Name: מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: חקור ניתוח מחזור תאים ונזקי DNA בשיטת זרימה ציטומטריה לחקר אפופטוזיס ותיקון שבירות דו-גדיליות. השיטה מאפשרת הערכת תגובות לטיפולים אונקולוגיים ומחקר מעמיק בתחום הרדיוביולוגיה הקלינית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לצוות המתקן הרפואי של המרכז לחקר הסרטן הגרמני (DKFZ) על תמיכתם.

<ol><li>Jensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+non-small+cell+lung+cancer+with+intensity-modulated+radiation+therapy+in+combination+with+cetuximab%3A+the+NEAR+protocol+%28NCT00115518%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518).</a> BMC Cancer. 6, 122(2006).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+%28Gleevec%29%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li>
<li>Timke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor%2FPlatelet-Derived+Growth+Factor+Receptor+Inhibition+Markedly+Improves+Radiation+Tumor+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimodal+glioblastoma+treatment+consisting+of+concurrent+radiotherapy%2C+temozolomide%2C+and+the+novel+TGF-%CE%B2+receptor+I+kinase+inhibitor+LY2109761%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761.</a> Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage%2C+Aging%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA Damage, Aging, and Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).</li>
<li>Rodgers, K., McVey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-Prone+Repair+of+DNA+Double-Strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response%3A+Making+It+Safe+to+Play+with+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives.</a> Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+during+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).</li>
<li>Escribano-Díaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell+Cycle-Dependent+Regulatory+Circuit+Composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+Controls+DNA+Repair+Pathway+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice.</a> Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer%3A+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+%CE%B3H2AX+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+resistant+to+carbon+ion+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy.</a> Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035(2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645(2016).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+radiosensitizes+radioresistant+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells.</a> Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).</li>
<li>Münz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Radiation+Resistance+of+Human+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+Is+Independent+of+Their+Tissue+of+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).</li>
<li>Dean, P. N., Jett, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+DNA+distributions+derived+from+flow+microfluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry.</a> Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).</li>
<li>Fox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+computer+analysis+of+synchronous+DNA+distributions+obtained+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry.</a> Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).</li>
<li>Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+features+that+discriminate+between+foci+induced+by+high-+and+low-LET+radiation+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts.</a> Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).</li>
<li>Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+light+microscopy+shows+nanostructure+of+carbon+ion+radiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci.</a> FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).</li>
<li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li>
<li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li>
<li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161(2017).</li>
<li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).</li>
<li>Böcker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Methods+for+analysis+of+foci%3A+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Löbrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair%3A+Strengths%2C+limitations+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

השיטה הכוללת היא קלה לשימוש ומציעה מדידה מהירה, מדויקת ומתחודש של התגובה נזק DNA כולל הפסקה כפולה הגדיל (DSB) אינדוקציה ותיקון, מחזור התא אפקטים מוות תאים האפוטוטיים. השילוב של נקודות קצה אלה מספק תמונה מלאה יותר של יחסי הגומלין שלהם מאשר הפרט היחיד. השיטה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כשיקול הרעילות מקיף בתחומים של ביולוגיה קרינה, טיפול והגנה, ובאופן כללי יותר באונקולוגיה (למשל, להערכת גורמי סיכון סביבתי, הקרנת סמים והערכה גנטית אי-יציבות של תאי הגידול).
הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא קיב...

