Name: שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: למדו להכין רקמות קפואות לשביט להערכת נזק ל-DNA. השיטה מפשטת לוגיסטיקה, מאפשרת העברת דגימות למעבדות מרוחקות וממזערת שגיאות טכניות בניתוח רקמות מקוביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים אסירי תודה ללינקולן מרטין וקלי אוונס לסיוע טכני מומחה בהכנת שקופיות שביט והבקיע ד ר קרול שוורץ לביצוע ניתוחים סטטיסטיים. המחברים מכירים גם את התרומות התומכות של חברי הטוקסיקולוגיה הגנטית, החקירתית ותוכניות הנקרופסי ב-ILS.

רקמות נקצרו במהלך התנהלות המחקרים שבוצעו במתקני AAALAC-מוסמך במעבדות החוזה NTP בהתאם לתקנות המעבדה הטובה לתרגול (21 CFR Part 58) ולהשתמש בפרוטוקולים בעלי חיים שאושרו על ידי החיה המוסדית הוועדה טיפול ושימוש (IACUC) בכל מעבדה.
1. הקציר ועיבוד רקמות
הערה: זה שימושי להכין צינורות לדוגמה כפולים (למשל, כבד) או להעביר כמחצית של מדגם לצינור אחסון אחר (למשל, התריסריון, הבטן) כדי לאפשר ניתוח מחדש, במידת הצורך. כדי למזער את השונות הפוטנציאלית לדוגמה לדוגמאות לרקמות מערכת העיכול, מומלץ לקחת טיפול כדי לדגום את אותו אזור של רקמה ביחס לקיבה עבור כל חיה, ומדגם להיות מחולק ליצירת דגימות כפולות. מלקחיים פלסטיק מומלצים להעברת רקמות דביקות כגון מוח. כאופציה, בשר טחון, שפשוף או מולגניים ההכנות רקמות ניתן לסנן כדי להשיג הומוגנית תא יחיד השעיות באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר המצורפת צינור חרוט.
<ol><li>הסר את כל הרקמה, האיברים והפסולת המחוברים מאברים מעניינים. מיד לאחר ההסרה, מוהים את האיבר במרץ בסירה שוקלים בגודל בינוני המכיל ~ 7 מ ל של הצטננות קר++ טרי מוכן פתרון מלח, 10% v/v dmso, ו20 מ"מ edta pH 7.5) כדי להסיר דם שיורית פסולת.</li>
	<li>העבר כל איבר לסירת שקילה נקייה אחרת המכילה מספיק (~ 7 mL) פתרון מינורי קר כדי לשמור על הרקמה שקוע, על קרח, עד לעיבוד נוסף.</li>
	<li>הסר מקטע של כל אחד מאברי העניין והציבו אותו בקלטת הטבעה. תקן בתוך 10% פורמאלין מאגור נייטרלי, לקצץ, ו פרפין להטביע על פי הנהלים הסטנדרטיים של המעבדה להערכת העתיד העתידי האפשרי.</li>
	<li>עבור הכבד, לחתוך קטע האורך 5 מ"מ של האונה השמאלית ומסושת בעדינות ב-~ 7 מ ל של פתרון מינוב קר. מניחים את רצועת הרקמה לתוך הסירה נקי בגודל בינוני שוקל המכיל ~ 7 מ ל של פתרון קריר קר ולשמור על הקרח עד מוכן לעבד עוד (שלב 1.8 או 1.11).</li>
	<li>עבור התריסריון, לחתוך חלק 10 מ"מ של התריסריון האבובית לבטן. שימוש a 21 – 25 גרם מחט, סומק להסיר פסולת וחיידקים.
	<ol>
<li>הכנס את המחט לקצה אחד של התריסריון ואת הסומק עם 1 מ ל של פתרון מינוב קר.</li>
		<li>ריקון הכיוון השני על-ידי היפוך התריסריון שוב ושוב עם 1 מ ל של פתרון מחדש. להיפטר המחט.</li>
		<li>פורסים את התריסריון פתוח ולשטוף אותו ב ~ 7 מ ל של פתרון לפני לשים אותו לתוך סירת שקילה בינונית בגודל המכיל ~ 7 מ ל של פתרון נקי מיותר; לשמור על הקרח עד מוכנים לעבד עוד (שלב 1.8 או 1.11).</li>
	</ol></li>
	<li>עבור המוח, זה עשוי להיות שימושי לחלק תחילה את המוח לשתי אונות; כמחצית אחת ניתן לשמור עבור histopathology אפשרי (ראה שלב 1.2).
	<ol>
<li>לנתח את אזור המוח (עם) של עניין ומסושת בעדינות ב-~ 7 מ ל של פתרון מינוב קר.</li>
		<li>העברת רקמות (s) לסירה נקיה בגודל בינוני המכיל ~ 7 מ ל של פתרון מועט קר ולשמור על הקרח עד מוכן לתהליך נוסף (שלב 1.8 או 1.11; שים לב כי אזורים קטנים כגון המוח הקטן וההיפוקמפוס עשויים לא לדרוש קיצוץ נוסף).</li>
	</ol></li>
	<li>לבטן
	<ol>
<li>להסיר ולמחוק את היער. לחתוך לפתוח את הבטן בלוטות ולשטוף חינם מהאוכל באמצעות ~ 7 מ ל של מאגר מינורי קר בסירה שקילה בינונית.</li>
		<li>הסר רצועה של 5 מ"מ של בטן הבלוטות האבובית לתריסריון עבור קיבעון אפשרי הערכה histopathology (ראה שלב 1.2).</li>
		<li>מניחים את הבטן הנותרת ל ~ 7 מ ל של מאגר מינורי קר בסירת שקילה בינונית בגודל ומודטה על הקרח במשך 15 – 30 דקות. הערה: ייתכן ששלב הדגירה הזה אינו הכרחי; שלב זה נכלל בפרוטוקול האימות של הג, אך אינו מוזכר במבחן ה-OECD מנחה8,9.</li>
		<li>העבר את הקיבה לחתיכת מנקה של פרפין (או צלחת פטרי או סירה שוקלת) ובעדינות לגרד את האפיתל פני השטח פעמיים או יותר באמצעות להב אזמל או המגרד polyארבאואפן (מצופה) להסיר פסולת. להרים את רירית הקיבה עם מלקחיים ולשטוף עם 1 מ ל של מאגר מינורי קר באמצעות pipet. להעביר את רקמת הקיבה למשטח נקי או צלחת.</li>
