יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

פרוטוקול זה מאפשר לך ליצור מספר רב של תאי T אנטיגן פונקציונליים שהם גישה בטוחה הרצויה בטיפול במחלות אוטואימוניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת לך תהליך התמרה יעיל מאוד ומספר רב של תאי T פונקציונליים. טכניקה זו יכולה להיות מורחבת לטיפול בסוכרת מסוג 1 ומחלות אוטואימוניות אחרות שבהן ידועים אנטיגנים.

יתר על כן, תאי CAR T עשויים להיות טיפול מבטיח עבור סוגים מסוימים של סרטן. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי ליצור תאים חיסוניים המבטאים CARs אחרים. חשוב לקבל טכניקה מקובלת טובה, לקרוא את כל הפרוטוקול ולתכנן את הניסוי כולו מראש.

פרוטוקול זה, שאורך שבועיים, כולל מיני-שלבים, וההצלחה תלויה בביצועים נאותים של כל שלב. הדגמות חזותיות של שיטה זו הן קריטיות עבור הלומדים לעקוב כראוי. הכן את תאי הפניקס לתרגום כפי שמתואר בכתב היד.

זה תרגול טוב כדי לסמן את הקיר הצדדי שבו בינוני יתווסף והוסר כדי למזער את ניפוח התאים. ביום אפס שאפו את העל-טבעי מהתאים ושטפו אותם בחמישה מיליליטר של PBS. בזהירות להוסיף שבעה מיליליטר של ירידה בינונית בסרום מופחת לקיר הצדדי של הצלחת ולהעביר את התאים בחזרה אל החממה.

הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום סרום מופחת לשני צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים 14 מ"מ. הוסף 40 מיקרומטר של רגנט transfection לאחד הצינורות ו 15 מיקרוגרם של פלסמיד CAR מנותב מחדש של נוגדן יחד עם חמישה מיקרוגרם של פלסמיד אריזה לשני. דגירה הצינורות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ולאחר מכן להוסיף reagent transfection לצינור פלסמיד.

מערבבים על ידי צינור בעדינות את הפתרון למעלה ולמטה שלוש פעמים להדרגר אותו בטמפרטורת החדר לפחות 20 דקות. מוסיפים שלושה מיליליטר של התערובת לתאי הפניקס ומ מניחים אותם באינקובטור של תרמת רקמות. לאחר ארבע עד חמש שעות להוסיף מיליליטר אחד של FCS לתאים ולתרבת אותם לילה ב 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, להסיר את supernatant מהתאים ולהוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום תרבות טרום המלחמה טרי. לקצור את הנגיף ביום השני על ידי איסוף הנגיף המכיל מדיום מתאי הפניקס וסינון אותו כדי להסיר שאריות פסולת תאים. הוסף מלאי IL-2 אנושי רקומביננטי לנגיף לריכוז סופי של 200 יחידות בינלאומיות למיליליטר ולהשתמש בו מיד לתרגום.

מוסיפים ארבעה מיליליטר של מדיום טרי לתאי הפניקס ומ מניחים אותם באינקובטור למשך הלילה. חזור על איסוף וירוסים למחרת עבור התמרה שנייה ומחק את התאים. יום אחד לפני הזריעה של תאי CD8 T של מורין, הוסיפו מיליליטר אחד של תערובת נוגדנים נגד עכבר CD3 ו-CD28 לכל באר של צלחת של 24 בארות ודגירה של הצלחת במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

ביום אפס, קציר טחול העכבר ולשים אותם על מסננת תא השרייה ב 10 מיליליטר של PBS בצלחת תרבות התא על קרח. במכסה המנוע של תאים, חותכים כל טחול לשלוש עד חמש חתיכות ולהשתמש בוכנה סטרילית של מזרק ללחוץ על הרקמה דרך רשת התיל. בעדינות להסיר תאי דם אדומים על ידי שימוש חוזר טחול אחד עד ארבעה חיץ תריס תא אדום מדולל דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ולאחר מכן לדלל 10 microliters של ההשעיה התא עם טריפאן כחול לספירת תאים.

ו גלולה שאר התאים על ידי צנטריפוגה ב 350 פעמים g במשך שבע דקות. השתמש בערכת בידוד תא CD8 T של עכבר כדי להעשיר תאי CD8 T ולהשעות את כדורי התא ב 400 microliters של חיץ עם 100 microliters של קוקטייל נוגדן ביוטין לכל אחד פעמים 10 לתאים השמיניים. מערבבים היטב את ההשעיה התאית ומטמיבים אותה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר כריכת נוגדנים.

לאחר מכן הוסיפו 300 מיקרוליטרים של מאגר תיוג ו-200 מיקרוליטרים של MicroBeads נגד ביוטין לאחת מ-10 לתאים השמיניים. מערבבים היטב ו דגירה עוד 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בינתיים, להגדיר עמודת הפרדה על המפריד ולשטוף אותו עם שלושה מיליליטר של מאגר תיוג.

