מיצוי הקורטיזול של החדקן פין ואת עצם הלסת מטריצות

השיטה שלנו מציגה מחוון מתח אלטרנטיבי חדשני שיכול להיות פלטפורמה למחקרים עתידיים רבים למדידת קורטיזול במטריסות חדשות שאינן עלילה ושיער. היתרונות של טכניקה זו הם הפשטות שלה ואת היכולת שלה לשמש כדי להעריך את רמות הלחץ אפילו בבעלי חיים שנשחטו. יצירת קשר בין רמות קורטיזול גבוהות ובעלי חיים בריאים או בני אדם באמצעות טכניקה זו יכולה לעזור עם האבחנה של מחלות מסוימות.

שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור דגימות ביולוגיות בן מאות שנים כגון מאובנים ישנים אלה כדי להעריך את רמות הלחץ בתוך תוחלת החיים מדגם. עבור מיצוי קורטיזול, לשקול 300 פלוס או מינוס 10 מיליגרם של כל מדגם בסולם אנליטי דיגיטלי עם דיוק 0.0001 לפני הצבת הדגימות לתוך צינורות חרוט בודדים 15 מיליליטר. הוסף שלושה מיליליטר של isopropanol לכל צינור מדגם ולסובב את הצינורות ב 80 סיבובים לדקה במשך 2.5 דקות כדי לשטוף את הקורטיזול ולהסיר כל זיהום חיצוני פוטנציאלי.

לאחר הכביסה האחרונה, האוויר מייבש את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שבעה ימים לפני שטיפת הדגימות שלוש פעמים נוספות כפי שהוכח באמצעות מים טהורים במיוחד טריים לכל שטיפה. לשקול 75 פלוס או מינוס חמישה מיליגרם של סנפיר מיובש או דגימת עצם הלסת ולהשתמש מקצף חרוזים סוף סוף לטחון את המדגם ב 50 הרץ במשך 32 דקות. לאחר מכן, לספק 1.5 מיליליטר של מתנול לכל צינור של אבקת סנפיר או עצם הלסת ולהניח את הדגימות על מסובב צינור ב 40 סיבובים לדקה במשך 18 שעות בטמפרטורת החדר.

לאחר מיצוי קורטיזול, מים את רקמות המדגם על ידי צנטריפוגה. ולהעביר את המיליליטר העליון של קורטיזול צהבהב, אורגני המכיל שכבה מכל מדגם לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר. יבש את דגימות הקורטיזול ב 38 מעלות צלזיוס ברדס אדים לילה כדי להתאדות את מתנול.

למחרת בבוקר, להוסיף 400 microliters של PBS לכל צינור ומערבולת צנטריפוגה הדגימות כדי לאסוף את הקורטיזול. עבור ניתוח ELISA, לטעון 25 microliters של כל דגימת קורטיזול סטנדרטית שחולצו ולשלוט כפול לתוך בארות המתאימות של צלחת ELISA 96 היטב. לטעון 25 microliters של Assay diluent לשתי בארות לשמש אפס לתוך כל באר כריכה לא ספציפית.

מערבבים 15 מיקרוליטרים של אנזים קוסם קוסם עם 24 מיליליטר של Assay diluent ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של תותבים לכל באר. מערבבים את הצלחת על מסובב במשך חמש דקות ב 500 סיבובים לדקה. ואחריו דגירה של שעה בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת ארבע פעמים עם 300 microliters של 1x לשטוף Buffer לגם. היפוך מהיר של הצלחת מעל הכיור לאחר כל שטיפה כדי להשליך את החיץ ולנפח את הצלחת על ערימה של מגבות נייר. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של פתרון מצע TMB לכל באר ומציבים את הצלחת על המסובב במשך חמש דקות ב 500 סיבובים לדקה.

לאחר הערבוב, הדגירה את הצלחת במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור. בסוף הדגירה, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של פתרון עצירה לכל באר. ומערבבים את תכולת הצלחת על המסובב במשך שלוש דקות ב 500 סיבובים לדקה או עד כל הבארות הפכו מירוק לצהוב.

לאחר מכן, לקרוא את הצפיפות האופטית של הדגימות ולהשתמש בתוכנת לוח מיקרו כדי להמיר את רמות הקורטיזול בכל מדגם picograms למיליגרם. בניתוח מייצג זה, רמות הקורטיזול נטו להיות גבוהות יותר בדגימות סנפיר שנשטפו עם isopropanol מאשר אלה שטוף מים, אבל אין הבדלים משמעותיים ברמות הקורטיזול סנפיר נצפו בין מינים חדקן. לא הייתה אינטראקציה משמעותית בין ממיסים לשטיפה לבין מיני חידקנים.

בדיקה של קורטיזול מ- H.Huso עצמות לסת כדי לקבוע אם עצמות לסת חדקן עשוי לשמש מטריצה חלופית סנפירים גילה כי ממס הכביסה לא היתה השפעה משמעותית על רמת הקורטיזול נמדד חידקן של H.Huso. יתר על כן, הנתונים חשפו דמיון גבוה בין הסנפירים של שלושה מינים חדקן נבדקו ב H.Huso עצמות לסת. חשוב להשתמש מקצף חרוזים כדי לטחון את הדגימות לתוך אבקה דקה ולהשתמש מתאים מסחרי ELISA Assay קיט למדידת קורטיזול מוצלחת.

שיטה זו יכולה לשמש גם לגילוי קורטיזול בשיניים ובמטריסות קשות אחרות, כיוון שמדידות ברמת הקורטיזול מספקות מידע חשוב על האופן שבו הסביבה משפיעה על הביולוגיה של בעלי החיים. השיטה יכולה לשמש כגישה חדשה להערכת רמות הקורטיזול בשיניים של חלב ילדים אנושיים ובהנדסת אנדוקרינולוגיה של ילדים, ביולוגיה פסיכוטית, מחקרים התנהגותיים, ארכיאולוגיים ופורנזיים.