Name: ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: למד לייצר תאי T מונעי CAR תפקודיים לטיפול חיסוני מאמץ. השיטה שומרת על איכות התאים ומונעת התמדמדות, ומאפשרת שרידות ופעילות אפקטיבית לאחר השתלה בגוף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו באמצעות מימון שסופקו על ידי התרופות נוברטיס באמצעות ברית מחקר עם אוניברסיטת פנסילבניה (מייקל C. Milone), כמו גם את פרס מלומד בקרן סנט בלדריק (סאבא Ghassemi).

כל לימודי בעלי החיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת פנסילבניה.
1. הפעלת תא T, התמרה והרחבה
<ol><li>הפעל טרי או cryopreserved מורות האדם הראשי T תאים על ידי ערבוב עם מחרוזות anti CD3/CD28 מגנטי (g., dynabeads) ביחס של 3 חרוזים לכל תא T ב 6-היטב מנות תרבות התא. תרבות T תאים ב-X-VIVO 15 בינוני בתוספת עם 5% סרום AB אנושי רגיל, 2 מ"מ L-גלוטמין, 20 מ"מ HEPES, ו IL2 (100 יחידות/mL). לשמור על תאי T בריכוז של 106 תאים T/mL במהלך ההרחבה. התרבות T תאים ב 37 ° c, 20% O2, ו 95% לחות עם 5% CO2.</li>
	<li>לאחר גירוי הלילה, להוסיף לתאי T מופעלים. לחשב את הנפח של סופרנטנט הדרוש כדי להשיג ריבוי של זיהום (מוי) של 3-5. הערה: מכונית CD19-BBζ מורכבת מציר CD8 וירוס, 4-1BB תחום מגירוי, ו CD3ζ איתות בתחום21. CD19-BBζ מאוד הופק על ידי סופר ויראלי כפי שתוארה בעבר21.</li>
	<li>ביום 3, לאסוף מייצג מייצגים של תאים עבור הקפאה קריוגנית. לפני הקפאת ההזמנה, להסיר את החרוזים המגנטי על ידי ליטוף עדין והפרדה מגנטית. הכינו אמצעי הקפאה המכילים תמיסת מלח (PBS) עם 0.5% diמתיל סולפוקסיד (DMSO) והחנות ב -4 ° c עד השימוש.<ol>
<li>התאים צנטריפוגה T ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט ולהוסיף 5 מ ל של PBS. בתאי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ולהיפטר PBS.</li>
		<li>השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של בינונית הקפאה קרה. הקפאת תאי T במיכל קפוא מקורר ולאחסן ב-80 ° c עבור 48 h. העבירו את התאים הקפואים. לחנקן נוזלי</li>
	</ol>
</li>
	<li>שטוף את שאר התאים T פעם ב 5 מ ל של PBS לחסל וקטור שיורית. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות. decant ה-PBS ולהשעות מחדש את הגלולה התא במדיום תרבות התא T בריכוז של 0.5 x 106 תאים/mL.</li>
	<li>לפצל את התאים T לשתי תרבויות, מיועד ליום 5 ויום 9. ספירת T תאים על ידי זרימה cy, לנסות באמצעות חרוזי ספירה (טבלה של חומרים) ו נוגדנים חד שבטיים כדי CD4 ו CD8 האדם, כמו גם לצבוע את הכדאיות (טבלת חומרים).<ol>
<li>כדי למדוד ריכוז תא T, להכין תמהיל הורים המכיל 500 μL של PBS, 5 μL של חרוזים ספירה, 10 μL של 7-אמינו-אקטינומיצין D הכדאיות הפתרון, 4 μL של CD4-FITC ו-4 μL של CD8-APC. הוסף 40 μL של תאים T לתמהיל הראשי ולמדוד את הריכוז התא על ידי הזרמת cy, מבוסס על מספר תאים T לחיות/ספירות חרוז. להאכיל מחדש כדי לשמור על התרבויות בריכוז של 0.5 x 106 תאים/mL בכל יום אחר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביום 5, לספור והקפאה היום 5 תרבויות כמתואר בשלבים 1.3 ו 1.5.</li>
	<li>ביום 7, לשטוף 0.5 x 106 תאים T ב PBS ו-resuspend ב 100 μl של מיון תא המופעל על ידי הזריחה (facs) מאגר. לזהות ביטוי חלבון פני השטח של המכונית על ידי כתמים חיסוני עם מבCAR19-מצומנת אנטי-בעלת מעלה-מעלה-מעלה-מעלה ידי זרימה cy, לנסות.</li>
	<li>ביום 9, לספור יום 9 תרבויות ו cryopreserve כמתואר בשלב 1.3.</li>
</ol>2. הערכה פנוטימית של בידול תא T
<ol><li>להכין תערובת הורים המכילים נוגדנים pre-titrated עבור anti-CD3 – BV605 (שיבוט OKT3), anti-CD14 – פסיפיק כחול (PB) (שיבוט HCD14), anti-CD19 – PB (שיבוט HIB19), אנטי CD4 – BV510 (שיבוט OKT4), anti-CD8 – H7APC (שיבוט SK1), anti-CCR7 – FITC 150503 ( anti-CD45RO – PE (שיבוט UCHL1), anti-CD27 – PE-Cy7 (שיבוט 1A4CD27), anti-CD95 – PerCP-Cy 5.5 (שיבוט DX2), ו-anti-CAR19-APC.</li>