המטרה של אונקולוגיה היא להרוג או להשבית תאים סרטניים מבלי לפגוע בתאים נורמליים. טיפולים רבים או ישירות או עקיף לגרום ללחץ גנוטוקסינים בתאים סרטניים, אבל גם כמה להאריך בתאים נורמליים. כימותרפיה או תרופות ממוקדות משולבים לעתים קרובות עם הקרנות כדי לשפר את רגישות הרדיו של הגידול לקרינה,1,2,3,4,5, אשר מאפשר ירידה של את המינון הרדיואקטיבי כדי למזער את הנזק לרקמות נורמלי.
קרינה מייננת וסוכנים גנוסיים אחרים לגרום סוגים שונים של נזק לדנ א, כולל שינויי בסיס, מרובי סטרנד והפסקות יחיד או כפול סטרנד. DNA מעברי הגדיל כפול (DSBs) הם נגעים DNA החמורה ביותר האינדוקציה שלהם הוא המפתח להשפעה הריגת תאים של קרינה מייננת ותרופות ציטוסטטי שונים בכימותרפיה רדיותרפיה. Dsbs לא רק לפגוע ביושרה של הגנום, אלא גם לקדם את היווצרות של מוטציות6,7. לכן, מסלולים תיקון DSB שונים, מנגנונים לחסל תאים פגומים באופן חסר תקנה כמו אפופטוזיס פיתחו במהלך האבולוציה. התגובה הנזק DNA כולו (DDR) מוסדר על ידי רשת מורכבת של איתות מסלולים המגיעים מ-DNA זיהוי נזק ומחזור תא מעצר כדי לאפשר תיקון DNA, למות תאים מתוכנתים או הפעלה במקרה של כשל תיקון8.
שיטת הזרימה המוצגת של סייטוטומטנה פותחה כדי לחקור את ה-DDR לאחר הלחץ הגנומי באחת השיטות המקיפות שמכסה את האינדוקציה והתיקון של DSB, כמו גם תוצאות כשל בתיקון. הוא משלב את המדידה של היישום הנרחב DSB סמן γH2AX עם ניתוח של מחזור התא אינדוקציה של אפופטוזיס, באמצעות ניתוח subG1 הקלאסי והערכה ספציפית יותר של caspase-3 הפעלה.
השילוב של נקודות קצה אלה באחד מה, לא רק מפחית את הזמן, העבודה והוצאות העלות, אלא גם מאפשר מדידה ספציפית של מחזור התא של האינדוקציה והתיקון של DSB, כמו גם הפעלת caspase-3. ניתוחים כאלה לא יהיה אפשרי עם שנערך באופן עצמאי, אבל הם רלוונטיים מאוד להבנה מקיפה של התגובה נזק לדנ א לאחר הלחץ גנוטוקסיד. תרופות רבות נגד סרטן, כגון תרכובות ציטוסטטי, מכוונים נגד חלוקת תאים והיעילות שלהם תלויה מאוד בשלב מחזור התא. הזמינות של תהליכי תיקון dsb שונים תלויה גם בשלב מחזור התא ובחירת מסלול שהיא קריטית לדיוק התיקון, ובתורו קובע את גורלו של התא9,10,11, . שתיים עשרה בנוסף, מדידה ספציפית למחזור תאים של רמות DSB מדויקת יותר מניתוח במאגר, מכיוון שרמות DSB אינן תלויות רק במינון של תרכובת מגנטית או קרינה, אלא גם בתוכן הדנ א של התא.
השיטה שימש כדי להשוות את היעילות של רדיותרפיות שונות כדי להתגבר על מנגנוני ההתנגדות ב גלינובלסטומה13 ולנתח את הגומלין בין קרינה מייננת תרופות ממוקדות אוסטאוסרקומה14,15 וסרטן השרירים הטיפוסי... בנוסף, השיטה המתוארת שימש רבות כדי לנתח תופעות לוואי של רדיו-וכימותרפיה על תאי גזע mesenchymal17,18,19,20,21, 22,23,24, אשר חיוניים לתיקון של טיפול המושרה נזק רקמות נורמלי יש יישום פוטנציאלי ברפואה רגנרטיבית.

