בסיס מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז חזקה עבור כימות ציטוסינוס-גואנין-גואנין Trinucleotide גאות חוזר בצורה שברירית X פיגור-1 גן

שיטה חסכונית זו יכולה למצוא יישומים רחבים באבחון מולקולרי והקרנה של FXS והפרעות שבירות הקשורות ל- X. זה מהיר בזמן המפנה ופחות השקעה בציוד. בדיקת PCR מבוססת PCR שלנו יכולה להקל על סיווג הספקטרום המלא של FXS והפרעות הקשורות ל-X שבירות, כולל ביניים, טרום-קדם ומוטציה מלאה עם חוסן ותנאי דיווח מהירים.

ההליך יוכח על ידי וונג צ'ואה מ פרקיןאלמר סינגפור. התחל על ידי הסרת תערובת חיץ PCR, דגימת diluent, ודגימות DNA מהמקפיא 20 מעלות צלזיוס, ולהשאיר אותם בטמפרטורת החדר במשך 20 עד 30 דקות כדי להפשיר. לפני השימוש בריג'ינים, מערבולת ולסובב אותם לזמן קצר למטה.

למדוד את ריכוז דגימת ה-DNA עם ספקטרופוטומטר, ואם יש צורך, לדלל אותו ל 25 ננוגרם למיקרוליטר עם דלואנט מדגם. סמן את הבארים של לוחית PCR כדי לזהות דגימות דנ"א של חומר עזר ובדוק ולחשב את מספר התגובות הדרושות לדגימות הבדיקה, הייחוס והבקרה השלילית. הכן את התערובת הראשית של PCR על ידי שילוב של 15 מיקרוליטרים של תערובת מאגר PCR ל- 0.6 מיקרוליטרים של דילואנט לדוגמה ו- 0.4 מיקרוליטרים של פולימראז עבור כל תגובה.

מערבולת את התערובת ולסובב אותו. לאחר מכן מחלקים 18 מיקרוליטרים של התערובת לתוך כל באר. ואז פיפטה שני מיקרוליטרים של כל דנ"א לתוך באר המתאימה.

מערבבים את הרייטים על ידי צינור למעלה ולמטה חמש פעמים, ואז לאטום את הצלחת. מניחים את הצלחת בתרמוציקלר ולהפעיל את PCR על פי הוראות כתב היד. מחממים את שייקר החממה ל-65 מעלות ומוסיפים 80 מיקרוליטרים של מאגר 1X TE לכל מוצר PCR.

השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להעביר את הדגימות לצלחת ניקוי PCR ולשים את הצלחת בשייקר. הדגירה אותו ב 65 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 1200 סל"ד במשך 10 דקות. לאחר החממה, מקררים את שייקר החממה עד 25 מעלות צלזיוס, מניחים את מכשיר הוואקום ל-250 מיליבאר, ושואבים את הפתרון דרך המסנן.

לאחר 15 דקות, בארות צריך לא נשאר נוזל. כבה את הוואקום והוסף 50 מיקרוליטרים של מאגר TE 1X לכל באר. שאף את הפתרון במשך 10 דקות באמצעות הגדרות ואקום קודמות.

יבש את החלק התחתון של צלחת המסנן על ידי לחיצה עליו בחוזקה על ערימה של מגבות נייר ולאחר מכן להוסיף 20 microliters של מאגר TE 1X למרכז התחתון של כל באר. מניחים את הצלחת בשייקר ודגירה ב 25 מעלות צלזיוס תוך טלטול ב 1200 סל"ד במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, להעביר לפחות 15 microliters של מוצר PCR מטוהרים צלחת PCR טרי 96 היטב.

לפני תחילת, להביא את תרכיז צבע ה-DNA, מטריצת ג'ל DNA, סמן DNA, סולם DNA, ודגימות DNA מטוהרות לטמפרטורת החדר. הגדר את תחנת priming על ידי החלפת המזרק והתאמת לוח הבסיס, ולאחר מכן לשחרר את הידית של קליפ המזרק להחליק אותו למיקום העליון. התחל את תוכנת שינוי הגודל והכן את תערובת צבע הג'ל.

מערבולת צבע להתרכז במשך 10 שניות, ולאחר מכן לסובב אותו. לאחר מכן, מוסיפים 25 מיקרוליטרים של הצבע לבקבוקון מטריצת ג'ל ומערבולת הפתרון לערבב. מעבירים את תערובת צבע הג'ל למסנן ספין, מניחים אותו בצנטריפוגה ומסובבים אותו במשך 10 דקות לפי 1500 גרם.

כאשר מוכנים לטעון את תערובת צבע הג'ל, הכנס שבב דנ"א חדש לתחנת הפרימינג והוסף תשעה מיקרוליטרים של תערובת צבע הג'ל לתוך באר המסומנת ב- G.Close את תחנת הפרימינג וודא כי הבוכנה ממוקמת בסימן מיליליטר אחד. לחץ על בוכנה מזרק למטה עד שהוא מוחזק על ידי קליפ. המתן בדיוק 30 שניות ולאחר מכן שחרר את הסרטון.

חכה עוד חמש שניות, ואז לאט לאט למשוך את הבוכנה בחזרה לתקרת מיליליטר אחת. פתח את תחנת priming ולהוסיף תשעה microliters של תערובת צבע ג'ל לתוך הבארים המסומנים עם G.Add חמישה microliters של סמן לתוך מסומן היטב עם סמל סולם וכל אחד 12 בארות מדגם. הוסף מיקרוליטר אחד של הסולם ל באר עם סמל הסולם מיקרוליטר אחד של מוצר PCR או מים ל בארות מדגם.

מערבולת השבב לדקה אחת ב 2400 סל"ד. הכנס אותו לתוך bioanalyzer ולהפעיל את השבב בתוך חמש דקות. לאחר השלמת הפעולה, יצא את נתוני השיא כקבצי טבלת csv.

דגימת נקבה premutation מדגם נקבה מוטציה מלאה משמשים כמו דגימות התייחסות. שיא סמן עליון ותחתון כלולים בפרופיל גודל הקטע, ובדרך כלל יש שיא מורכב פריימר בכ -95 זוגות בסיסים. דוגמאות הפניה אלה משמשות לבניית עקומה סטנדרטית של רגרסיה.

העקומה הסטנדרטית של רגרסיה ליניארית משמשת לאחר מכן לחישוב גדלים חוזרים של דוגמאות לא ידועות. קליני נורמלי, ביניים, premutation, מוטציה מלאה, דגימות מוטציה מלאה פסיפס ניתן לסווג כראוי עם שיטה זו. במקרים מסוימים, רק שיא אחד מוצג בתוצאות אלקטרופורזה microfluidic, אשר ככל הנראה בשל נוכחותם של אללים הומופוביים נורמליים.

סוג אחד של תוצאה תת-אופטימלית הוא הטיה בסיסית, שיכולה להיות מעורפלת או בלתי ניתנת לפענה, והיא חשודה בכך שהיא נגרמת על ידי תקלה במכשיר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להבטיח כמות מתאימה של DNA ואיכות לפני הפעלת הפרוטוקול. ניתן לבצע רצף גנים FMR1 כדי לזהות את תבנית ההפרעה של AGG.

ואנזים הגבלה רגיש מתילציה או שינוי ביסולפיד ניתן להשתמש כדי לפקח על מצב מתילציה. זוהי טכניקה מהירה, חזקה וחסכונית. זה יסייע לחוקרים אחרים בביצוע מחקר מבוסס אוכלוסייה על מצב המוביל של FXS והפרעות הקשורות X שביר.