		<li>בזהירות לגרד את האפיתל הקיבה 4 – 5 פעמים (יותר, אם יש צורך) בפתרון מינורי (בדרך כלל 250 μL/עכבר או 500-1000 μL/עכברוש) עם הגב של להב אזמל או מגרד לשחרר את התאים. באופן אופציונלי, לשטוף את הרקמה עם נפח שווה בקירוב של פתרון מינורי כדי לשחזר תאים נוספים. לאסוף את הפתרון הכולל המכיל תאים שפורסמו באמצעות pipet ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה על הקרח.</li>
	</ol></li>
	<li>לקבלת דגימות רקמה מבית הקירור, חותכים סעיף 3 – 4 מ"מ של רקמת הכבד או המוח או ~ 5 מ"מ של התריסריון והעברת תווית 1.5 או 2.0 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת המכיל 1 מ ל של פתרון מינוגה קר. המאדות במהירות (≤ 30 s) עם מספריים מינ, עד דק התפזרו, תוך שמירה על המדגם קר. המדגם צריך להיראות מעט מעונן; עם זאת, מקובל שחלק מהחלקים יישארו מתפשרים בתחתית הצינורית.</li>
	<li>כדי להשתמש ברקמה טרי, לשמור על צינורות המכילים רקמה טחון או תאים אפיתל שפשוף על הקרח; השתמשו ברקמה כדי להכין שקופיות של שביט בתוך כ 1 h של קציר (המתואר בסעיף 2).</li>
	<li>על הקפאת דגימות הרקמה, מיד לאחר מקור או אוסף של תאים אפיתל מגורד
	<ol>
<li>אבטחו את מכסה הצינור והצינור הנפתח לתוך בקבוקון מלחמתי המכיל חנקן נוזלי; צינורות עשויים להישמר חנקן נוזלי למשך נקרופסי (≤ 3 h).</li>
		<li>לאחזר צינורות באמצעות מצקת ומקום על קרח יבש למיין. העברת צינורות לתוך המקפיא על קרח יבש ותיבת החנות במקפיא-80 ° c.</li>
	</ol></li>
	<li>להכנת קוביות קפואות של רקמה, חותכים כמה חתיכות קטנות של רקמה (≤ 4 מ"מ בקוטר ~ 6 מ"מ באורך; איור 1).
	<ol>
<li>שחרר אותם בנפרד ישירות לתוך סירת שקילה בינונית או כלי מתאים אחרים המכילים חנקן נוזלי.</li>
		<li>המתן כמה שניות לחתיכות כדי להקפיא לחלוטין ולהעביר קוביות רקמה קפואה בודדים לצינור מיקרוצנטריפוגה בתווית או קריוצינור מתוחזק על קרח יבש; אל תאפשר לחלקים להתאחד במהלך תהליך ההקפאה.</li>
		<li>העברת צינורות לתוך המקפיא על קרח יבש ותיבת החנות במקפיא-80 ° c.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת שקופיות
<ol><li>
לרקמת בשר טחון
	<ol>
<li>שמרו על צינורות המכילים רקמות טריות על קרח רטוב.</li>
		<li>מניחים צינורות של רקמה קפואה לתוך הטמפרטורה בחדר אמבט מים עד הדגימות מופשרים לחלוטין, תוך הקפדה שהם נשמרים קר. מיד להעביר את הצינורות על הקרח.</li>
		<li>מיד לפני הנסיגה תאים עבור העברה agarose (שלב 2.3), לערבב כל תא השעיה בעדינות; עבור דגימות שאינן מסוננות, אפשר לגושים גדולים להתיישב בתחתית הצינורית. לשמור על כל הצינורות על הקרח עד שקופיות הוכנו עבור כל הדגימות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לקוביות רקמה
	<ol>
<li>לאחזר צינורות המכילים קוביות רקמה ממקפיא 80 ° c ולשמור על קרח יבש עד הכנת השקופיות.</li>
		<li>מחלק 1 mL של בינונית של הסוחר (0.14 M היאl, 1.47 mM KH2PO4, 2.7 mm Kcl, 8.1 mm Na2Hpo4, 10 מ"מ naedta, pH 7.4) או מיניגה פתרון לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה המסומנים בשנת mL עבור כל מדגם ולשמור על קרח.</li>
		<li>עובד במהירות כדי למנוע את הרקמה הרקמות, למקם קוביית של רקמה לתוך הקצה הפתוח של מכשיר מהפך רקמת טמפרטורת חדר (איור 1). ניתן להשתמש בחלקים מרובים ברקמות; במידת הצורך, ניתן לגזור את הרקמה הקפואה או לחדור לחלקים קטנים יותר באמצעות מרגמה קרה ומכתש כדי להקטין את גודל הקוביה כדי להשתלב במכשיר.</li>
		<li>במהירות להוסיף מזרק גודל בהתאמה לתוך המכשיר כדי לדחוף את הרקמה לקצה שינוי שצריך להציב לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל פתרון מהיר קר; להימנע מאלץ את הנוזל לגלוש בשפופרת. לטבול את קצה הרשת של המכשיר עבור כ 5-10 בפתרון קריר קר כדי לאפשר את הרקמה להפשיר לחלוטין.</li>
		<li>לדכא לחלוטין את הבוכנה עד התאים נראים הבלטת ממד דרך נקבוביות רשת. לאחר מכן משוך את הבוכנה למעלה כ 2.5 ס מ ולחץ שוב לחלוטין; חזור על התהליך מספר פעמים עד שהפתרון הזמני הופך להיות מבולבל.</li>
		<li>במקרה הצורך, המדגם עשוי להיות מרוכז כדי להגדיל את צפיפות התא על ידי צנטריפוגה בקירור עבור 5 דקות ב 1100 סל ד והסרה של חלק supernatant.</li>
		<li>חזור על התהליך עבור כל הדגימות באמצעות מכשיר ניקוי רקמות נקי עבור כל דוגמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>העבר 50 μL של השעיית התא לצינור המכיל 450 μL של 0.5% נקודת התכה נמוכה agarose ב-37 ° c. הערה: ניתן לכוונן אמצעי אחסון, אך כמות האגבה צריכה להיות ≤ 1%.</li>
	<li>להכין ולהבקיע שקופיות כמתואר בעבר10,11.</li>
</ol>