<table><tbody><tr><td>1,000 ומיקרו; L טיפים לסנן</td><td>Nerbe פלוס</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100-1,000 & מיקרו; L פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 12 מ"מ x 75 מ"מ עם מכסה מסננת תאים, 35 ומיקרו; m גודל נקבוביות רשת</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; טיפים לסנן L</td><td>Nerbe plus</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20-200 ומיקרו; L pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>מתמוסס במים ב-200 ומיקרו; גרם/מ"ל ואחסן מכסות ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 נוגדן נגד H2A.X פוספו (Ser139), RRID: AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>לדלל 1:20</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 נוגדן, AB_1727414</td><td>BD Pharmingen</td><td>560626</td><td>לדלל 1:20</td></tr><tr><td>BD FACSClean solution</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td>לשגרת ניקוי ציטומטר לאחר מדידה</td></tr><tr><td>BD FACSRinse solution</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td><td>לשגרת ניקוי ציטומטר לאחר מדידה</td></tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td><td>מתמוסס במים לריכוז פי 1</td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco עם גלוטמין יציב</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>חומר תרבית תאים שגרתי לקו התאים לדוגמה המשמש בפרוטוקול</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Excel</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior (סרום בקר עוברי)</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td><td>חומר תרבית תאים שגרתי לקו התאים לדוגמה המשמש בפרוטוקול</td></tr><tr><td>FlowJo v10 software</td><td>LLC</td><td>הזמנה</td><td></td>מקוונת</tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>הטמעת מדיום להכנה אופציונלית של שקופיות מיקרוסקופיות מדגימות מוכתמות</td></tr><tr><td>מסנני תאית מקופלים, דרגה 3hw</td><td>NeoLab</td><td>11416</td><td></td></tr><tr><td>LSRII או LSRFortessa cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>474787</td><td>תרופה אופציונלית לבקרה חיובית לאפופטוזיס</td></tr><tr><td>Multifuge 3SR+</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>הכן תמיסה של 4.5% טרי. לדלל ב-PBS על ידי חימום ל-80 מעלות; C תוך ערבוב איטי מתחת למכסה האדים. מכסים את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי למנוע אובדן חום. הניחו לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר והתאימו את עוצמת הקול הסופית. העבירו את התמיסה דרך פילטר תאית.</td></tr><tr><td>פוספו-היסטון H3 (Ser10) (D2C8) XP ארנב mAb (Alexa Fluor&reg; 555 מצומד) RRID: טכנולוגיית</td><td>איתות תאים</td> AB_10694639<td>#3475</td><td>דילול 3:200</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות, 10 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות, 25 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות, 5 מ"ל</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL (ליגנד מעורר אפופטוזיס הקשור ל-TNF שונה)</td><td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>תרופה אופציונלית לבקרה חיובית לאפופטוזיס</td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים T25</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td>חומר תרבית תאים שגרתי לקו התאים לדוגמה המשמש בפרוטוקול</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-025500</td><td>חומר תרבית תאים שגרתי לקו התאים לדוגמה המשמש בפרוטוקול</td></tr><tr><td>U87 MG תאי גליובלסטומה</td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>קו תאים לדוגמה המשמש בפרוטוקול</td></tr></tbody></table>

מחזור התא-מדידה ייחודית של γh2ax ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה cyהמטריה

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

השיטה המוצגת או גרסאות מעט שונה כבר המציאו ללמוד תגובות טיפול ספציפיות תופעות לוואי של טיפולים שונים נגד סרטן משמש אונקולוגיה קלינית. היא מאפשרת ניתוח כמותי ואורכי של התגובה נזק DNA לאחר הלחץ גנוטוקסי, כפי שנגרם על ידי הקרנות והמון תרופות נגד סרטן. השיטה מכסה את כל השלבים של תגובת ה-DNA התגובה, מתן נקודות קצה עבור אינדוקציה ותיקון של ה-DNA כפול הגדיל מעברי (DSBs), מעצר תא המעצר תא מוות על ידי אפופטוזיס במקרה של כשל בתיקון. שילוב מדידות אלה מספק מידע על השפעות הטיפול תלויי מחזור התא ובכך מאפשר מחקר מעמיק של הגומלין בין התפשטות הסלולר ומנגנוני ההתמודדות נגד נזק לדנ א. כמו ההשפעה של מtherapeutics סרטן רבים כולל סוכני כימותרפיה וקרינה מייננת מוגבל או משתנה מאוד על פי שלבים ספציפיים מחזור התא, מנתח הקורקורונים להסתמך על שיטה חזקה והומה להעריך את השפעות הטיפול ב-DNA באופן ספציפי למחזור התא. דבר זה אינו אפשרי עם בחני נקודת קצה אחת ויתרון חשוב של השיטה המוצגת. השיטה אינה מוגבלת לקו תא מסוים ונבדק ביסודיות בהמון שורות של תאים סרטניים ורקמות רגילות. זה יכול להיות מיושם באופן נרחב בתור שיטת הרעילות מקיפה בתחומים רבים של אונקולוגיה מלבד רדיו-אונקולוגיה, כולל גורם סיכון סביבתי הערכה, הקרנת סמים והערכה של אי-יציבות גנטית בתאי הגידול.

