שימוש של מיקרוarray אנטיגן שפעת כדי למדוד את היקף של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מיקרוarray חלבון שנבנה על ידי הדפסת אנטיגנים שפעת על ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות בו סרום בדיקה עבור נוגדנים מרובים isotypes נגד מעל 250 אנטיגנים מפני זנים וירוסים שונים, ובכך המאפשר מדידה של רוחב של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס.

microarray אנטיגן שפעת מאפשר מדידה בו זמנית של isotypes נוגדנים מרובים נגד יותר מ 300 זנים של שפעת מנפח דגימת דם קטן של מיקרוליטר אחד. המיקרו-ריי מאפשר מדידת תפוקה גבוהה של רוחב נוגדני שפעת על פני הנוף האנטיגני של זני שפעת. על ידי אפיון נוגדני שפעת בפירוט רב יותר מאשר היה אפשרי בעבר, microarray זה יכול לעזור לקבוע מדוע אנשים מסוימים לפתח זיהום שפעת ואחרים לא.

טכניקת מיקרו-ריי אנטיגן הוחלה על 35 פתוגנים שונים במעבדה שלנו, המאפשרת מדידת נוגדנים נגד 60,000 מטרות אנטיגן ומ-50,000 דגימות סרום שנאספו ממקרי מחלות זיהומיות ובקרות בריאות ברחבי העולם. לאחר שלימדנו טכניקה זו באמצעות סדנאות פנים אל פנים, מצאנו כי היכולת להדגים חזותית את הטכניקה חיונית להבנתה ולביצועיה. הדגמת ההליך תהיה אל Jasinskas ורפאל דה אסיס, מדעני פרויקט מהמעבדה שלנו.

כדי להדפיס אנטיגנים באמצעות מדפסת microarray, בחר מדפסת עם סיכות איתור microarray בנפח נמוך שיכולים לשאוף את האנטיגנים מצלחת מקור 384 באר לתוך ערוץ המדגם ולהפקיד את האנטיגנים באמצעות מגע ישיר פעולה נימי על 16 שקופיות זכוכית מצופה כרית. בתוכנת ההדפסה, הזן את מספר הלוחות לדוגמה שישמשו בתיבת הטקסט מספר לוחות ובחר את סוג הלוח שישמש לניתוח. בחר תצורת פין והגדר את היסט המקור למרחקים שבין מקור השקופית לבין המיקום שבו פיני ההדפסה יתחילו להדפיס על השקופיות.

תחת הכרטיסיה עיצוב מערך, הגדר את הגודל והצורה של המערכים ובחר את הפרמטרים עבור האופן שבו פיני ההדפסה יתאספו ויחלקו את הדוגמאות. קבע את התצורה של פרוטוקולי ניקוי הסיכה והפספוס והגדר את הרצף שבו בלוקי הדגימה מודפסים על השקופיות. תוכנת המערך תבנה קובץ אינדקס רשת מבואר כדי לתאר את הסידור של אנטיגנים בתוך כל microarray.

לאחר תיכנות תוכנת ההדפסה באמצעות הפרוטוקול הרצוי, התחל את הפעלת ההדפסה. לאחר השלמת, מניחים מגלשות microarray ללא תקע בתיבה חסינת אור ב ארון desiccator בטמפרטורת החדר. כדי לבדוק סרה עבור נוגדנים על microarray, להשתמש קליפים כדי לחבר את שקופיות microarray כרית בצד אל תאי הבדיקה ולמקום את התאים במסגרות.

היזהר בעת הרכבת השקופיות, כפי שהם שבורים בקלות ולבדוק כל דליפה לאחר התייבשות. במידת הצורך, לפרק ולהרכיב מחדש את השקופיות כדי לתקן דליפות. מחדש את השקופיות עם 100 microliters של חיץ חסימה מסונן לכל באר לדלל את sera ביחס של אחד עד 100 ב 100 microliters של חיץ חסימה לכל מדגם.

לאחר מכן, הדגירה את מגלשות microarray rehydrated ואת sera מדולל במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ו 100 כדי 250 סיבובים לדקה על שייקר מסלולית. בסוף הדגירה, השתמשו בטיפים של פיפטה המחוברים לקו ואקום עם בקבוק אוסף משני כדי לשאוב בזהירות את חיץ החסימה מפינת כל תא מבלי לגעת בריפידות ומיד להוסיף את ה-sera המדולל לריפדים מבלי לאפשר לרפידות להתייבש. לאחר מכן, מניחים את המסגרות המוקרות במגשים המכילים מגבות נייר לחות אטומות כדי לשמור על לחות ולהדקר את המסגרות לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה.

