זיהוי מוטציות על ידי ברזולוציה גבוהה התכה באוכלוסיית לעיבוד לקרקע של אורז

זה יהיה שימושי למדי עבור תכונות רבייה כי הם מבחינה טכנית קשה או יקר להיקבע, כגון עמידות למחלות, תוכן מינרלי. זו טכניקה די פשוטה, חסכונית ותפוקה גבוהה. כדי להתחיל, למקם ארבעה דיסקים עלה לתוך כל באר של צלחת PCR 96-well.

הוסף 50 מיליליטר של מאגר פתרון לתוך כל באר. להקפיא את הצלחת במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לנטרל את הצלחת בטמפרטורת החדר.

דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של מאגר B לכל באר, ומערבבים היטב על ידי מערבולת. צנטריפוגה הצלחת במשך דקה אחת ב 1, 500 פעמים גרם.

לאסוף את העל טבעי כמו DNA עבור PCR. ראשית, השתמש ב- DNA supernatant מתבנית PCR אחת טובה כדי לייעל את טמפרטורת החיטוי. הוסף רייגנטים ומיקרוליטר אחד של דנ"א על-טבעי לתוך כל PCR היטב.

מניחים את צינורות PCR בבלוק תרמי בעל יכולת הדרגתית, ומתאימים את תוכנית החימום לפי כתב היד כדי לקבוע את טמפרטורת ההתחסנות האופטימלית עבור כל שבר יעד. בצע אלקטרופורזה עבור מוצר PCR על 1%agarose ג'לים כדי לבדוק אמפיקונס. לקבוע את טמפרטורת חישול אופטימלית המאפשרת הגברה ספציפית של שבר היעד.

כדי לבצע ניתוח HRM, לשלב reagents, כולל microliter אחד של צבע פלואורסצנטי 10 פעמים מיקרוליטר אחד של על טבעי DNA בכל באר של לוחות תואמי HRM. בכל לוחית, יש לכלול דגימת הורות אחת מסוג פראי ושליטה שלילית אחת ללא דנ"א. מוסיפים טיפת שמן מינרלי לכל באר כדי למנוע אידוי.

לאחר מכן, לאטום את הצלחת עם סרט דבק, צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים גרם במשך דקה אחת. הפעל את PCR באמצעות טמפרטורת חישול ממוטבת. עכשיו, להסיר את סרט דבק מהצלחת, ולהכניס את הצלחת למכונת HRM.

בתוכנה, בחר הפעלה חדשה מתפריט הקובץ או לחץ על לחצן הפעל בחלק העליון של המסך. ציין את טמפרטורות ההתחלה והסיום להמסה מ-55 עד 95 מעלות צלזיוס. בחר דגימות לניתוח התכה ברזולוציה גבוהה ואל תכלול דגימות דומות לפקד השלילי.

לנרמל את עקומות ההיתוך כדי לקבל את אותה פלואורסצנטיות התחלה וסיום. באופן חזותי, ודאו כי סמני הטמפרטורה המקסימליים המינימליים הנמוכים והתחתונים נמצאים באזור של העקומות. שמור על הדלתא F, הפרש פלואורסצנטיות, רמה בהגדרת ברירת המחדל של 05.

מהרשימה בחירת תקנים, בחר את המשתנה הנפוץ לעומת ובחר את הרגישות הרגילה. בחר H12 כדי להשתמש בסוג הפראי כפקד. דגימות עם ערך דלתא F גדול מ 05 נחשבים מכילים צמח מוטנטים.

לאחר מכן, בשיטת CTAB, לחלץ DNA מכל אחד מארבעת הצמחים ממאגר המוטנטים עם עקומת ההיתוך שונה באופן משמעותי מסוג הבר. לאחר כימות באמצעות ספקטרופוטומטר, להתאים את ה-DNA עם NanoDrop 2000 לריכוז סופי של כ 25 ננוגרם למיקרוליטר. הוסף 0.4 מיקרוליטרים של פריימרים PCR לתוך דגימת ה-DNA בצינורות PCR, למקם אותם במחזור תרמי, ולהתאים את התוכנית כדי להגביר את שבר היעד.

לאחר מכן, שלח את מוצרי PCR לחברה לצורך רצף. לאחר רצף סנגר, להשוות את הנגע המולקולרי על ידי השוואת הרצפים בין הצמח M2 ואת סוג הבר. במחקר זה, סריקה וניתוח HRM של שתילים M2 עבור מוטציות בגנים OsLCT1 או SPDT הראו רוב הדגימות היו עקומות התכה לא שונה באופן משמעותי מסוג הבר עם דלתא F פחות מ 05.

המוטנטים הראו עקומות HRM שונות באופן משמעותי עם דלתא Fs גדול מ 05 בטמפרטורות של 90 עד 92 מעלות צלזיוס ו 81.5 עד 83.5 מעלות צלזיוס, בהתאמה. סוג המוטציה ומיקום על הגנים מ 4, 560 שתילים M2 אושרו על ידי כרומטוגרמות רצף. אתר הטרוזיגי עם מוטציה של G ל- A ב 4, 304 זוגות בסיס של OsLCT1 זוהה.

נוקליאוטיד אחד בודד הכנסה הופיעה ב 4, 240 זוגות בסיס של OsLCT1, ומחיקה trinucleotide TTC נצפתה בעמדה של 5, 948 כדי 5, 950 זוגות בסיס של SPDT. אני ממטב את ה-PCR לפני ניתוח HRM. הצבע בג'ל קצת מזיק.

זכור ללבוש כפפות בעת הפעלת הג'ל.