U87 אנושיים או LN229 התאים הגלינובללי היו לקרינה עם 4 Gy של פוטון או קרינת יון פחמן. מחזור תא ספציפי γH2AX רמות ו אפופטוזיס נמדדו בזמן נקודות שונות עד 48 h לאחר ההקרנה באמצעות שיטת הזרימה cy, הציג כאן (איור 3). בשני קווי התא, יוני פחמן המושרה גבוה יותר γH2AX השיא רמות שנדחו לאט יותר ונשארה מוגבה באופן משמעותי ב -24 כדי 48 h בהשוואה לקרינת פוטון באותה מנה פיזית (איור 4א). זה הצביע על כך יוני פחמן המושרה רמות שיא גבוה יותר של דנ א כפול משברים (DSB...

השיטה המוצגת משלבת את הניתוח הכמותי של מעברי ה-DNA כפול סטרנד (DSBs), מחזור התא הפצה ו אפופטוזיס כדי לאפשר מחזור התא הערכה ספציפית של האינדוקציה DSBS ותיקון, כמו גם את ההשלכות של כשל בתיקון.

מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

השיטה מספקת מידע על השפעות הטיפול תלוי מחזור התא ומאפשרת ולעומק מחקר של יחסי הגומלין בין התפשטות הסלולר ומנגנוני התמודדות נגד נזק לדנ"א. שיטה זו משלבת נקודות קצה חשובות מתגובת הנזק לדנ"א כולל זיהוי ותיקון של שבירה כפולת גדילים, השפעות מחזור התאים, ובסופו של דבר מוות תאי על ידי אפופטוזיס לתוך בדיקה מקיפה אחת. השתמשנו בטכניקה זו בעיקר כדי לחקור תגובות טיפול ספציפיות ותופעות לוואי של טיפולים radiochemotherapeutic באונקולוגיה קלינית.ההתמדה שימושית מאוד למחקרים קואורלטיביים בתחומי הרדיוביולוגיה וההקרנות, אך ניתן ליישם אותה גם בתחומים שונים אחרים של אונקולוגיה. לאחר איסוף התאים מן התרבות על פי נהלי איסוף תאים סטנדרטיים, להשתמש מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS. ולהעביר את התאים לשני מיליליטר של פתרון קיבעון בשכונה.לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו decant supernatant. חשוב לתקן את התאים כהשעיה של תא יחיד, ולשמור על זמן קיבוע קבוע עבור כל הדגימות. תן לתאים חסידים מספיק זמן להתנתק כדי להשיג תאים מעוגל יפה לניתוח.ואז לשחרר את גלולה על ידי הקשה מחדש של התאים בשלושה מיליליטר של 70% אתנול. כדי לשטוף את התאים לפני הכתם, לעים את התאים על ידי צנטריפוגה, ולשחרר את גלולה על ידי הקשה. לאחר מכן בצעו שימוש חוזר בתאים עם שתי שטיפות רצופות עם שלושה מיליליטר של תות פתרון כביסה וכביסה אחת עם מיליליטר אחד של פתרון כביסה.השלכת העל-טבעי בין כל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, בזהירות שאפו את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור והתינו מחדש את גלולת הלוקנט ב-100 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים המעניין. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה בזהירות לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולה.לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולה משוחררת ב 100 כדי 250 microliters של פתרון כתמי DNA ולחלק את התאים דרך מכסה מסננת התא של צינור מדגם עם גודל נקבובית רשת 35 מיקרומטר. כדי לנתח את התאים לפי ציטומטריית זרימה, פתח את לשונית הפרמטרים בחלון הציטומטר ובחר את הפרמטרים כפי שצוין בטבלה. לאחר מכן, פתח את חלון גליון העבודה וצור התוויות כמצוין.טען דגימת בקרה על הציטרומטר ולחץ על לחצן הריצה. בחר את הצינור הראשון בחלון הדפדפן ולחץ על שם הצינור. כוונן את מתחי הגלאי עבור פיזור קדימה וצד ו- DAPI בכרטיסייה parameters של חלון המפקח.