<ol><li>van der Leede, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+and+data+interpretation+of+the+in+vivo+comet+assay+in+pharmaceutical+industry%3A+EFPIA+survey+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).</li>
<li>ICH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Conference+on+Harmonisation+of+Technical+Requirements+for+Registration+of+Pharmaceuticals+for+Human+Use+%28ICH%29+S2%28R1%29%3A+Guidance+on+Genotoxicity+Testing+and+Data+Interpretation+for+Pharmaceuticals+Intended+for+Human+Use%5BTitle%5D)+AND+%22ICH%22%5BJournal%5D)">International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use.</a> ICH. , (2012).</li>
<li>EFSA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+opinion+on+genotoxicity+testing+strategies+applicable+to+food+and+feed+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment.</a> EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).</li>
<li>Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%2C+DNA+damage%2C+DNA+repair+and+cytotoxicity%3A+hedgehogs+are+not+always+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead.</a> Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).</li>
<li>Guerard, M., Marchand, C., Plappert-Helbig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+experimental+conditions+on+data+variability+in+the+liver+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Influence of experimental conditions on data variability in the liver comet assay.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (2), 114-121 (2014).</li>
<li>Jackson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+freezing+tissues+and+cells+for+analysis+of+DNA+strand+break+levels+by+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay.</a> Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).</li>
<li>Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Comet+assay+dose-response+for+ethyl+methanesulfonate+using+freshly+prepared+versus+cryopreserved+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).</li>
<li>Uno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JaCVAM-organized+international+validation+study+of+the+in+vivo+rodent+alkaline+comet+assay+for+detection+of+genotoxic+carcinogens%3A+II.+Summary+of+definitive+validation+study+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OECD+Guideline+for+the+Testing+of+Chemicals%3A+In+Vivo+Mammalian+Alkaline+Comet+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22OECD%22%5BJournal%5D)">OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay.</a> OECD. 489, (2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+evaluation+of+six+chemicals+of+known+genotoxic+potential+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).</li>
<li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Alkaline+Comet+Assay+and+Enzyme-modified+Alkaline+Comet+Assay+for+Measuring+DNA+Strand+Breaks+and+Oxidative+DNA+Damage+in+Rat+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 53833(2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+of+styrene-acrylonitrile+trimer+in+brain%2C+liver%2C+and+blood+cells+of+weanling+F344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+the+flavonol+anti-oxidants%2C+alpha-glycosyl+isoquercitrin+and+isoquercitrin%2C+for+genotoxic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential.</a> Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).</li>
<li>Pant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vehicle+and+positive+control+values+from+the+in+vivo+rodent+comet+assay+and+biomonitoring+studies+using+human+lymphocytes%3A+historical+database+and+influence+of+technical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).</li>
</ol>

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית מחקר הפנים של NIH, המכון הלאומי למדעי הסביבה בריאות (בע) תחת חוזה HHSN273201300009C; עם זאת, ההצהרות, הדעות או המסקנות הכלולות בו אינן מייצגות בהכרח את ההצהרות, הדעות או המסקנות של המדינות המאוחדות, או של הממשלה.

כפי שמתואר בעבר7,12,13, מטופלים כראוי פלאש קפוא ברקמות בשר טחון מספק תוצאות טובות שיטת שביט. למעשה, בסיסית% הזנב ערכי ה-DNA עבור עכברוש קצוץ וכבד העכבר המוכן במעבדה שלנו הם בדרך כלל ≤ 6%, כפי שמומלץ על-ידי מבחן ה-OECD מנחה9 עבור טרי דגימות הכבד עכברוש טחון. תוצאות טובות הושגו על ידי מעבדות מרובות באמצעות מגוון סוגי רקמות כי כבר כתוש ואוחסנו קפוא; באופן דומה, פלאש קפוא תאים אפיתל מגורד מאיברים במערכת העיכו...

