בידוד, העברה ותרבות של האדם הראשי המונולוציטים

הידבקות ב- HIV גורמת לתפקוד לקוי של מערכת החיסון גם אצל אנשים העוברים טיפול תרופתי ללא וירוס ניתן לגילוי. שיטה זו מאפשרת ללמוד את תפקוד המונוציטים שהם הרגולטורים העיקריים של התגובה החיסונית. אנחנו אופטימיזציה טכניקה זו לבידוד, תרבות, ו transfection של מונוציטים ראשוניים אנושיים.

אנו משתמשים בשיטה זו כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של תפקוד לקוי של מערכת החיסון אצל אנשים נגועים ב- HIV, אבל זה יכול להיות מיושם על כל מחקרים חיסוניים אחרים מעורבים מונוציטים. אם זו הפעם הראשונה שאתה עובד עם דם אנושי, זכור לעקוב אחר הפרוטוקולים biosafety הנכון ולהתייחס לכל הדגימות כחומר זיהומיות. לאחר איסוף 40 מיליליטר של דם אנושי שלם טרי בארבעה צינורות ואקום EDTA 10 מיליליטר, להשתמש בטכניקה סטרילית כדי להעביר את כל הדם לתוך צינור אחד 50 מיליליטר חרוט פרופילן ב ארון biosafety.

בהתאם להוראות היצרן מערכת בידוד מונוציטים אנושית נבחרת, מוסיפים שני מיליליטר של קוקטייל בידוד מונוציטים מהערכה לצינור הדם והמערבולת של חרוזים מגנטיים מההערכה למשך 30 שניות. מוסיפים שני מיליליטר של חרוזים לדם ולהשתמש פיפטה סרולוגית 25 מיליליטר בזהירות לערבב את חרוזים עם הדם. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לפצל את הדם באופן שווה בין ארבעה צינורות 50 מיליליטר ולהוסיף 30 מיליליטר של PBS סטרילי בתוספת EDTA מילימולר אחד לכל צינור.

מערבבים שוב עם פיפטה סרולוגית פלסטיק 25 מיליליטר וממקמים את הצינורות במחזיקים מגנטיים. לאחר 10 דקות, להשתמש פיפטה כדי לצייר את התוכן ממרכז כל צינור דואג לא לשאוב יותר ממיליליטר אחד של תאי דם אדומים ולחלק את תכולת הצינור לאחד מארבעה צינורות חדשים 50 מיליליטר. מוסיפים 500 מיקרוליטרים נוספים של חרוזי המערבולת המגנטיים לכל צינור ומערבבים בעדינות את ת פתרון התא.

מניחים את הצינורות בחזרה לתוך המחזיקים המגנטיים במשך חמש דקות לפני בזהירות העברת התוכן ממרכז כל צינור לאחד מארבעה צינורות חדשים 50 מיליליטר. כאשר כל המתלים התא הועברו, למקם כל צינור חדש 50 מיליליטר לתוך מחזיקי המגנט במשך חמש דקות לפני בזהירות העברת תוכן הצינור לתוך קבוצה שלישית של ארבעה צינורות 50 מיליליטר חדשים. ואז לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את כל ארבעת כדורי התא בסך הכל 10 מיליליטר של PBS סטרילי לספירה.

לאחר הספירה, יש להשתמש מחדש במונוציטים המבודדים במהירות של פי 10 עד התאים השישיים למיליליטר של 37 מעלות צלזיוס ללא סרום RPMI 1640 בינוני בתוספת אנטיביוטיקה וצלחת מיליליטר אחד של תאים מתווסלים לתוך 35 מילימטר צלחות בארון ביו-בטיחות. לאחר מכן מניחים את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך 30 עד 60 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק בתחתית הבאר. כדי ליצור פריים עבור מקרופאגים עם פנוטיפ דמוי M1, הוסף 100 מיקרוליטרים של סרום חזיר עוברי המכיל 25 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF לכל צלחת.