	<li>להכין זריחה בודדת מינוס אחד (FMO) פקדים עבור anti-CD45RO – PE, אנטי CCR7 – FITC, anti-CD27 – PE-Cy7 ו anti-CD95 – PerCP-Cy 5.5 כדי להבחין תאים מוכתמים באופן חיובי מרקע.</li>
	<li>הכנת פתרון מכתים תא מת על ידי דילול מלאי חי/מת במלאי (טבלת חומרים) 1:10000 ב PBS.</li>
	<li>ההפשרה יום 3, יום 5, ויום 9 תאים T שהיו בעבר cryopreserved מורות. צנטריפוגה 1 x 106 תאים T מכל קבוצה ב 300 x g עבור 3 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. רחץ את התאים פעם אחת עם ה-PBS. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות ולהיפטר PBS.</li>
	<li>לערבב תאים T עם פתרון מכתים מתים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT), מוגן מפני האור.</li>
	<li>הוסף 1 מ ל של מאגר FACS כדי להרוות את הצבע התא המת מכתים. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות, למחוק את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא ב 100 μl של מאגר facs המכיל את קוקטייל הנוגדן המתואר בשלב 2.1 ו 2.2. מיכל הדגירה 1 h ב 4 ° c.</li>
	<li>הוסף 1 מ ל של מאגר FACS ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות כדי לשטוף את הנוגדן לא מאוגד. חזור על שלוש פעמים עם מאגר FACS.</li>
	<li>השהה את התאים ב-1% פאראפורמלדהיד (בכיוון הבית) ואחסן ב-4 ° c.</li>
	<li>כפי CD45RO ביטוי יורדת לאחר קיבעון, לנתח את הדגימות על ידי הזרמת cy, לאחר התניית החיסוני. להערכת בידול, שער לפי הסדר הבא: סינגמייטים (FSC-H vs FSC-A), live CD3+ T תאים (Dump [חי-מת סגול, CD14-PB ו CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). ב CD4+ ו CD8+ קבוצות מערכות, שער על CD45RO-PE VS CCR7-fitc להגדיר תאים לא תמימים כמו (CD45RO-CCR7+), Tcm (CD45RO+ CCR7+), TEM (CD45RO+CCR7-), ו-Tte (CD45RO-CCR7-). כדי לזהות את Tscm, שער בתאים CD27+ T באוכלוסיית תאי T בדומה לתמים. בתוך תא זה, Tscm הם CD95+ ו-TN הם CD95-.</li>
</ol>3. ניתוח תפקודי חוץ-גופית
<ol><li>מכונית הפצת תאי T והפרשת ציטוקין
	<ol>
<li>לאמת ביטוי רכב, כמו גם הכדאיות של התא כפי שמתואר בשלבים 1.5 ו 1.7, על ידי הזרמת cy, לנסות.</li>
		<li>לשטוף 5 x 106 בתאי T מכל קבוצה (יום 3, יום 5 ויום 9) עם PBS ולהשעות את הפתרון 1 μm של carboxyfluorמחדש את שיטת הסינכרון (cfse) ב-pbs עבור 3.5 דקות ב-RT.</li>
		<li>מייד להוסיף 10 מ ל של PBS המכיל 10% סרום של שור עוברי (FBS) כדי להרוות את התגובה.</li>
		<li>צנטריפוגה את הפתרון ב 300 x g עבור 3 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולחזור על שלב זה שלוש פעמים. לספור את התאים בסיום הצביעת CFSE באמצעות מונה קולטר (טבלת חומרים).</li>
		<li>בציר CFSE מוכתם תאים (לא מגורה), להשעות מחדש 1% בכיוון הראשון ולאחסן ב 4 ° c עבור ניתוח על ידי הזרימה cy, try.</li>
		<li>מקרין את המספר הרצוי של מכונית מוכתמת cfse-T עם הקרינה הK562-CD19 (היעד) כמו גם K562-wild סוג (שליטה) תאים ביחס של 1:1 עבור 120 h ב ציטוקינים תרבות חינם בינונית ותרבות תנאים כמתואר בשלב 1.1.</li>
		<li>לאחר 24 שעות, צנטריפוגה את כלי התרבות ב 300 x g עבור 5 דקות. לאסוף 120 μl של הסלולר supernatant. להעריך את הייצור תלויי ההפעלה של IL2, IFNγ, TNFα, GM-שדרתי, ו ציטוקינים דלקתיים אחרים (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8, ו IL10) על ידי מנתח לומיקס בהתאם להמלצות של היצרן.</li>
		<li>החלף את עוצמת הקול של סופרנטאנט שנאסף בשלב 3.1.7 עם אמצעי אחסון שווה ערך (120 μL) של מדיום טרי.</li>
		<li>ביום 3 (כלומר, לאחר 96 h), לספור ולהאכיל מחדש בריכוז של 0.5 x 106 תאים/mL באמצעות מבוססי חרוז הזרימה cy, לנסות כמו בעבר בשלב 1.5.</li>
		<li>ביום 5, לספור את התאים live CD3+ ולחשב את שינוי הקיפול של תאי t לחיות ביחס לספירת התאים החיים t ביום 0.</li>