שיטת השביט משמשת יותר ויותר כאמצעי להערכת נזקי DNA בתאים מתורבתים ורקמות חשופים לכימיקלים או לחצים סביבתיים אחרים1. האפשרות הניתנת לזיהוי הפסקות דנ א כפולות ויחיד, נגעים אלקלי-לבנה, ומעברי-גדיל בודדים הקשורים לתיקון DNA לא שלם. המועצה הבינלאומית להרמוניה של דרישות טכניות עבור תרופות לשימוש האדם (העליונה) מנחה עבור בדיקות התרופות ממליץ על הצירוף DNA שבירה כגון שיטת השביט כמבחן השני כדי להשלים את הטיפול מכרסם מיקרוקליאוס מיקרו להערכת vivo גנורעילות וכמבחן מעקב להערכת מצב של פעולה באברי היעדשל אינדוקציה גידול הרשות האירופית לבטיחות מזון (EFSA) ממליצה על שיטת שביט vivo כמבחן המשך המעקב המתאים לחקירת הרלוונטיות של תוצאה חיובית במבחן הרעילות של מבחנה3. ב-2014 אושרה מבחן ה-OECD לצורך הבחינה של כוכב השביט המכרסמים, ובכך הגבירה את יכולת ההתמדה לשימוש בבדיקות רגולטוריות של פוטנציאל הגנוטוקסיס. המנה מבוססת על הפרדה אלקטרופיניטית של לולאות DNA רגוע ושברי העוברים מתוך נוקלאונואידים של תאים ליטיים. ביסודו של דבר, תאים בודדים מוטבעים agarose כי כבר שכבתית על שקופיות מיקרוסקופ. שקופיות לאחר מכן שקוע במאגר הליזה ואחריו בסיסי (pH > 13) פתרון, אשר מאפשר את ה-DNA הגרעינית היטב מתפתל להירגע ולהירגע. שקופיות ממוקמות לאחר מכן בשדה חשמלי, אשר מעורר הגירה של דנ א טעונה שלילית לקראת האנדה, יצירת תמונות הדומות לשביט; הכמות היחסית של ה-DNA בזנב השביט בהשוואה לראש כוכב השביט הוא פרופורציונלי באופן ישיר כמות של נזק DNA; תוכן ה-DNA בזנב הוא בדרך כלל בכמת באמצעות תוכנת דימות דיגיטלי.
בגלל שיטת השביט מזהה דנ א מפוצל, כימות מדויק של הנזק לחשיפה DNA המושרה יכול להיות מבולבל על ידי פיצול כרומטין הקשורים נמק או אפופטוזיס הנובע הטיפול המושרה ציטוזה או מתח. יתר על כן, נזק DNA יכול להתרחש כתוצאה של הטיה מכני או עיבוד לדוגמה לא תקין4. החשיבות של שמירה על רקמות שנקטפו מקורר לפני הכנת שקופית כדי למזער את רמת בסיסית של נזק DNA הפגינו בעבר5,6. מעבדות רבות מכינות שביט מתוך רקמה טרייה; עם זאת, הדבר יכול להיות מאתגר לוגיאני כאשר מכינים שקופיות מסוגי רקמות מרובים לכל בעל חיים במחקר עם מספר רב של בעלי חיים. כמו-כן, מדובר בבעיה כאשר ההכנה והניתוח של השקופיות מתרחשות במעבדה מרוחקת, הדורשת משלוח של דגימות. לדוגמה, תוכנית הטוקסיקולוגיה הלאומית של ארצות הברית כוללת את שיטת השביט כרכיב של תוכנית הרעלים הגנטית שלה בדיקה (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) ולפעמים משלבת את הערך לתוך 28 או 90 יום לימודי הרעילות במינון; זה מחייבת אוסף של רקמות על ידי המעבדה בחיים והעברת דגימות למעבדה אחרת לניתוח. כדי להשיג את זה, חתיכות רקמה הם כתוש, ו/או תאים אפיתל של מערכת העיכול הם מגורד ושתלים סלולריים הם פלאש קפואים ומאוחסנים במקפיא עבור המשלוח הבאים ואחסון על ידי המעבדה המקבלת עד ניתוח7. טיפול נאות של דגימות חיוני להשגת נתונים באיכות גבוהה באמצעות רקמה קפואה; עם זאת, מניפולציה בלתי משתנה של דגימות רקמה במהלך נקרוזים שבוצעו על ידי אנשים שמשתנים אי פעם קשה לשלוט, במיוחד במעבדות בחיים כי לא באופן שגרתי הקציר רקמות עבור שביט השביט. רענון האימון של צוות נמק או שימוש ביחידה ניידת מאויש על ידי אנשי מעבדה מנוסים כדי לאסוף דגימות רקמות טריות או קפואות הוא לעתים קרובות יקר מדי, לא ריאלי, או פשוט חסר ערך.
כדי להבטיח בצורה טובה יותר את הדור העקבי של דגימות רקמה באיכות גבוהה עבור העברה לאתר מרוחק עבור ניתוח שביט כוכב, השירות של שיטה שפורסמה6 של שימור רקמות מפני קוביות פלאש קפוא של רקמות נחקרו. בשיטה זו, קוביות קפוא של רקמות נטענים לתוך מכשיר מיקרו של רקמת נירוסטה (איור 1) הממוקם לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל מאגר קר. הקוביה של רקמות הוא דחף לאחר מכן דרך מד קטן שינוי בסוף המכשיר. שוב ושוב השעיית רקמות דרך מסננת שינוי בשני הכיוונים מספר פעמים גורמת השעיית תא אחיד בודד יחסית. דגימות שהוכנו על ידי שיטה זו בהשוואה לטובה באיכות לדגימות רקמות טריות וקפואות שהוכנו על ידי מינויה. כתוספת תועלת, בניגוד דגימות בשר טחון, קוביות רקמה ניתן לאחסן קפוא לפרקי זמן ממושך ועדיין להניב תוצאות באיכות גבוהה בתוך שביט השביט.

