIC+supercomplexes+as+major+mediators+of+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Stable megadalton TOC-TIC supercomplexes as major mediators of protein import into chloroplasts.</a> Plant Journal. 92 (2), 178-188 (2017).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 775, Humana Press. New York City. 432(2011).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 774, Humana Press. New York City. 374(2011).</li>
</ol>

שיטות מחקר לכלורופלסט: בדיקת מיקוד, מיקום ואינטראקציות של חלבוני כלורופלסטים

Chloroplast Research Methods: Probing The Targeting, Localization And Interactions Of Chloroplast Proteins

Chloroplasts are the organelles that define plants1. Along with many other metabolic, developmental and signaling functions, chloroplasts are responsible ...

ברוכים הבאים לאוספי שיטות JoVE על שיטות מחקר כלורופלסט, שנבחרו על ידי העורך האורח שלנו, פול ג'רוויס. אוסף זה מכסה מגוון רחב של טכניקות במבחנה ובחיים המאפיינות אינטראקציות חלבונים בתוך כלורופלסטים. חוקרים מאוניברסיטת אוקספורד מתארים שיטה במבחנה המשתמשת בכלורופלסטים מבודדים, המודגרים בחלבונים מסומנים רדיואקטיביים כדי לעקוב אחרי קליטם.שיטה זו היא פיתוח של גישות קודמות ששימשו לחקר ייבוא חלבון כלורופלסט במבחנה. לאחר מכן, בשיטה משלימה, ייבוא חלבון כלורופלסט נבדק ב-vivo. שיטה זו עושה שימוש בביטוי חולף של חלבונים כימריים ופרוטופלסטים כדי לבחון שינויים בגודל חלבונים ומיקום באמצעות מיקרוסקופיה של אימונובלוטינג ופלואורסצנציה.בסרטון השיטה הזה, המחברים בחנו את מערכת הממברנה התילקואידית הנמצאת בכלורופלסטים. על ידי בידוד הממברנות, מסלולי העברת החלבונים מתבהרים בכלורופלסטים באמצעות SDS-PAGE ודימות זרחן. חוקרים בצרפת מיישמים שיטות צנטריפוגציה שונות כדי לבודד את תת-התאים שנמצאים בכלורופלסטים.החלקים התאיים המבודדים הללו מנותחים לאחר מכן באמצעות אימונובלוטינג ופרוטאומיקה כדי לספק מידע על מיקום תת-אברוני חלבוני כלורופלסטים. לאחר מכן, חוקרים שווייצרים השתמשו בטיהור זיקה של קומפלקסים רב-חלבונים של כלורופלסטים כדי לבחון את המנגנון המולקולרי המעורב בייבוא חלבונים. במיוחד קומפלקסים רב-חלבוני של דיבור וקרציות המוטמעים בממברנות מעטפת.בגישה משלימה, מדענים מאפיינים את קומפלקס החלבון תילקואיד הצמחוני ב-Arabidopsis באמצעות Blue Native PAGE, או BN-PAGE, שמאפשר הפרדה של קומפלקסים חלבונים בצורתם הטבעית והפונקציונלית. הקומפלקסים מנותחים בהמשך באמצעות SDS-PAGE דו-ממדי. הרגע קיבלתם הצצה לשיטות השונות שבהן נעשה שימוש לחקר חלבוני כלורופלסטים באוסף שיטות JoVE שלנו.ניתן לצפות במאמרים לעומק בדף האינטרנט של אוסף שיטות המחקר של כלורופלסטים המוצג בקישור שעל המסך.

chloroplast-research-methods-probing-targeting-localization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

כאן אנו מתארים שיטה חדשה ללמוד יבוא החלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים תחת לחץ. השיטה היא מהירה וישירה, וניתן להחיל ללמוד את ההשלכות של תנאי לחץ שונים לייבוא ​​חלבון הכלורופלסט, ואת מנגנוני ויסות המקביל.

ניתוח של ייבוא ​​חלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים מצמחים לחוצים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

אנו מציגים פרוטוקולים בזאת לבידוד לתפוקה גבוהה של פעיל מבחינה פיזיולוגית thylakoids, חלבון מבחני תחבורה עבור רוברטסונית ארגינין טווין כלורופלסט (cpTat), הפרשה (cpSec1), אות זיהוי החלקיקים (cpSRP) מסלולים.

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

כאן נתאר פרוטוקול כדי להביע את החלבונים לתוך protoplasts באמצעות שיטת שינוי בתיווך פג. השיטה מספקת קל ביטוי של חלבונים עניין ולאחר חקירה יעילה של חלבון לוקליזציה, תהליך הייבוא בתנאי ניסוי שונים ויוו.

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

אנו כאן מציגים פרוטוקול מוכחת ונבדק ולטיהור כלורופלסט מתחמי ייבוא חלבון (TOC-טיק מרוכב) בעזרת הברז-התג. פרוטוקול זיקה-בידוד בשלב אחד פוטנציאלי ניתן להחיל על כל חלבון, ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציה עם שותפים חדשים באמצעות ספקטרומטר מסה.

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

כאן, אנו מתארים שיטה לטהר מהכלורופלסט ללא פגע מן העלים תודרנית שלהם שלוש הראשי תת התאים (מעטפה, משתית, thylakoids), באמצעות שילוב של centrifugations דיפרנציאלית, מעברי צבע, Percoll רציף, מעברי צבע סוכרוז מקוטע. השיטה היא יקר עבור subplastidial ולוקליזציה subcellular של חלבונים על-ידי immunoblotting פרוטאומיקס.

הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

מינים רבים של צמחים משנים את המיקום של כלורופלסטים כדי לייעל את ספיגת האור. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בכלי פשוט, ביתי שנבנה כדי לחקור את התנועה כלורופלסט עלים טאליאנה Arabidopsis באמצעות שינויים בהעברת אור דרך עלה כמו פרוקסי.

שימוש בשינויים בהעברת עלים כדי לחקור את תנועת הכלורופלסט בתאליאנה של Arabidopsis

הצורך בגישות חדשות לחקר אתרי מגע עם ממברנות (MCS) גדל עקב העניין הגובר בחקר מבנים תאיים אלה ומרכיביהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיות מיקרוסקופיה שהיו זמינות בעבר כדי לזהות ולכמת קומפלקסים של חלבונים תוך-אברונים ובין אברונים השוכנים ב-MCS.

ויזואליזציה וכימות של אינטראקציות חלבון תוך-אברוני אנדוגניות באתרי קשר של ER-מיטוכונדריה על ידי מבחני קשירת קרבה

חקור שיטות מחקר מתקדמות לכלורופלסט ב-Arabidopsis thaliana, כולל ייבוא חלבונים in vitro ו-in vivo, שבריר תת-תאי ו-BN-PAGE. כלים אלו מאפשרים ניתוח מיקוד חלבונים ואינטראקציות לביוטכנולוגיה צמחית.

שיטות מחקר לכלורופלסט: בדיקת מיקוד, מיקום ואינטראקציות של חלבוני כלורופלסטים

גלה סרטונים נוספים