		<li>בצע ניתוח מקיף של דילול CFSE בחלוקת תאי T רכב באמצעות תוכנת FlowJo כדי להדגיש סיבובים רצופים של החטיבה התא. הערה: מספר ההפצה מתואר היטב במדריך FlowJo.</li>
	</ol></li>
	<li>שיטת רעילות התא הערה: היכולת של תאים CART19 להרוג את תאי היעד ביטוי CD19 מוערך באמצעות 51Cr שחרור שחרורו.<ol>
<li>סמן את תאי היעד על ידי ערבוב 5 x 105 K562-CD19, K562-פראי בקרת סוג תאים, או NALM6 תאים לוקמיה עם 50 μl של Na251קרו4 ו 0.5 ML של RPMI שיושלם עם 10% fbs עבור 90 מינימום בחממה ב 37 ° c.</li>
		<li>בתאי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 2.5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט רדיואקטיבי בפחי סילוק המתאים ולשטוף את תאי היעד ב 5 מ ל של PBS. חזור על השלבים פעמיים.</li>
		<li>השהה מחדש את תאי היעד ב-פנול בינונית ללא אדום המכילה 5% FBS. השתמש במדיום זה להמשך ההליך כדי להקטין את הרקע.</li>
		<li>לאחר הערכת ביטוי רכב והכדאיות של התאים על-ידי שילוב cy, כמתואר בסעיף 5.1), מערבבים תאים T רכב עם תוויות היעד בתאי ב-אפקטור: היעד (E:T) היחס של 10:1, 3:1 ו 1:1, בטרילקאט. . העבר ללוחית התחתונה של 96</li>
		<li>במקביל, לכלול תאי יעד בלבד, ואת היעד תאים עם 1% נתרן dodecyl סולפט (SDS), כדי לקבוע ספונטנית (S) ומקסימום (M) 51Cr שחרור, בהתאמה.</li>
		<li>בתאי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ו-דגירה עבור 4 h או 20 שעות בחממה 37 ° c עם 5% CO2.</li>
		<li>לאחר הזמן המיועד, צנטריפוגה את כלי התרבות ב 300 x g עבור 5 דקות. לאסוף 35 μl של supernatant הסלולר ולהעביר לוחית הקורא. להימנע בועות. . תנו לצלחת להתייבש בן לילה</li>
		<li>לאטום את הצלחת עם חותם לוחית סטנדרטי ולספור עם מונה של נוזל נוזלי. שפע כרום ב-supernatant מספק פרוקסי של רצח תא היעד. חשב את אחוז הליזה הספציפית כדלקמן: 100 x (ספירות לדקה [cpm] שחרור ניסיוני – cpm S שחרור)/(cpm שחרור – cpm S שחרור).</li>
	</ol></li>
</ol>4. באנליזה פונקציונלית Vivo
<ol><li>להשיג 6 על 10-שבוע בן נוד-scid γc–/– (nsg) עכברים, אשר חסר מערכת חיסונית אדפטיבית, ולהקצות אותם לטיפול/בקרת הקבוצה באופן אקראי.</li>
	<li>הכנס בעלי חיים באמצעות וריד הזנב עם 1 x 106 NALM6 תאים ב 0.1 mL מעוקר PBS.</li>
	<li>לאחר 5-7 ימים, אשר בתאום הגידול על ידי הדמיה ביולומינסנציה (בלי). הכנס 150 מ"ג/ק"ג של D-לluciferin לעכברים אשר כבר מורדם עם isof, הכרך תלוי במסת הגוף).</li>
	<li>מדידת ערכים ביולומינציה באמצעות מערכת הדמיה. לכמת שטף הכולל באמצעות התוכנה המתאימה על ידי ציור מלבנים של אזור זהה סביב עכברים, להגיע מראש אל 50% של אורך הזנב. הפחת את הרקע עבור כל תמונה בנפרד.</li>
	<li>לאחר יצירת לוקמיה, להזריק 3 x 106 יום 9 CART19 תאים, 0.5 x 106 יום 3 מכונית T תאים, או המקביל לא התמרה (ntd) האדם תאים t באמצעות וריד הזנב בנפח של 100 μl של PBS וסטרילי/Ca2 +. הערה: כפעילות ביולוגית של תאים שנקטפו במרווחי זמן שונים במהלך תהליך התרבות הוא שונה, הריכוז הנבחר של יום 3 תאים נמוך יותר מיום 9.</li>
	<li>כדי לקבוע התקדמות מחלות, למדוד את ערכי biלומינסנציה פעמיים בשבוע כמתואר לעיל בשלב 4.3.</li>
	<li>כדי לקבוע מכונית תא T בתאום, לאסוף 75 μL דם דרך דימום מסלולית רטרו בתוך צינור EDTA-מצופה. העברת 50 μL של דם לצינורות ספירת מוחלטים.</li>
	<li>הכתם דם עם נוגדנים נגד CD45, CD4, CD8 ומכונית עבור 30 דקות ב RT. הוסף 400 μL של הפתרון הכולל של 1x FACS לצינורות ומערבולת ביסודיות. לאחר צביעת, לנתח ביטוי סמן פני השטח על ידי הזרמת cy, לנסות. הערה: סמנים פני השטח האחרים יכולים לשמש כדי להעריך את מצב הבידול והתשישות של תאי T בדם.</li>
	<li>כדי למדוד רמות ציטוקינים בדם, דם צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 30 דקות ב 4 ° צלזיוס כדי להפריד סרום מהשכבה העליונה של דם.</li>
	<li>לאסוף סרום למדוד את ציטוקינים עם לוחית הקורא המיועד על פי הוראות היצרן.</li>
</ol>