<table><tbody><tr><td>Cryovials</td><td>Corning Costar</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>יריעות שעווה דנטלית</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72670</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח (טחינה) מספריים מיקרו</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-953-1B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק</td><td>Gibco</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Teknova</td><td>P0315-10</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>נקודת התכה נמוכה Agarose</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה (1.7 מ"ל)</td><td>Corning</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Na2 HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Buffered Formalin</td><td>Leica</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>מזרק בוכנה (1 מ"ל)</td><td>Fisher Scientific or Vitality Medical</td><td>14-826-88; 8881901014</td><td>Becton Dickinson או מזרק טוברקולין Monoject</td></tr><tr><td>מכשיר לטחינת רקמות</td><td>NorGenoTech (אוסלו, נורבגיה)</td><td>לא</td><td>נצפתה שונות קטנה בקוטר שיכולה להשפיע על חיבוק הבוכנה.</td></tr><tr><td>פינצטה, פלסטיק</td><td>סחר רוחות ישירות</td><td></td><td>DF8088N ניילון מחוזק, לא סטרילי, קצה קהה, ניתן לחיטוי;</td></tr><tr><td>tradewindsdirect.com לשקול סירות</td><td>Krackler Scientific/Heathrow Scientific</td><td>6290-14251B</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

הטיפול שביט הוא צובר פופולריות כאמצעי להערכת נזק DNA בתאים מתורבתים ורקמות, במיוחד בעקבות חשיפה כימיקלים או שלחצים סביבתיים אחרים. השימוש שיטת שביט בבדיקת הרגולציה של פוטנציאל גנומיק של מכרסמים כבר מונע על ידי אימוץ של ארגון לשיתוף פעולה כלכלי ופיתוח (ה-OECD) בדיקת מנחה ב 2014. שקופיות של שביט מכינים בדרך כלל מרקמה טרייה בזמן נקרופסי; עם זאת, דוגמאות לרקמות מקפיא יכולות להימנע מאתגרים לוגיסטיים הקשורים להכנה בו של שקופיות מאיברים מרובים לכל בעל חיים ומבעלי חיים רבים ללימוד. ההקפאה גם מאפשרת דגימות משלוח ממתקן החשיפה למעבדה שונה לניתוח, ואחסון של רקמה קפואה מאפשר מאוד החלטה ליצור נתונים נזק DNA עבור איבר נתון. שיטת השביט האלקליין היא שימושית לזיהוי חשיפה של דנ א כפול ומעברי-גדיל בודדים, נגעים אלקלי-לבנה, והפסקות שלמות הקשורות לתיקון כריתה DNA לא מלאה. עם זאת, נזק לדנ א יכול לנבוע גם מהטיה מכנית או הליכי עיבוד לדוגמה פסולים, הקמת תוצאות הטיפול. שינוי באוסף ועיבוד של דגימות רקמות במהלך נקרוזים עלול להיות קשה לשלוט בשל העובדים מעבדה ברמות שונות של ניסיון בקצירת רקמות עבור שביט השביט. שיפור עקביות באמצעות הדרכה מרענן או הפריסה של יחידות ניידות מאויש עם אנשי מעבדה מנוסים הוא יקר ולא תמיד יכול להיות אפשרי. כדי לייעל את הדור העקבי של דגימות באיכות גבוהה עבור ניתוח שביט כוכב, שיטה עבור הומוגניזציה קוביות פלאש קפוא של רקמות באמצעות מכשיר מותאם אישית רקמת העור הוערך. דגימות שהוכנו לצורך שביט בשיטת השביט על ידי שיטה זו בהשוואה לטובה באיכות לדוגמיות של רקמות טריות וקפואות שהוכנו על-ידי מינויה במהלך נקרופסי. יתר על כן, נזק DNA בסיסית נמוכה נמדד בתאים מקוביות קפואות של רקמות לאחר אחסון ממושך.

מחקר 1 הכבד נקצרו משני גדודים של עכברושים גבריים מנוהלים בשמן תירס במשך 4 ימים, התנודדו בשבוע אחד. השקופיות היו מוכנות מרקמות טריות, מרקמות קפואות ומוקפאות, ורקמת העור הקפואה המעובדת בתמיסה המדיום של הסוחר או בשימוש במכשיר הרקמות. רקמות קפואות שהתקבלו מבעלי חיים מן הקבוצה הראשונה הוערכו לאחר אחסון המקפיא עבור ~ 3.5 חודשים. רקמות קפואות שהתקבלו מבעלי חיים מן הקבוצה השנייה הוערכו לאחר האחסון עבור ~ 6 חודשים. כוכבי שביט מציג את המאפיין "קיפוד" המבנה, מעיד על תאים פגומים בכבדות (של אטיולוגיה בלתי ודאות שע...

פרוטוקול זה מתאר מספר הליכים להכנת דגימות רקמה באיכות גבוהה קפואה בזמן נקרוזה לשימוש במערכת שביט להעריך נזק DNA: 1) רקמות טחון, 2) מגורד תאים אפיתל ממערכת העיכול, ו 3) לקוביות רקמה דגימות, הדורשות הומוגון באמצעות מכשיר משתמש ברקמה.

