הירארכי וניתן לתיכנות Oligosaccharide סינתזה של סיר אחד
6 בספטמבר 2019
פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בתוכנת Auto-CHO לסינתזה הירארכית וניתנת לתיכנות של oligosaccharides. כמו כן, הוא מתאר את הנוהל הכללי לניסויים בקביעת RRV וגליקוציה של סיר אחד של SSEA-4.
אנו מדגימים כיצד להשתמש בתוכנה החדשה שפותחה שלנו, Auto-CHO, לסינתזת אוליגוסכרידים היררכית ותכנתתית של סיר אחד. Auto-CHO כולל אלגוריתמים על אבני בניין מורחבות, עם ערכי תגובתיות יחסיים החזויים באמצעות למידת מכונה. התוכנה Auto-CHO מספקת קו מנחה בעל ערך לבחירת אבני בניין, ושרטוט היררכי לסינתזה מרובה של סיר אחד של גליקנים מורכבים יותר באמצעות קומפוזיציית שברים.
ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון טיפול של סרטן או מחלות זיהומיות על ידי טיפולים מבוססי פחמימות. לפני השימוש ב-Auto-CHO, ודאו שהסביבה של Java זמן ריצה הותקנה במחשב PC או Mac. ההדגמה החזותית של מניפולציה בתוכנה Auto-CHO וניסוי קביעת ערך תגובתיות הקשורים יסייעו לכימאים לעקוב אחר הפרוטוקול, ולהמשיך בניסוי במהירות.
כדי לבצע אתחול תוכנה של סביבת זמן הריצה של Java, עבור אל אתר האינטרנט של Auto-CHO והורד את התוכנה בהתאם למערכת ההפעלה. נכון לעכשיו, Auto-CHO תומך ב- Windows, macOS ו- Ubuntu. המדריך למשתמש האחרון של PDF מסופק באתר האינטרנט של Auto-CHO.
עבור משתמשי Windows, בטל את ההזתה של Windows Auto-CHO. zip, ולחץ פעמיים על אוטומטי-CHO. צנצנת בתיקיה Auto-CHO Windows כדי להפעיל את התוכנית.
הזן את מבנה הגליקן הרצוי. בחר לצייר מבנה גליקן או לקרוא קובץ מבנה קיים. כדי להזין על ידי ציור, לחץ על עריכת גליצן על ידי GlycanBuilder, או את האזור של לחץ כאן כדי לערוך את היעד הסינתטי לצייר ולערוך את מבנה השאילתה על ידי GlycanBuilder.
אין להתעלם ממידע על קישור ו chirality. לחץ על הלחצנים גלובו-H, SSEA-4 או OligoLacNAc כדי להציג את הדוגמאות. סגור את הדיאלוג של GlycanBuilder כדי להשלים את העריכה.
הגדר את פרמטרי החיפוש בכרטיסיה הגדרות פרמטר כדי לקבל תוצאות חיפוש סבירות. לחץ על הכפתור בסדר כדי לאפשר הגדרות חדשות. הגדרת ברירת המחדל היא לחפש בספריה הניסיונית בלבד.
אם ברצונך לחפש הן בספריות הניסיוניות והן בספריות הווירטואליות, בחר בכרטיסיה ספריית אבני בניין וירטואלית. בחר השתמש בספריות ניסיוניות ווירטואליות והחל סינון כדי להציג אבני בניין וירטואליות עם קריטריונים מסוימים. אבני בניין ניסיוניות ווירטואליות יכולות לעבוד יחד כדי לשפר את יכולת החיפוש של Auto-CHO.
נכון לעכשיו, Auto-CHO מספק יותר מ 50, 000 אבני בניין וירטואליות, עם RRVs חזוי בספריה. בדוק אבן בניין וירטואלית רצויה אחת או יותר שהמשתמש רוצה להשתמש בה לחיפוש. לחץ על לחצן הצג אבני בניין וירטואליות שנבחרו כדי להציג רק את אבני הבניין הווירטואליות שנבחרו.