<ol><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73(2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139(2015).</li>
<li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li>
<li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li>
<li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+%28CTLs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8%2B+T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8%2B+T+cells+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8%2B+effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671(2016).</li>
<li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן אנו מתארים גישות למדוד את הפונקציה ואת היעילות של תאי T רכב שנקטפו במרווחי זמן שונים ברחבי התרבות vivo ex. השיטות שלנו מספקות תובנה מקיפה לתוך בחני שנועדה להעריך את הקיבולת ההתרבות, כמו גם את התפקוד של אפקטור בתוך מבחנה. אנו מתארים כיצד למדוד פעילות תא T המכונית בעקבות גירוי דרך המכונית ופרטים מבע מודלים של לוקמיה באמצעות מכונית T תאים שנקטפו ביום 3 לעומת יום 9 של שלב ההתרחבות לוגריתמי שלהם.
ישנם אתגרים הטבועות בהשוואת היעילות של מכונית T התאים שנקטפו בזמן נקודות שונות במהלך הרחבת vivo ex....

הקולטנים אנטיגן הצ (מכוניות) לספק גישה מבטיחה לנתב מחדש את תאי T נגד אנטיגנים הגידול ברורים. מכוניות הם קולטנים סינתטיים כי לאגד מטרה אנטיגן. בעוד הרכב המדויק שלהם הוא משתנה, מכוניות מכילות בדרך כלל 3 תחומים שונים. תחום החילוץ מורה כריכת אנטיגן היעד הוא מורכב בדרך כלל קטע נוגדן שרשרת אחת המקושרת למכונית באמצעות ציר מסחטות. התחום השני, הנגזר בדרך כלל משרשרת CD3ζ של קולטן תא T (TCR) מורכב, מקדמת הפעלת תא T לאחר האירוסין רכב. תחום מגירוי שלישי כלול כדי לשפר את תפקוד התא T, העפילה, חילוף החומרים והתמדה. ההצלחה של המכונית טיפול בתאי T ב ממאירות המטפאות שונים כולל B לוקמיה לימפובלסטית חריפה (כל), לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) ומיאלומה נפוצה מדגיש את ההבטחה הטיפולית של גישה זו1,2,3,4,5,6. המזון והתרופות האחרונות (FDA) אישורים עבור שתי CD19-ספציפיים מכונית T טיפולים, tisagenlecleucel עבור ילדים ובוגרים צעירים ALL ו-axicabtagene עבור לימפומה מפוזר תא B גדול, מחזקת את הכשרון הטרנסלאליות של טיפול בתאי T מכונית.
שיטות T מבוססות מכונית כרוכות בבידוד של תאי T מ דם היקפי, הפעלה, שינוי גנטי, והרחבת ex vivo. בידול הוא פרמטר חשוב הוויסות מכונית T יעילות תאים. בהתאם לכך, הגבלת בידול תא T במהלך התרבות vivo ex מגביר את היכולת של המוצר המוחדרת כדי חרט, להרחיב, ולהמשיך, מתן מעקב לטווח ארוך החיסונית בעקבות העברה המאמצת2,7,8,9. תאי t מורכבים ממספר קבוצות מערכות ברורות כולל: תאי T תמימים (Tn), זיכרון מרכזי (Tcm), זיכרון אפקטור (Tem), אפקטור הבדיל (Tte) וזיכרון תא גזע (Tscm). אפקטור הבדיל תאים T יש יכולת cytolytic חזקה; עם זאת, הם קצרים חיו והוא חרט גרוע10,11,12. לעומת זאת, תאים t עם הפנוטיפ פחות הבדיל כולל תאי T תמים ו Tcm התערוכה מעולה בתיאום ויכולות ההתרבות בעקבות העברת התא המאמצת13,14,15,16,17,18. הרכב של תאי T שנאספו במוצר שיוצרו מראש יכול להשתנות ברחבי החולים והתואם את הפוטנציאל התרפויטי של מכונית T. היחס של תאי T עם הimmunophenotype נאיבי כמו המוצר המתחיל apheresis הוא מתאם מאוד עם השני והתגובה הקלינית של התשובה19.
משך התרבות הוא פרמטר חשוב המשפיע על בידול בתאי T רכב מוכן העברה המאמצת. פיתחנו לאחרונה גישה כדי ליצור באיכות מעולה בתאי T מכונית באמצעות פרדיגמה תרבות מקוצרת20. באמצעות הגישה שלנו, הראנו כי תרבות מוגבלת מעניקה העלייה לתאי T רכב עם פונקציה מעולה אפקטור והתמדה בעקבות העברה המאמצת במודלים מבע של לוקמיה. כאן, אנו מציגים את הגישות לייצר באופן אמין CART19 תאים (בתאי T אוטוולוגיים הנדסה כדי לבטא anti-CD19 scfv מצורף CD3ζ ו 4-1bb התחומים איתות) וכוללים תיאור מפורט של בחני כי לספק תובנה לתוך מכונית ביולוגי T ויעילות לפני העברה המאמצת.