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

פרוטוקול זה משמעותי משום שהשימוש ברקמה קפואה מפשט את הלוגיסטיקה בעת הערכת רקמות מרובות, מאפשר העברת דגימות למעבדה מרוחקת לצורך ניתוח ומאפשר דחיית החלטה לנתח רקמה במשך חודשים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהשימוש ברקמת קובייה קפואה אינו דורש כוח אדם מאומן בבדיקת שביט בנמק, וממזער את ההזדמנות לטעויות טכניות ונזקי DNA מכניים שהוכנסו במהלך מניפולציה מדגם. טכניקה זו יש יישום בפיתוח תרופות פרה קליניות, הערכת הבטיחות של כימיקלים הנכנסים לסביבה, ותוספי מזון.ניתן להשתמש ברקמות קפואות בבדיקת שביט כדי להעריך פוטנציאל גנוטוקסי, תיקון דנ"א, השפעות מגן מפני נזקי דנ"א הנגרמים על ידי כימותרפיה או הקרנות, ולניטור ביולוגי סביבתי. באופן אידיאלי, ניסויים צריכים להיות מתוכננים כדי לאפשר עיבוד של כל דגימת רקמה לשלב ההקפאה לפני איברים שנקטפו מן החיה הבאה להיות זמין לעיבוד. ניתן לתבוע רקמות קפואות בבדיקת שביט כדי להעריך את הפוטנציאל הגנוטוקסי, תיקון DNA, השפעות מגן מפני נזקי DNA הנגרמים על ידי כימותרפיה או הקרנות, ועל ניטור ביולוגי סביבתי.המאמנת הטכנית קרול בוביט, ומנהלת המעבדה לטוקסיקולוגיה החוקרת איילין גילאס, תכהן היום בתור פרוקטורים. עמיתת המחקר לינקולן מרטין, וטכנאית ההיסטרולוגיה אמלי לאדסור יפגינו טיפול לדוגמה. כדי להתחיל בהליך זה, הסר את כל הרקמות, האיברים והפסולת המחוברים מאיבר מעניין.מיד להניף את האיבר במרץ בסירת שקילה בגודל בינוני המכילה כשבעה מיליליטר של פתרון טחון קר, מוכן טרי כדי להסיר שאריות דם ופסולת. מעבירים את האיבר לסירת שקילה נקייה אחרת המכילה פתרון טחון קר מספיק כדי לשמור על הרקמה שקועה ולשמור אותה על הקרח עד לעיבוד נוסף. עבור הכבד, לחתוך קטע אורך חמישה מילימטר של האונה השמאלית בעדינות swish בערך שבעה מיליליטר של פתרון טחון קר.לאחר מכן מניחים את רצועת הרקמה לתוך סירת משקל בינונית נקייה המכילה כשבעה מיליליטר של פתרון טחון קר ולשמור על קרח עד מוכן לעבד עוד יותר. מוציאים חלק מהכבד ומ מניחים אותו בקלטת הטבעה. בצע תיקון, גיזום והטבעת פרפין בהתאם לנהלים הסטנדרטיים במעבדה להערכת היסטופתולוגיה עתידית אפשרית.עבור התריסום, לחתוך חלק 10 מילימטר של התריסום proximal לקיבה. הכנס מחט מד 21 כדי 25 בקצה אחד של התריסום לשטוף אותו עם מיליליטר אחד של פתרון טחון קר כדי להסיר את כל פסולת וחיידקים. להפוך את התריסום מעל, לשטוף אותו שוב עם עוד מיליליטר אחד של פתרון טחון להשליך את המחט.פורסים את התריסום ושטיפתו בשבעה מיליליטר של פתרון טחון. לאחר מכן לשטוף את התריסום שוב ולשמור אותו פתרון טחון על קרח עד מוכן לעבד עוד יותר. חותכים ומתקן חלק מהתריסריון הנותר להערכת היסטופתולוגיה עתידית אפשרית כפי שתואר קודם לכן עבור הכבד.עבור המוח, זה עשוי להיות שימושי תחילה לחלק את המוח לשתי המיספרות, עם חצי כדור אחד נשמר עבור היסטופתולוגיה אפשרית. לנתח את אזורי המוח של עניין, ולאחר מכן בעדינות לשטוף אותם, ולשמור על קרח בת פתרון טחון עד מוכן לעבד עוד יותר, כפי שתואר קודם לכן עבור הכבד ואת התריסום. עבור הקיבה, להסיר ולהשליך את forestomach.חותכים את הבטן הבלוטות, ולשטוף אותו ללא מזון על ידי swishing אותו בסירת שקילה בגודל בינוני המכיל כ 7 מיליליטר של חיץ טחון קר. הסר רצועה של חמישה מילימטר של קיבה הבלוטות proximal לתריסריון לקיבעון להערכת היסטופתולוגיה אפשרית כמתואר קודם לכן. מניחים את הבטן הנותרת לתוך סירת שקילה בגודל בינוני המכילה כשבעה מיליליטר של חיץ טחון קר דגירה על קרח במשך 15 עד 30 דקות.לאחר מכן, להעביר את הבטן לחתיכה נקייה של פרפין ולהשתמש להב אזמל או מגרד תא פלסטיק בעדינות לגרד את האפיתל פני השטח לפחות פעמיים כדי להסיר פסולת. להרים את רירית הקיבה עם מלקחים ולהשתמש פיפטה לשטוף אותו עם מיליליטר אחד של חיץ טחון קר. מעבירים את רקמת הקיבה שטוף למשטח נקי או צלחת ומוסיפים פתרון טחון קר.השתמש בחלק האחורי של להב אזמל או מגרד תא פלסטיק כדי לגרד בזהירות את אפיתל הקיבה ארבע עד חמש פעמים כדי לשחרר את התאים. לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי לאסוף את פתרון טחון המכיל את התאים ששוחררו, ולהעביר אותו צינור microcentrifuge על קרח. לדגימות רקמה טחון, לחתוך קטע של כבד, מוח, או התריסום ולהעביר אותו צינור microcentrifuge שכותרתו המכיל מיליליטר אחד של פתרון טחון קר.השתמש מספריים טחון כדי לטחון במהירות את המדגם עד שהוא סוף סוף התפזר, תוך הבטחת כי המדגם נשאר קר. המדגם אמור להיראות מעונן מעט. עם זאת, זה נפוץ עבור חלקים מסוימים להישאר כי יתיישב לתחתית הצינור.