לחץ על הצג לחצן אבני בניין וירטואליות מסוננת כדי להציג רק אבני בניין וירטואליות עם קריטריונים מסוימים שהוגדרו על ידי המשתמש. לחץ על הצג את כל אבני הבניין הווירטואליות לחצן כדי להציג את כל אבני הבניין הווירטואליות הזמינות, ולאפס את המסנן. בחר את הכרטיסיה מבנה שאילתה ולחץ על לחצן ספריית אבני בניין החיפוש כדי למצוא את הפתרונות הסינתטיים בסיר אחד עבור מבנה השאילתה.
לאחר מכן אשר את הגדרות הפרמטר. חפש במציג התוצאות. תוצאת החיפוש מוצגת בכרטיסיה פריט חזותי של התוצאה.
מקבלי הקצה המפחיתים של מספרי שאריות שונים מוצגים בעמודה מקבל הקצה המפחית. לאחר מכן, בחר מקבל קצה מצטמצם. פתרונות מוצגים ברשימת הפתרונות הסינתטיים.
קטעים מוצגים ברשימת הקטעים כדי להציע כמה קטעים יש להשתמש בסינתזה. המערכת מספקת מידע מפורט של כל קטע, כולל RRV של הקטע, תשואה חישובית, כמו גם איזו קבוצת הגנה יש לבטל את ההגנה לשימוש בשבר בתגובת סיר אחד. אבני הבניין המשמשות להרכבת הקטע הנבחר ומידע חיבור הקטע מוצגים גם הם.
עבור אבני בניין ניסיוניות, הצג ובדוק מבנים כימיים של אבני הבניין שנבחרו במבנה הכימי של אזור אבני הבניין, ועון בדפדפן אבן הבניין של המידע המפורט. בבקבוקון תחתון עגול 10 מיליליטר, לשלב את שני תורמי thioglycoside, מתנול מוחלט, ויבש ב DCM. ואז מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
קח aliquot 30 מיקרוליטר של תערובת זו ולהזריק את התערובת לתוך כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים בשלוש זריקות נפרדות. למדוד את המקדם בין הספיגה והריכוז של מולקולת התורם בתנאי ההפרדה הבסיסית. הוסף פתרון של 0.5 טוחנת N-יודוזוצ'ינימיד באצטוניטריל לתוך תערובת התגובה, ואחריו תוספת של 0.1 תוסף חומצה טוחנת trifluoromethanesulfonic.
מערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר מכן, לדלל את תערובת התגובה עם ארבעה מיליליטר של DCM. לסנן ולשטוף את התגובה עם thiosulfate נתרן מיורית רוויה, המכיל 10% נתרן מימן קרבונט.
עכשיו לחלץ את השכבה המים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של DCM. מערבבים את כל השכבות האורגניות, ושוטפים עם חמישה מיליליטר של מלח. לאחר מכן לייבש את השכבות המשולבות עם כ 200 מיליגרם של מגנזיום גופרתי נטול מים.
לנער את התערובת במתינות במשך 30 שניות, ולסנן אותו דרך משפך עם נייר מסנן מחוך על מנת להסיר את מגנזיום סולפט. ואז לאסוף את הסינון בבקבוקון תחתון עגול 25 מיליליטר. הסר את הממס, באמצעות אידוי סיבובי.
ממיסים את השאריות במיליליטר אחד של DCM. קח aliquot 30 מיקרוליטר של תערובת זו, ולהזריק אותו כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים בשלוש זריקות נפרדות. למדוד את הריכוזים של התורמים הנותרים על ידי HPLC, באותם תנאי הפרדה.
למדוד את תגובתיות יחסית. בהתבסס על ערך תגובתיות יחסי של DR4, ערך תגובתיות יחסית של DX1 הוא שלוש. תוצאת החיפוש Auto-CHO המבוססת על הגדרות פרמטר ברירת המחדל מצביעה על כך שניתן לסנתז את SSEA-4 על-ידי תגובה של שניים ועוד אחד ועוד שלושה סיר אחד.
כאשר נבחר מקבל קצה להפחתת טריסכריד, התוכנית מציגה ארבעה פתרונות פוטנציאליים עבור השאילתה. הפתרון הראשון כולל קטע אחד, והתשואה המחושבת שלו היא כ-94% ניתן לסנתז את הקטע באמצעות שתי אבני בניין. RRV של אבן הבניין disaccharide הראשון הוא 1462, ואת RRV של monosaccharide השני הוא 32.0.