<table><tbody><tr><td>אנטי CD3 / CD28 dynabeads</td><td>תרמו פישר</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>APC עכבר אנטי אנושי CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555369</td><td>RRID:AB_398595</td></tr><tr><td>APC-H7 עכבר אנטי אנושי CD8 נוגדן</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>RRID:AB_1645481</td></tr><tr><td>BD FACS Lysing Solution 10X תרכיז</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount צינורות ספירה מוחלטת</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 אנטי אנושי CD4 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>317444</td><td>RRID:AB_2561866</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 אנטי אנושי CD3 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>317322</td><td>RRID:AB_2561911</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Life Technolohgies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting,</td> <td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>FITC אנטי אנושי CD197 (CCR7) נוגדן</td><td>BD Pharmingen</td><td>561271</td><td>RRID:AB_10561679</td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי-אנושי CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555346</td><td>RRID:AB_395751</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Human AB סרום</td><td>עמק ביו-רפואי</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 IS, Miltenyi בדרגת פרימיום</td><td></td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>28030-081</td><td></td></tr><tr><td>מונה נצנוץ נוזלי, MicroBeta trilux</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr>LIVE / DEAD <td>בדיקות מולקולריות</td><td>סגולות לתיקון</td><td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Coulter Counter</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na251CrO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030S001MC</td><td></td></tr><tr><td>Pacific נוגדן CD14 כחול אנטי אנושי</td><td>BioLegend</td><td>325616</td><td>RRID:AB_830689</td></tr><tr><td>פסיפיק כחול אנטי אנושי CD19 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>302223</td><td></td></tr><tr><td>PE אנטי אנושי CD45RO נוגדן BD</td><td>Biosciences</td><td>555493</td><td>RRID:AB_395884</td></tr><tr><td>PE/Cy5 אנטי-אנושי CD95 (Fas) נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>305610</td><td>RRID:AB_493652</td></tr><tr><td>PE/Cy7 אנטי-אנושי CD27 נוגדן בקמן</td><td> Coulter</td><td>A54823</td><td></td></tr><tr><td>פנול בינוני נטול אדום</td><td>Gibco</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SDS Solution, 10%</td> <td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Via-Probe</td><td>BD Biosciences</td><td>555815</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Gibco</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin - K+ מלח</td><td>פרקין אלמר</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) t תאים לטיפול חיסוני המאמצת