עבור נקודה קוונטית תיוג נוגדנים משני, בזהירות שאפו את ה-sera כפי שהוכח זה בלבד ושטפו את השקופיות בשלוש שטיפות ב-100 מיקרוליטרים של חיץ TTBS טרי לאורך חמש דקות כל אחת על שייקר מסלולי. לאחר מכן השקופיות דגירה עם תערובת של נוגדנים משניים נדנים נקודה קוונטית ולאחר מכן שטף שלוש פעמים כמתואר בפרוטוקול, באמצעות אותה טכניקה כפי שהוכח רק. לאחר הכביסה האחרונה, להסיר בזהירות את המגלשות מן התאים בעדינות לשטוף את המגלשות עם מים מזוקקים כפולים מסוננים ולאחר מכן למקם כל שקופית בצינור 50 מיליליטר.

לאחר מכן, לייבש את המגלשות על ידי צנטריפוגה. כדי להשיג תמונות של שקופיות microarray, הפעל תחילה את התמונה הניידת והצב בזהירות את השקופית כך שתדמיין את פניה כלפי מטה לתוך מחזיק השקופית בתא ההדמיה. פתח את תוכנת הדימות ותחת הכרטיסיה קביעת תצורה של תמונה, בחר את תצורת השקופית המתאימה.

תחת לשונית בקרת התמונה, בחר את הערוץ הפלואורסצנטי המתאים והתאם את זמני החשיפה והרכישה בהתאם לתאקטיביות של ה-sera. לאחר מכן, לחץ על לכידה כדי להתחיל את רכישת התמונה. בסוף הרכישה, השתמש ברשתות המכוונות על סמני הנאמנות כדי לזהות את כתמי המערך.

למדידת עוצמת הספוט, בחלונית 'נתוני קובץ', העלו את קובץ ה-gal וציינו את התיקייה שבה יש לשמור את קובצי הפלט של הניתוח בסעיף אפשרויות הניתוח. תחת הכרטיסיה פקד תמונה, פתח את אחת התמונות שנרכשו לכמת ובחר אוטומטית. במקטע ניתוח מערך, צור תבנית נאמנות בהתאם להנחיות התוכנה.

לחץ על ניתוח אצווה כדי לבחור את התיקיה המכילה את התמונות לכמת ולבחור את התבנית הנאמנות שנוצרה זה עתה. התוכנה תנתח כל תמונה ותמתן את עוצמת הספוט. לאחר מכן, לנתח את הנתונים הגולמיים כדי להשוות את איגוד הנוגדנים על פני אנטיגנים על פני דגימות סרום.

במחקר מייצג זה, הנוגדנים המשניים ששימשו היו עז אנטי אדם IgG נדדו לנקודה קוונטית פולטת ב 800 ננומטר ו עז אנטי אדם IgA נדדו לנקודה קוונטית פולטת ב 585 ננומטר לגילוי מולטיפלקס של נוגדני IgG ו- IgA בהתאמה. במפת החום שנוצרה, רק תת-סוגים רלוונטיים קלינית עם ייצוג גבוה תויגו כדי לחסוך מקום עם סימן החיבור המסמן את כל סוגי המשנה הנותרים של מספר גבוה יותר. סרום IgA ו- IgG היו מקובצים על ידי צורות מולקולריות hemagglutinin ו neuraminidase שלהם ותת סוגים.

כדי להדגים את הספציפיות הגבוהה של נוגדני קבוצת ראש hemagglutinin עבור תת-סוגים קליניים ואת תגובתיות צולבת גבוהה של נוגדנים hemagglutinin שלם triamerized כל hemagglutinin עם הכללת אזור המניות. תגובות נוגדנים שפעת נמדד על microarray ניתן לאשר על ידי טכניקות מסורתיות, כולל עיכוב hemagglutination ובדיקות microneutralization. טכניקה זו יצרה תובנות על ספציפיות תת-סוג של נוגדנים לקבוצת ראש שפעת ואת החשיבות היחסית של נוגדני IgA ו- IgG לרגישות לשפעת.

בעוד שאף אחד מהחומרים אינו מסוכן ביותר, יש לטפל בכל דגימות הסרום האנושיות בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים של בטיחות ביולוגית.