שים מסננת תאים 40 מיקרומטר על החלק העליון של עמודה ולהעביר מיליליטר אחד של תערובת חרוזים ותא דרך מסננת לתוך עמוד ההפרדה. לאסוף את הזרימה דרך צינור prechilled 15 מיליליטר ולשטוף את העמוד על פי הוראות היצרן, איסוף שפך לתוך אותו צינור. לספור את התאים ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 350 פעמים גרם במשך חמש דקות.

לשטוף אותם עם שני מיליליטר של תא T בינוני צנטריפוגה שוב. ואז להשתמש בהם במדיום תא T מראש בריכוז של 250, 000 עד 500, 000 תאים למיליליטר. לשטוף את לוחות מצופה נוגדן CD3 ו- CD28 שהוכנו בעבר עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי שלוש פעמים ולהוסיף שני מיליליטר של ההשעיה התא לכל באר.

השתמש בתנועה מתערבלת כדי לוותר על תאים באופן שווה. כפקד, צלחת אותו מספר של תאי CD8 T לתוך באר אחת לא מצופה של הצלחת ולטמיר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 10% פחמן דו חמצני מיכל גז אינקובטור במשך 48 שעות. ביום הראשון, להכין צלחות מצופות שבר פיברונקטין אנושי על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של פיברונקטין ל בארות של צלחת 24 בארות דגירה אותו במהלך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

ביום שלמחרת, להסיר את פתרון fibronectin ולהוסיף מיליליטר אחד של 2%BSA ו PBS ל הבאר. הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ולשטוף את בארות מטופלים עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי. הצלחת מוכנה לשימוש לאחר הסרת פתרון שטיפה.

ספור את תאי ה- CD8 T שהופעלו באמצעות טריפאן בלו. לאסוף אותם על ידי צנטריפוגה. ולתזמן אותם בחמישה מיליון תאים בני קיימא למיליליטר לתרגום.

הוסף 100 microliters של ההשעיה תא CD8 מופעל לכל באר של צלחת מצופה fibronectin. לאחר מכן מוסיפים 1.5 עד שני מיליליטר של הנגיף שהוכן בעבר המכיל בינוני ומערבבים באמצעות תנועה מתערבלת כדי לחלק את התאים באופן שווה. לאטום את הצלחת בשקית Ziploc וצנטריפוגה אותו ב 2, 000 פעמים גרם במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

מוציאים את הצלחת מהצנטריפוגה ומקחים אותה לארון בטיחות ביולוגי. בזהירות להסיר את שקית ניילון ולוודא כי החלק החיצוני של הצלחת אינו מזוהם עם בינוני. מעבירים את הצלחת לאנקובטור פחמן דו-חמצני ב-37 מעלות.

לאחר ארבע שעות, להסיר מיליליטר אחד של מדיום מכל באר, להחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום תא T להשלים מראש ולהכניס את הצלחת בחזרה באינקובטור. ההיבטים הקריטיים של פרוטוקול זה הם וירוס טיטר גבוה, תאי T פעילים בריאים ושיטת ההעתקה המתאימה. התאים היו מוכתמים במשותף עם גודל PE שבע נדנוד אנטי CD8, AF647 נדנוד אנטי CD3, ו BV 421 נדנוד אנטי CD28 לניתוח ציטומטרי זרימה.

בערך, 70% מהתאי CD8 T מבוטאים במשותף GFP המציין ביטוי CAR. הם גם הביעו במשותף CD28 ו-CD3. חשוב לציין, כל תאים חיוביים GFP הבדיקה גם מוכתם במשותף עם Tetramers BR3 אינסולין I-Ag7 אשר מציין ביטוי של CAR על פני התא אבל לא עם tetramer שליטה.

יתר על כן, המבחן ממוין ולשלוט בתאי CAR T כל אחד מופרש רמות גבוהות של גמא אינטרפרון רק לאחר coculture עם תאי היעד המבטאים ליגנדים קוגניציה שלהם אשר מאשר כי התאים מתומרים יש PHENOTYPE תא T משפיע CD8 מכוון לעבר היעד של נוגדני האב. ההעתקה של תאים מפיקים וירוסים, בידוד של תאי CD8 T ראשוניים והפעלה של תאי T אלה הם השלבים החשובים ביותר בניסוי זה. לאחר תאי T פעילים בריאים והתמרה של תאי T אלה עם רייגנטים מתאימים מבטיח תוצאות חיוביות.

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להמשדר תאי T אחרים, אך יש להתאים אותה אישית עבור סוג התא T הספציפי. פרוטוקול זה סולל את הדרך למניעת סוכרת מסוג 1 עם אנטיגן ספציפי אנטיגן קולטן T טיפול בתא.