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

חיסוני המאמצת מחזיקה הבטחה לטיפול בסרטן ומחלות זיהומיות. אנו מתארים גישה פשוטה לשנות את התאים הראשוניים של האדם הראשי עם קולטן אנטיגן צ'יאריק (רכב) ולהרחיב את הצאצאים שלהם לשעבר vivo. אנו כוללים בחני למדוד ביטוי רכב, כמו גם בידול, קיבולת ההתרבות ופעילות cytolytic. אנו מתארים בחני למדוד את הייצור cy, ציטוקין והפרשת ציטוקין דלקתיים בתאי T רכב. הגישה שלנו מספקת שיטה אמינה ומקיפה לתאי T מכונית התרבות עבור מודלים פרה-קליניים של טיפול חיסוני המאמצת.

באמצעות השיטות המתוארות לעיל, אנו ממריצים והרחיבו תאי T עבור 3 או 9 ימים (איור 1א, ב). כמו כן ניתחנו את פרופיל הבידול שלהם, כפי שמצוין על-ידי אסטרטגיית האיתור המתוארים באיור 1C, על ידי מדידת השפע של גליקורופונים ברורים המתבטאת במשטח התא. אנו מראים שינוי פרוגרסיבי לקראת הבידול בידול לאורך זמן במהלך תרבות vivo לשעבר (איור 1ד). העריכו את הפונקציה האפקטור וקיבולת ההתרבות של תא T רכב בתג...

אנו מתארים גישה מהימנה ליצור הקולטן אנטיגן הצ (רכב) T תאים ולבדוק בידול שלהם ותפקוד מבחנה בvivo.