כדי להשתמש ברקמה בזמן שהיא טרייה, לשמור על הצינורות המכילים את הדגימות על הקרח. כדי להקפיא את דגימות הרקמה, לאבטח את המכסה של הצינור מיד לאחר טחון או איסוף ולשחרר את הצינור לתוך בקבוק Dewar המכיל חנקן נוזלי. בסיום קציר הרקמות, השתמשו במחבת כדי לאחזר את צינורות הדגימה, וה מניחים אותם על קרח יבש למיון.מעבירים את הצינורות לקופסת מקפיא על קרח יבש ומאחסנים את הקופסה במקפיא במינוס 80 מעלות. כדי להכין קוביות קפואות של רקמה, לחתוך כמה חתיכות קטנות של רקמה בנפרד להפיל אותם ישירות לתוך סירת שקילה בגודל בינוני או כלי מתאים אחר המכיל חנקן נוזלי במשך כמה שניות. לאחר שהחתיכות קפאו לחלוטין, מעבירים את קוביות הרקמה הקפואה בנפרד לצינורות מיקרוצנטריפוגה מסומנים, או לצינורות קריו, על קרח יבש.בסיום קציר הרקמות, מעבירים את הצינורות לקופסת מקפיא על קרח יבש ומאחסנים את הקופסה במקפיא במינוס 800 מעלות צלזיוס. בעת שימוש ברקמה טרייה טחון או שרוט מתוחזק על קרח רטוב, להכין מגלשות שביט בתוך שעה של הקציר. בעת שימוש ברקמה טחון או מגרד קפוא, מניחים צינורות של רקמה קפואה באמבט מים בטמפרטורת החדר עד שהדגימות מופשרות לחלוטין תוך הבטחה שהן נשמרות קרות.ברגע שהדגימות מופשרות, מיד מעבירים את הצינורות לקרח. עבור רקמת קוביות, לאחזר את הצינורות המכילים את הקוביות מהמקפיא ולשמור על קרח יבש עד הכנת החלקה. Aliquot מיליליטר אחד של מדיום הסוחר או פתרון טחון לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה שכותרתו 1.7 מיליליטר עבור כל מדגם ולשמור על קרח.עובדים במהירות כדי למנוע הפשרה, מניחים קוביית רקמה בקצה הפתוח של מכשיר טחון רקמת טמפרטורת החדר. הכנס במהירות בוכנה מזרק תואם גודל לתוך המכשיר כדי לדחוף את הרקמה לתוך קצה רשת, אשר לאחר מכן צריך להיות ממוקם לתוך צינור microcentrifuge המכיל את פתרון טחון קר. לטבול את הקצה רשת של המכשיר במשך כ 5 עד 10 שניות בתווית טחון קר כדי לאפשר את הרקמה להפשיר לחלוטין.מדכא לחלוטין את הבוכנה עד שתאים נראים בולטים דרך נקבוביות רשת. ואז למשוך את הבוכנה עד כ 2.5 ס"מ ולחץ למטה שוב לחלוטין. חזור מספר פעמים, עד פתרון הטחון הופך לעכור.כדי להכין שקופיות, מערבבים מתלה תא בעדינות, ומעבירים 50 מיקרוליטרים לצינור המכיל 450 מיקרוליטרים של 0.5% נקודת התכה נמוכה התעוררה ב 37 מעלות צלזיוס. הכן והבקיע את השקופיות כמפורט בפרוטוקול הטקסט. במחקר הראשון, הכבד נקצר משתי קבוצות של חולדות בקרת רכב זכר ספראג דאולי התנדנד על ידי שבוע אחד.שקופיות הוכנו מרקמות טחון טרי, רקמה טחון קפוא, ורקמות קוביות קפואות. מאז ה-OECD המליץ על הגבול העליון עבור אחוז DNA הזנב בכבד חולדה טרי הוא 6%התוצאות האלה מראות כי כל אחת משיטות ההקפאה יכול לעבוד היטב להערכת רקמות. בסך הכל, אחוז הקיפודים מקביל לדנ"א של אחוז הזנב, אם כי רקמות קפואות הציגו שונות רבה יותר.במחקר השני, עכברי B6C3F1 נקבה נוהלו רכב או אתיל מתנסולפונט mutagen. תוצאות הדנ"א של הזנב מצביעות על כך שרקמת הכבד קפאה כקוביות ולאחר מכן מעובדת באמצעות מכשיר טחון הרקמות הניבה תוצאות דומות מאוד לאלה שהושגו עבור רקמה טחון טרי. עלייה מובהקת סטטיסטית בנזק לדנ"א המושרה על ידי EMS נמדדה בדגימות רקמה המעובדות על ידי כל שלוש השיטות.במחקר השלישי, דגימות כבד שנאספו עכברים B6C3F1 נקבה במחקר רעילות כימית 90 יום נותחו. נזקי הדנ"א ברקמה הטחון הקפואה היו גבוהים בכל קבוצות המינון, עם שונות משמעותית בין בעלי חיים לבעלי חיים. תוצאות הדנ"א של הזנב התאימות לאחוז הקיפודים, מה שמצביע על כך שהקיפודים תרמו באופן משמעותי לרמה הגבוהה של נזק לדנ"א שנצפה בדגימות אלה.לעומת זאת, הן DNA פגום ואחוז קיפודים היו נמוכים מאוד ברקמת קוביות קפוא פלאש שהוכן במקביל לדגימות רקמה טחונות. לכן, התאים הפגועים מאוד שהתבטאו בקיפודים בדגימות הרקמה הטחונות לא היו בבירור תוצאה של תהליך ביולוגי, אך ככל הנראה הוכנסו על ידי הפרעה מכנית, ו, או התחממות רקמות במהלך הליך הטחון לפני הבזק קפוא. לכן, הנתונים עבור רקמה טחון נחשבו לא אמינים.לשם השוואה, נתונים באיכות גבוהה התקבלו מרקמה קוביית קפואה, גם לאחר אחסון ממושך. זה קריטי כדי לשמור על רקמות שנקטפו קר לח, ולעבוד במהירות כדי להקפיא את הדגימות. כמו כן, רקמת קוביה קפואה צריכה להיות מופשרת מיד לפני שלב הומוגניזציה.דגימות רקמה קפואה מתאימות ליישומים אחרים במורד הזרם, כולל למשל, שינויים בהערכת שביט כדי לזהות נזק חמצוני או הצלבה, והערכת שינויים בביטוי גנים. יש לנקוט זהירות בעת טיפול בלהבי אזמל כדי לחתוך או לגרד רקמות, וכאשר מטפלים בחנקן נוזלי במהלך תהליך ההקפאה.