כדי ליצור פריים עבור מקרופאגים עם פנוטיפ דמוי M2, הוסף 100 מיקרוליטרים של חזיר עוברי המכילים 50 ננוגרם למיליליטר של M-CSF לכל צלחת. עבור transfection מונוציטים עם חיקויים microRNA, מעכבים, או RNA מפריע קטן, בעקבות פרוטוקול היצרן עבור ערכת transfection, לדלל את RNAs שנבחרו במאגר לריכוז סופי של 1.83 micromolar ב 10 microliters של חיקוי מדולל או מעכב לכל transfection של פעם אחת 10 לנפח התאים החמישי. כדי להכין את reagent transfection, להוסיף מיקרוליטר אחד של פולימר שסופק צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר ומיד להוסיף 90 microliters של המאגר המסופק על ידי ערכה כדי לקבל סך של 91 microliters של reagent לכל חילוף.

Vortex עוצר במשך שלוש עד חמש שניות ו pipette 90 microliters של פתרון transfection לתוך הצינור המכיל 10 microliters של RNA מדולל. לאחר ערבוב עדין, דגירה הפתרון במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני הוספת 100 microliters של קומפלקס transfection ל באר אחת של תאים. לאחר ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס, להחליף את המדיום עם שלושה מיליליטר של מדיום שלם המכיל את גורם הגדילה המתאים.

ביום השישי לתרבות, החלף את על-טבעי התרבות מתרבות M1 בשלושה מיליליטר של מדיום בתוספת סרום חזיר עוברי, אנטיביוטיקה, ליפופולסכריד ואינטרפרון גמא והחלף את העל-טבעיים מתרבויות M2 בסרום חזיר עוברי, אנטיביוטיקה, M-CSF ואינטרלוקין-4. לאחר 24 שעות של תרבות, לשטוף כל צלחת של מקרופאגים פעילים פעמיים עם PBS טרי לכל לשטוף. עבור ניתוחי RNA וחלבון, lyse התאים המצורפים ישירות הצלחות כדי לאפשר איסוף של תוכן התא ששוחרר לניתוח שלהם.

לניתוח ציטומטרי זרימה, לנתק את התאים עם שני מילימולרים EDTA ב PBS במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני בעדינות מגרד את התאים מתחתיות הלוח כדי לאפשר את האוסף שלהם לתוך 1.5 צינורות microcentrifuge מיליליטר לניתוח שלהם. כאן היסטוגרמות מייצגות של תאים המופעלים על-ידי M1 ותאים שמקורם במטופלים עם רמות גבוהות יותר של תאים המופעלים על-ידי CD80 ו- CD83 ו- M2 עם רמות גבוהות יותר של CD163 ו- CD209 בהשוואה לתאי T0 שאינם מופעלים מוצגים. מעניין, CD80 ו CD83 נראה יותר לידי ביטוי בתאים שמקורם בשליטה בהשוואה לתאים שמקורם ב- HIV.

ההשתנות של מונוציטים שנאספו טריים עם microRNA מקושקשות כמעט אינפרא אדום שכותרתו יותר מ 90% יעילות של transfection כפי שנקבע על ידי ציטומטריית זרימה מיקרוסקופיה confocal. בנוסף, transfection אינו מפחית באופן משמעותי את הכדאיות של תאים שמקורם בחולה או שליטה ללא קשר לשלב של התבגרות התא או תנאי transfection. Transfection תוצאות רגולציה יעילה של גן היעד על transfection עם RNA מפריע קטן ספציפי בשני היום הראשון והיום ארבעה לאחר הבידוד.

יתר על כן, תאים מומרים עם חיקוי microRNA להדגים עלייה של פי 48 עד 72 בביטוי microRNA על תאים לא פתורים בעוד כל פקדי transfection להראות אין שינויים ניכרים. מספר התאים המ מצופים הוא קריטי להישרדות. אנו ממליצים על מיליון תאים לכל צלחת 35 מילימטר.

ציפוי במדיום ללא סרום ישפר מאוד גם את ההחזקה של התא. תאים המתקבלים בשיטה זו יכולים להיות מטופלים עם ציטוקיני או גורמי גדילה כדי ללמוד תגובות דיפרנציאליות בחולים בעלי עניין ובקרות בריאות.