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating מוצר CAR T Cell עם יכולת תפקודית כי תחריט, להתרבות ויש לו פעילות cit-el-uric בעקבות עירוי הוא מרכיב מרכזי של אימונותרפיה מאמצת יעילה. לדוגמה, בגידולים מוצקים, תאי CAR T הם יכולים לחדור גידולים מוצקים והם מקבלים גירוי אנטיגן אופטימלי;עם זאת, ההחרטה הכוללת שלהם ואת התפשטות הוא מכשולים באנשים. היתרון העיקרי של גישה זו היא כי זה יכול לשמור על איכות תאי CAR T או מצב ההבחנה של תאי CAR T מבלי ליצור תאי T מובחנים סופניים או מותשים, אשר היה פחת יכולת התפשטות או תפקוד יעיל ירוד בעקבות עירוי.טכניקה זו יכולה להיות קשה כי תאי T רגישים מאוד לריכוז התאים שלהם או לאזור הפנים של כלי הדם שבהם הם מתורבתים. כמו גם הצרכים המטבוליים שלהם. בעיקרו של דבר תאי T צריכים להישמר מאושרים לאורך כל התהליך, אחרת הם לא יגדלו.כדי להתחיל בהליך זה, להגדיר 6 גם מנות תרבות. הפעל תאי T אנושיים ראשוניים טריים או שמורים בהקפאה על-ידי ערבובם עם חרוזים מגנטיים נגד CD3 CD28, ביחס של שלושה חרוזים לתא T בארות של מנות התרבות. תרבות תאי T ב X-Vivo 15 בינוני בתוספת סרום AB אנושי רגיל, L-גלוטמין, he-pees ו IL2.הפעל את תאי T בריכוז של מיליון תאי T למיליליטר במהלך ההתפשטות. ולתרבת אותם ב 37 מעלות צלזיוס עם 20% חמצן, 5% פחמן דו חמצני ו 95% לחות. לאחר גירוי לילה, להוסיף lentiviral על טבעי לתאי T מופעל.לחשב את נפח supernatants הדרושים כדי להשיג ריבוי של זיהום בין שלוש לחמש. המשך culturing התאים באמצעות אותם תנאים. ביום השלישי, לאסוף aliquot נציג של התאים של שימור קריו.לפני שימור קריו, להסיר את חרוזים מגנטיים על ידי צינורות בעדינות והפרדה מגנטית. הכן את אמצעי ההקפאה, המכיל PBS עם 0.5%DMSO. ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.לאחר מכן, צנטריפוגה תאי T ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והוסף חמישה מיליליטר של PBS. צנטריפוגה התאים שוב ב 300 פעמים G במשך חמש דקות ולהשליך את PBS.אנחנו להשעות את pellant במיליליטר אחד של מדיום קריו שימור קר. להקפיא את תאי T במיכל הקפאה מקורר. ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.לאחר מכן, להעביר את התאים הקפואים לחנקן נוזלי. לשטוף את שאר תאי T פעם בחמישה מיליליטר של PBS כדי לחסל כל וקטור שיורית. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות.לאחר מכן, decant PBS ולהשעות מחדש את פלנט התא במדיום תרבות תא T בריכוז של 500, 000 תאים למיליליטר. לפצל את תאי T לשתי תרבויות שתוכננו 45 ותשע. לספור את תאי T על ידי ציטומטריה זרימה באמצעות חרוזים ספירה ונוגדנים חד שבטיים ל CD4 ו- CD8 אנושי.כמו גם צבע הכדאיות. הזינו מחדש את התרבויות כל יומיים כדי לשמור עליהן בריכוז של 500,000 תאים למיליליטר. ביום החמישי, לספור קריו לשמר את היום חמש תרבויות כפי שתואר קודם לכן.ביום השביעי, לשטוף 500, 000 תאים ב PBS. ולהשעות אותם מחדש ב-100 מיקרוליטרים של מאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. לאחר מכן, לזהות ביטוי חלבון משטח CAR על ידי אימונו מכתים עם אנטי CAR 19 idio-סוג פלואורסצנטי על ידי ציטומטריה זרימה.ביום התשיעי ספירה והקפאה לשמר את היום תשע תרבויות כפי שתואר קודם לכן. במחקר זה נמדדים הפונקציה והיעילות של תאי CAR T שנקטפים במרווחים משתנים לאורך תרבות X-Vivo. באמצעות השיטות המתוארות בסרטון זה, תאי T מגורים ומורחבים במשך שלושה או תשעה ימים.פרופיל בידול התאים כפי שצוין על ידי אסטרטגיית gating המוצגת כאן, מנותח על ידי מדידת השפע של גליקופרוטאינים ברורים לידי ביטוי על פני התא. שינוי הדרגתי לכיוון ההתברמות של האפקטים נראה לאורך זמן במהלך תרבות X-Vivo. פונקציית המחולל ויכולת השגשוג של תאי CAR T בתגובה לאנטיגן מוערכת לאחר מכן.תאים המורחבים פחות עדיפים מבחינה תפקודית על אלה המתורגם בהרחבה לאורך זמן ארוך יותר. במודל עכבר קסנוגרפט אנושי של כל העוצמה של תאי CAR T שנקטפו בתקופות זמן שונות מושווה. תאי תשעת הימים מראים תגובה אנטי לוקמית תלוית מינון עם תגובה מלאה בשווי מינון גבוה של שלושה מיליון;ואובדן יעילות עבור המינון הנמוך של 500, 000.עם זאת, היום שלושה תאים הראו שליטה מתמדת גידול במינונים גבוהים ונמוכים. תגובה זו קשורה לספירה המוחלטת של CAR-T 19 בדם ההיקפי של עכברים. בסך הכל, תוצאות אלה מספקות ראיות כי תאי T CAR שנקטפו קודם לכן, ביצועים טובים יותר אלה שנקטפו מאוחר יותר.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות פונקציה נוספות כגון בדיקות סוסון ים כדי למדוד את המאפיינים המטבוליים שלהם כגון צריכת חמצן או קיבולת ספיר-it-ed. מספר סבבים של גירוי מחדש יכולים להתבצע גם כדי לספק תובנה על ההתמדה שלהם וההתמדה של תאי CAR T. באמצעות עבודה זו כבסיס אנו וחוקרים אחרים עוסקים במחקרים כדי לקצר את תהליך התרבות עוד יותר.זה יכול גם להיות מורחב בעיצוב גישות הליבה עבור אנטיגנים סרטן אחרים. טיפול תמיד צריך להילקח כאשר אתה עובד עם lentivirus. אבל גם כאשר lentivirus מתוכנן להיות שכפול פסול.