לחץ על לחצן המתנה כדי להמשיך בהגדרת גליון העבודה בתוכנה. השתמש בכלי שער מצולע כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים באזור פיזור קדימה לעומת ההתוויה של אזור פיזור הצד ולהשתמש בכלי שער המלבן כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים הבודדים ב- DAPI עם התוויית אזור DAPI לעומת. לחץ על Control G כדי להציג את הירארכיית האוכלוסיה ולחץ על שמות השערים המוגדרים כברירת מחדל כדי לשנות את שמם.לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל ההיסטוגרמות כדי לבחור אוכלוסיות תצוגה ותאים בודדים מתפריט ההקשר. לרכוש דגימות בקרה וטופלו כדי לייעל את מתחי הגלאי עבור פלואורופורים מרוכזים בנוגדנים כדי לכסות את הטווח הדינמי המלא של האות. כדי למדוד את הדגימות, לחץ על לחצן ההפעלה בציטומטר ולהשתמש בלוח המחוונים של הרכישה בתוכנה כדי למדוד את הדגימות.לאחר מכן בחר קובץ, ייצוא וניסויים לבחירת ייצוא ספריות בתיבת הדו-שיח כדי לשמור את הנתונים כקבצי FCS נקודה. כדי להעריך את הנתונים, גרור ושחרר את קבצי FCS של הנקודה בדפדפן לדוגמה של תוכנת הניתוח הציטומטרי של הזרימה. ולהשתמש בכלי מצולע כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים בחלקת אזור פיזור קדימה לעומת צד ולהוציא פסולת מהניתוח.ב- DAPI עם התוויית אזור DAPI לעומת, השתמש בכלי המלבן כדי להגדיר את האוכלוסיה של תאים בודדים ולא לכלול כפילויות או גושים של תאים מהניתוח. בהיסטוגרמה של אזור DAPI, השתמש בכלי ביסקטור כדי להבחין בין תאים בודדים עם תוכן דנ"א רגיל לתאי אפופוטוטיקה עם דנ"א מושפל. בחר ביולוגיה של כלי ומחזור תאים כדי לפתוח את כלי מידול מחזור התא ובחר דין-ג'ט פוקס כדי להעריך את תדירות התאים בשלבי G אחד S ו- G שני M.צור G אחד S ו- G שני ו- M שערי שלב ב DAPI עם התוויית אזור לעומת DAPI של אוכלוסיית מחזור התא כדי לאפשר מחזור תא ספציפי גמא H שתי מדידת A X. השתמש בכלי bisector כדי להבחין בין phosphohistone H שלושה תאים חיוביים ושליליים בהיסטוגרמה של אזור Alexa 555 של אוכלוסיית מחזור התאים ולהבחין CAS בסיס שלושה תאים חיוביים ושליליים בהיסטוגרמה אזור Alexa 647 של אוכלוסיית התאים הבודדים. הקש Control T כדי לפתוח את עורך הטבלאות ולקבוע את תצורת הטבלה כפי שצוין.לאחר מכן בחר באפשרות אל קובץ כדי להגדיר את התבנית והיעד במקטע הפלט של רצועת הכלים של התפריט ולייצא את הנתונים לגיליון כפולה. ions פחמן לגרום גמא גבוהה יותר H שתי רמות שיא AX בתאי גליובלסטומה לרדת לאט יותר ולהישאר גבוה באופן משמעותי ב 24 עד 48 שעות לעומת קרינת פוטון באותה מנה פיזית. עבור שני ions פחמן קרינת פוטון, גמא H שתי רמות AX היו הגבוהים ביותר בתאי שלב G אחד סביר כי תיקון שבירת גדיל כפול DNA מוגבל המסלול של סוף לא הומולוגי מצטרף בשלב זה במחזור התא.בקנה אחד עם קצב אינדוקציה לשבור גדיל כפול גבוה יותר קינטיקה תיקון איטי יותר, יון פחמן לגרום מעצר מחזור תא חזק יותר וארוכת טווח ב G שני שלב וקצב גבוה יותר של אפופטוזיס מאשר לעשות פוטונים. בהתאם לעוצמת אפקט הטיפול, הרזולוציה של שלבי מחזור התא השונים יכולה להיות מאתגרת. בשורות תאים מסוימות, לריכוז DAPI יש השפעה גדולה על איכות פרופיל מחזור התא ויש להתאים אותו.שקופיות ניתן להכין מן הדגימות הנותרות לאחר ציטומטריית זרימה כדי להעריך את המספר, גודל, ואת הצורה של גמא H שני מוקדי AX ולהבחין בין מוקד פרנוקלארי גמא H שני AX כתמים. בשיטה שלנו, אנו יכולים להראות כי תאי גזע mesenchymal עמידים יחסית נגד קרינה מייננת עיכוב topoisomerase אבל רגיש גליומיאצין. כמו אדי PFA רעילים, תמיד להשתמש מכסה המנוע אדים בעת הכנת פתרון הקיבעון במהלך שלב הקיבעון.זכור גם ללבוש כפפות בעת טיפול DAPI.