המבנה הכימי של אבן הבניין המוצעת הראשונה המשמשת בתגובת סיר אחד מוצג גם כן. ניסוי סיר אחד מראה כי SSEA-4 ניתן לסנתז בהצלחה ב 43%תשואה על ידי הצעה זו. SSEA-4 ניתן לסנתז על ידי שלוש יחידות המוצעות על ידי Auto-CHO.
יחידות אלה כוללות אבן בניין סילה disaccharide אחד, אבן בניין monosaccharide שתיים, וצמצום מקבל הקצה שלוש. עבור הגדרות פרמטר, אנו ממליצים להגדיר פרמטרים עם קריטריונים מחמירים יותר בהתחלה. לבחירת ספריית אבני הבניין, אנו ממליצים לחפש בספריית הניסוי רק בהתחלה.
באמצעות הדגמה זו, אנו מקווים גליקנים חשובים יותר, כגון אנטיגנים פחמימות הקשורות לגידול, ניתן לסנתז על ידי גישה סיר אחד למחקרים נוספים. בעקבות הליך זה, סינתזה של כל אנטיגנים כאלה יכול להתבצע על מנת לעצב חיסונים לסרטן מבוססי פחמימות. אנו מקווים גם כי בינה מלאכותית ואלגוריתמים ממוחשבים יכולים להקל על סינתזת גליצן אוטומטית לטובת טיפול ומניעת מחלות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את השימוש בתוכנת Auto-CHO עבור סינתזה היררכית ותכנונית של אוליגוסכרידים בשיטת one-pot. הוא כולל הדגמה חזותית של תפעול התוכנה וניסויים לקביעת RRV.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- סינתזה של אוליגוסכרידים
- פיתוח תוכנה
- יישומים של למידת מכונה
רקע
- תוכנת Auto-CHO מסייעת בסינתזה של אוליגוסכרידים.
- אלגוריתמים חוזים ערכי תגובתיות יחסיים באמצעות למידת מכונה.
- מסופקים קווים מנחים לבחירת אבני בניין.
- השלכות ליישומים טיפוליים בסרטן ובמחלות זיהומיות.
מטרת המחקר
- להדגמת הפונקציונליות של תוכנת Auto-CHO.
- לספק פרוטוקול לביצוע גליקוזילציה בשיטת one-pot.
- להקל על סינתזה של גליקנים מורכבים באמצעות הרכבת פרגמנטים.
שיטות שהשתמשו בהן
- סינתזה היררכית של אוליגוסכרידים.
- אלגוריתמים של למידת מכונה לניבוי ערכי ריאקטיביות.
- הדגמות חזותיות של השימוש בתוכנה.
- ניסויים לקביעת RRV.
תוצאות עיקריות
- הדגמה מוצלחת של סינתזה של אוליגוסכרידים בשיטת one-pot.
- הנחיות יעילות לבחירת אבני בניין.
- הוראות ויזואליות ברורות לכימאיים.
- הדגשת יישומים טיפוליים פוטנציאליים.
מסקנות
- תוכנת Auto-CHO היא כלי בעל ערך לסנתזת אוליגוסכרידים.
- למידה חישובית (Machine learning) משפרת את תהליך הסנתזה.
- הפרוטוקול תומך בביצוע ניסיוני מהיר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סינתזה תכנונית של אוליגוסכרידים בסיס אחד (one-pot) מאפשרת הרכבה מהירה של גליקנים מורכבים לצורך תיקוף של מטרות טיפוליות, ובכך מקצרת את לוחות הזמנים לפיתוח של מועמדים לתרופות מבוססות פחמימות. תוכנת Auto-CHO מספקת בחירה חזויה של אבני בניין ותכנון סינתזה היררכי, התומכים בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו משפרת את תעדוף הפורטפוליו על ידי הגברת הוודאות בנוגע לקשרי מבנה-פעילות של גליקנים לפני השקעה בשלב הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות סינתזה מהירה של מבני גליקן מוגדרים, כגון SSEA-4, לצורך תיקוף של סממני תאי גזע.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי ייצור של מנות הומוגניות של אוליגוסכרידים עבור בדיקות תיקוף של מטרות תפקודיות.