manufacturing-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells-for-adoptive

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מדגים טכניקה לייצור קולטן אנטיגן כימרי (CAR) תאי T ex vivo. תאי T אנושיים מודגרים בחרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD3 ונגד CD28, יחד עם מדיום בתוספת אינטרלוקין-2 (IL-2), המוביל להפעלה ושגשוג של תאי T. מוצגים וקטורים לנטי-ויראליים טרנסגניים, המאפשרים לרנ"א המהונדס להשתלב בגנום המארח ולבטא את הטרנסגן. התוצאה היא שתאי T המומרים מבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) על פני השטח שלהם. תאי T נקצרים בנקודות זמן מוגדרות כדי להעריך ביטוי CAR ושימור בהקפאה.

טכניקת Ex Vivo לייצור תאי T קולטני אנטיגן כימריים

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת תאי T מסוג קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לגידול (CAR). וקטורים רטרו-ויראליים הנושאים RNA מהונדס מעורבבים עם תאי טחול בתווך בתוספת אינטרלוקין-2 כדי לקדם הישרדות ושגשוג של תאי T. לאחר מכן התערובת מועברת לצלחת המצופה במקטעי פיברונקטין אנושיים רקומביננטיים וצנטריפוגה כדי להקל על איחוי הנגיף עם התא, מה שמאפשר לרנ"א להשתלב בגנום המארח ולייצר מכוניות הקשורות לפני השטח המכוונות לאנטיגן הגידול.

טכניקת Ex Vivo ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ספציפיים לגידול

אנו מתארים כמותית בזמן אמת במערכת החשיבה של הפריה חוץ גופית כדי להעריך את העוצמה של מערכת הקולטן אנטיגן כימאריק תאי T מיקוד תאי הגידול נוזלי ומוצק. פרוטוקול זה ניתן להרחיב כדי להעריך תאים אחרים החיסון החיסונית, כמו גם טיפולים משולבים.

שיטת העוצמה בזמן אמת עבור שצ אנטיגן קולטן התאים T המיקוד תאים מוצק המטולוגי סרטן

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לעריכת גנים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas לשינוי תאי CAR-T.

ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי

מאמר זה מפרט את תהליך הייצור של תאי T קולטני אנטיגן כימריים לשימוש קליני, במיוחד באמצעות מעבד תאים אוטומטי המסוגל לבצע התמרה נגיפית וטיפוח של תאי T. אנו מספקים המלצות ומתארים מלכודות שיש לקחת בחשבון במהלך תהליך הפיתוח והיישום של ניסוי קליני בשלב מוקדם.

ייצור תאי T של קולטן אנטיגן כימרי על מעבד תאים אוטומטי

פרוטוקול זה מייעל את הייצור הווקטורי הרטרו-ויראלי ואת התמרת תאי T מורין, ומאפשר ייצור יעיל של תאי CAR-T בעכבר.

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה ליצירה ובדיקה של תאי T רגולטוריים של קולטני אנטיגן כימריים אנושיים (CAR Tregs).

יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים (CAR) באמצעות mRNA לא משולב לאימונותרפיה לסרטן ומספק שיטות אמינות להערכת תאי CAR-T ותפקודם ציטוטוקסי.

גישה לא ויראלית ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים באמצעות mRNA לאימונותרפיה לסרטן

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת טיפות תחליב כפולות המכילות תא T אחד ותא מטרה סרטני כדי לבחון הרג תאים ברמת התא הבודד. שיטה זו מאפשרת כימות כפול הן של מולקולות ציטוטוקסיות והן של אפופטוזיס של תאי מטרה בתוך אוכלוסייה גדולה של תאי T.

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

פרוטוקול זה מתאר את השלבים החיוניים לגידול תאי T ראשוניים, כולל בידדם, הפעלה, התרחבותם וטרנספקציה חולפת באמצעות אלקטרופורציה של mRNA. בנוסף, מוצע תהליך עבודה ופאנל נוגדנים לניתוח ציטומטרי זרימה של פנוטיפ, סמני הפעלה, כדאיות וביטוי קולטני אנטיגן כימרי (CAR).

בידוד, טיפוח והעברה חולפת של תאי T ראשוניים אנושיים ליצירת תאי T של קולטני אנטיגן כימריים (CAR)

למד לייצר תאי T מונעי CAR תפקודיים לטיפול חיסוני מאמץ. השיטה שומרת על איכות התאים ומונעת התמדמדות, ומאפשרת שרידות ופעילות אפקטיבית לאחר השתלה בגוף.

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת

גלה סרטונים נוספים