cell-cycle-specific-measurement-h2ax-apoptosis-after-genotoxic-stress

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

כימות של גדיל הדנ"א הכפול פסים באמצעות היווצרות γH2AX כסמן המולקולרית הפכה כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור כימות γH2AX מוקדים לאחר חשיפה לקרינה של תאים.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

Quantitation של גדיל הדנ"א הכפול נשבר על בסיס γH2AX מוקדים הפך כלי רב ערך, במיוחד בביולוגיה קרינה, להערכת radiosensitivity רקמות ההשפעות של תרכובות קרינה שינוי. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת המיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי כדי לזהות חלבונים ספציפיים של תגובת נזק לדנ"א הממוקמים באתרים של שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאים חד-גרעיניים אנושיים. החלבונים מזוהים על ידי נוגדנים ראשוניים ספציפיים, אשר בתורם נקשרים לנוגדנים משניים המתויגים בפלואורופור הפולטים פלואורסצנט במהלך הדמיה מיקרוסקופית, ומאפשרים הדמיה של החלבונים כמוקדים פלואורסצנטיים נפרדים בתוך גרעיני התא.

מיקרוסקופ אימונופלואורסנציה לניתוח שברים דו-גדיליים של DNA

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בbromodeoxyuridine ספיגה (BrdU) כדי לאפשר המעקב הזמני של תאים שהיו בשלב S בנקודה מסוימת בזמן. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדן מאפשרת ניתוח מפורט של גורלם של התאים בשלב S בתקופות מאוחרות יותר.

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

פרוטוקול להערכת שינויים ברמות הנזק ל-DNA וביכולת תיקון ה-DNA שעלולים להיגרם על ידי הקרנה כרונית במינון נמוך in vivo בלימפוציטים של טחול עכבר, על ידי מדידת היסטון זרחני H2AX, מוצג סמן לשבירות דו-גדיליות של DNA, באמצעות זרימה ציטומטרית.

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; In vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

פרוטוקול זה מציג את הכנת השקופית ואת הניקוד האוטומטי של γ-H2AX foci בדיקה על לימפוציטים דם היקפיים. כדי להמחיש את השיטה והרגישות של ההסתה, לימפוציטים מבודדים היו מוקרן במבחנה. שיטה אוטומטית זו של זיהוי DNA DSB שימושית עבור יישומי dosimetry ביולוגיים מהירים ותפוקה גבוהה.

שיטת ניקוד מיקרוסקופית אוטומטית לבדיקת מוקדי γ-H2AX בלימפוציטים אנושיים היקפיים

כאן אנו מציגים שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה להדמיה וכימות של סמנים מרובים הקשורים לסנסנציה בתאים בודדים.

הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת היווצרות ותיקון של פריצות דו-גדילי DNA באמצעות זיהוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעינים בין-פאזיים של לימפוציטים היקפיים אנושיים שטופלו בבלומיצין.

אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ומהיר לזיהוי אינטראקציה של חלבונים באתרי נזק לדנ"א.

בדיקת ליגנד קרבה למיקום חלבונים באתרי נזק לדנ"א

חקור ניתוח מחזור תאים ונזקי DNA בשיטת זרימה ציטומטריה לחקר אפופטוזיס ותיקון שבירות דו-גדיליות. השיטה מאפשרת הערכת תגובות לטיפולים אונקולוגיים ומחקר מעמיק בתחום הרדיוביולוגיה הקלינית.

מחזור התא-מדידה ייחודית של γH2AX ו אפופטוזיס לאחר הלחץ הגנוטוקסיידי זרימה Cyהמטריה

גלה סרטונים נוספים