- ערך חיזוי: מסייע במיפוי קשרי מבנה-פעילות כדי לתעדף אפיתופים של גליקנים בעלי פוטנציאל טיפולי במטרות של מחלות זיהומיות וסרטן.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר תכשירי גליקן סטנדרטיים המתאימים לפיתוח מערכי מיקרו-מערכים של פחמימות ובדיקות קישור.
- תוצרים כמותיים: מספק תנובה מדידה ופרופילי טוהר המאפשרים סריקה מהימנה של תרכובות כנגד חלבונים קושרי גליקן.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מאפשר זיקוק איטרטיבי של ספריות אבני בנייה באמצעות משוב משתמש על בלוקים וירטואליים, ובכך משפר את יכולת ההרחבה (scalability) של הסריקה לטווח ארוך.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: סינתזה מוכחת של SSEA-4, סמן של תאי גזע פלוריפוטנטיים, תומכת בהתאמה של סמנים ביולוגיים ברפואה רגנרטיבית ובמיקוד תאי גזע סרטניים.
- המשכיות תרגומית: מספק נתיב מסינתזה בקנה מידה של גילוי להערכה פרה-קלינית של אנטיגנים פחמימתיים הקשורים לגידולים לצורך פיתוח חיסונים.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר ייצור גליקנים בעלי מבנה מוגדר להפחתת העמימות בפרופיל הבטיחות ובביעילות האימונולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת סינתזה של גליקנים המונחית על ידי היפותזה, תורמת לזיהוי מובילים (leads) באמצעות מבנים אנטיגניים מוגדרים, ותומכת בתיקוף פרה-קליני באמצעות ייצור רב-השחזורי של גליקנים.
- ביולוגיה של התגליות (Discovery Biology): תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת מסלולים ביוסנתטיים ותיקוף של מטרות גליקן באמצעות סינתזה כימית מוגדרת.
- סריקה (Screening): מייצרת פאנלים של גליקנים המוכנים לבדיקה עם תנובות מכומתות עבור סריקה בספיקה גבוהה של אינטראקציות גליקן-חלבון.
- אנליטיקה (Analytics): מספקת ערכי ריאקטיביות יחסיים ותנובות חישוביות כנתוני קריאה כמותיים להשוואת יעילות נתיבי סינתזה וניבוי הצלחה.
- מחקר טרנסלציונלי (Translational Research): מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לסינתזה של אנטיגנים פחמימתיים הקשורים לגידולים עבור הערכת מועמדים לחיסונים.
- שימוש חוזר ארגוני (Enterprise Reuse): משמש כבסיס ליכולת ניתנת לשימוש חוזר באמצעות הרחבת הספרייה הווירטואלית של Auto-CHO המונעת ממשוב, ובכך מפחית תכנון סינתזה כפול בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתפקוד הגליקן.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסביליות (scalability) של ייצור אוליגוסכרידים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של סיר אחד (one-pot).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לחקר מהיר של קשר מבנה-פעילות, ובכך מפחית את הסיכון לכשל ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של מועמדים מבוססי גליקן באמצעות תחזיות מוגדרות של נבחה ונגישות סינתטית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בכימיה של פחמימות ובפירוש מבנה גליקנים לצורך בחירה יעילה של אבני בניין.
- נדרשת גישה ל-HPLC ולתשתית סינתזה אורגנית סטנדרטית לצורך קביעת RRV וניטור התגובה.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של נומנקלטורת גליקנים ופורמטים של קלט מבני לצורך שאילתות Auto-CHO עקביות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לאבני בניין שאינן תיאו-גליקוזיד או לאסטרטגיות חלופיות של קבוצות מגן.
- מוגבל על ידי דיוקם של RRVs שנחזו באמצעות למידת מכונה עבור אבני בניין חדשות, דבר המצריך תיקוף ניסיוני עבור תחזיות ברמת ביטחון גבוהה.