use-frozen-tissue-comet-assay-for-evaluation-dna

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

הסרטון מדגים את בדיקת השביט לאיתור נזק לדנ"א בעקבות חשיפה לחומרים מזיקים. בתנאים בסיסיים, הדנ"א משתחרר ומתפרק, ועם אלקטרופורזה, הדנ"א שלא ניזוק וניזוק נודד באופן שונה בג'ל האגרוז, ויוצר מבנה בצורת שביט. הדנ"א הנודד לאיטו ללא נזק יוצר את ראש השביט המעגלי, בעוד שמקטעי הדנ"א הפגומים הנודדים במהירות יוצרים את זנב השביט המוארך.

בדיקת שביט לגילוי נזק לדנ"א בתאים

Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ"א.

Assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

אנו מתארים כאן פלטפורמה שמאפשרת זיהוי assay שביט של נזק לדנ"א עם תפוקה חסרת תקדים. דפוסי מכשיר תאי יונקים לmicroarray ומאפשר עיבוד מקביל של 96 דגימות. הגישה מאפשרת ניתוח של קינטיקה הנזק לדנ"א רמת בסיס, נזק לדנ"א הנגרם על ידי חשיפה ותיקון DNA.

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

assay שביט מודד הפסקות DNA, הנגרמות על ידי גורמים שונים. אם כל הגורמים (מלבד סטרס חמצונים) גורמים נזק לדנ"א נשמרים קבועים, הסכום של נזק לדנ"א הוא פרמטר עקיף טוב של סטרס חמצונים. המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש assay שביט למדידה עקיפה של סטרס חמצונים.

שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

שביט וזמינותו היא שיטה יעילה לאיתור נזק לדנ א כולל יחיד, כפול גדילי ה-DNA שובר. אנו מתארים שביט אלקליין ונייטרלי מבחני למדוד נזק לדנ א בתאים סרטניים כדי להעריך את השפעת טיפולי כימותרפיה.

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

בדיקת השביט היא אמצעי פופולרי לאיתור נזק לדנ"א. מחקר זה מתאר גישה להפעלת שקופיות בגרסאות מייצגות של בדיקת השביט. גישה זו הגדילה משמעותית את מספר הדגימות תוך הפחתת זמן הריצה של הבדיקה, מספר מניפולציות השקופיות והסיכון לפגיעה בג'לים.

גישת בדיקת שביט בתפוקה גבוהה להערכת נזק לדנ"א תאי

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לכימות ההבדל בנזק ל-DNA הנגרם על ידי מעכבים מסוג I וסוג II בתאים מוטנטיים מסוג FLT3 באמצעות יישום מבחן השביט.

בדיקת שביט לכימות נזק ל-DNA בתאי 32D המבטאים מוטציה FLT3 לאחר חשיפה למעכבי FLT3 מסוג I ו-II

ניתן להשיג נזק ממוקד ל-DNA על ידי קשירת גורם מזיק ל-DNA לאוליגונוקלאוטיד היוצר טריפלקס (TFO). באמצעות TFOs ששונו, ניתן לחקור אסוציאציות חלבון ספציפיות לנזק ל-DNA ושינוי טופולוגיית DNA בתאים אנושיים על ידי שימוש במבחני משקעים חיסוניים של כרומטין שונה ומבחני סלילת על של DNA המתוארים כאן.

כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

מאמר זה מדגים פרוטוקול מפורט DNA בידוד ובניה ספריית תפוקה גבוהה רצף מחומר עשבייה כולל חילוץ של ה-DNA בצורה יוצאת דופן באיכות ירודה.

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

למדו להכין רקמות קפואות לשביט להערכת נזק ל-DNA. השיטה מפשטת לוגיסטיקה, מאפשרת העברת דגימות למעבדות מרוחקות וממזערת שגיאות טכניות בניתוח רקמות מקוביות.

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

גלה סרטונים נוספים