גרימת פציעה חריפה של הריאה בעכברים על ידי הישירה ליפופוליסכראסטיליאלגרלציה

מודלים אמינים של בעלי חיים הם מרכיבים חיוניים במחקר בסיסי. גישת המורין שלנו מאפשרת לענות על שאלות אימונולוגיות על המכיניסטים והקינטיקה של התפתחות פגיעה חריפה בריאות ביונקים. זעיר פולשניות, טיפול פשוט, כמו גם רבייה טובה הם היתרונות העיקריים של טכניקה זו.

בנוסף, עם טיטריון מינון, אנחנו יכולים לווסת את האפקט הקליני. טכניקה זו משקפת את המצב הקליני של חולים עם פגיעה חמורה בריאות ומאפשרת לחקור את המנגנונים הבסיסיים. לאחסן lipopolysaccharide, או LPS, ב aliquots בריכוז של חמישה מיליגרם למיליליטר במינוס 20 מעלות צלזיוס.

להזרמה תוך-אצ'יאלית, לדלל את LPS מופשר מלוחים פוספט סטריליים לריכוז סופי של 2, 000 מיקרוגרם למיליליטר. חותכים קטטר ור הווריד 22-מד לאורך של 20 מילימטרים. מניחים את העכבר במצב נוטה על שולחן מבוקר טמפרטורה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של 37 מעלות צלזיוס.

בעקבות הרדמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, להחיל חומר סיכה עיניים סטרילי כדי למנוע התפלה של קרניות תחת הרדמה. הרם את חותכי הראש והקרס על פס אופקי ממוקם כחמישה סנטימטרים מעל השולחן בעוד הישבן נשאר בקשר הדוק עם השולחן. להאריך את הצוואר בזווית של 90 מעלות יחסית לשולחן.

מניחים מקור אור קר על העור מעל הגרון כדי לעזור לדמיין את מיתרי הקול ולכוון קנה הנשימה. החזק את הלשון עם מעצורים כדי ליישר את הגרון לתנאי צנרור קלים יותר. הדמיה וזיהוי נאותים של הגרון הם קריטיים כדי להבטיח מיקום תוך-רשאלי נכון של הקטטר.

מקור אור קר חיצוני מסייע בשלב זה. הכנס את הקטטר כ 10 מילימטרים לתוך קנה הנשימה. ודא כי הכניסה אינה עמוקה מדי, כמו זה יגרום החדרה חד צדדית של נוזל לתוך הסופת הראשית הימנית או השמאלית.

אם מתרחשת התנגדות של הגרון, לסגת קטטר כמה מילימטרים לפני התקדמות שוב. עכשיו, להזריק MPBS מדולל LPS באמצעות פיפטה. נפח מוזרק תלוי במשקל גוף העכבר.

חבר מזרק והוסף בולוס של 50 מיקרוליטרים של אוויר כדי להבטיח את נפח הנוזל המלא מופץ בריאות. הסר לאט את הקטטר. שמור על פלג הגוף העליון של העכבר במצב זקוף במשך 30 שניות, כדי למנוע דליפה של הנוזל מקנה הנשימה.

תקן את העכבר המתת ים עם קלטת על שולחן הניתוחים וזמן קצר לחטא את הפרווה מעל הבטן עם 70% אתנול. פתח את חלל הבטן בזהירות בקו החציוני עם מספריים פינצטה. הסר חלקים של המעי כדי להשיג גישה לוונה קאווה נחות הזכות לעמוד החוליות באבי העורקים הבטן.

אתר את ורידים בכליות ולהכניס מכופף, 23-מד cannula מחובר מזרק מיליליטר אחד לתוך וריד קאווה נחות, ישירות מתחת להתכנסות של ורידים. שאפו 250 מיקרוליטרים של דם והעברו לצינור 1.5 מיליליטר מלא ב-20 מיקרוליטרים של תותב EDTA טוחן 0.5. לנער בעדינות כדי להקל על ערבוב EDTA ולשים את הצינור על קרח.

עבור lavage ברונכואלוולאר, להכין שלושה מזרקים מיליליטר אחד, כל אחד עם 0.5 מיליליטר של PBS סטרילי ו 0.1 מיליליטר של אוויר. לחטא את הפרווה של הגרון עם 70% אתנול בזהירות לחשוף את קנה הנשימה עם מספריים פינצטה. לגייס את קנה הנשימה ולעטוף תפר סביבו.

לנקב את קנה הנשימה באמצעות מיקרו מספריים ולהכניס קטטר ורסי 22-מד, לחתוך לאורך של 20 מילימטרים. לתקן את הקטטר עם תפר ולהחדיר 0.5 מיליליטר של PBS סטרילי ו 0.1 מיליליטר של אוויר. שאף את הנוזל לאחר 60 שניות.

חזור על ההליך עם שני מזרקים נוספים ולאסוף את כל שאף בצינור 15 מיליליטר על קרח. בזהירות לפתוח את בית החזה עם מספריים פינצטה כדי לקצור את הריאות. חותכים את הסרעפת לאורך השוליים costal לחתוך דרך הצלעות עם שני חתכים משניים.

בזהירות להימנע מנקב את הריאות. הרם את עצם החזה בקרניות ותקן או הסר אותו. הכינו שני מזרקים של 10 מיליליטר עם PBS חם של 37 מעלות.

לעשות חתך קטן לחדר השמאלי. לנקב את החדר הימני עם cannula 26-מד. לאחר מכן, לשטוף את זרימת הדם ריאתי עם PBS מחומם מראש.

שים לב שהריאות הופכות חיוורות במהלך ההליך. מוציאים את האונה הימנית של הריאות וחותכים אותה לחצאים. הצמד להקפיא אותם חנקן נוזלי ואחריו אחסון לטווח ארוך במינוס 80 מעלות צלזיוס לביטוי גנים נוסף וניתוח חלבון.

הסר את כל הריאה השמאלית והומוגניזציה אותו בצלחת 48 היטב על ידי טחון הרקמה עם מספריים פינצטה. דגירה הרקמה בשני מיליליטר של חיץ עיכול ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. בצע הומוגניזציה נוספת על ידי צינורות בזהירות חתיכות רקמת הריאה למעלה ולמטה.

מעבירים את דגימות הדם לחמישה צינורות FACS מיליליטר ומערבבים בעדינות את הדם עם שני מיליליטר של חיץ תותבת תא דם אדום. שים את הצינורות על קרח ולסיים את התגובה לאחר שתי דקות על ידי הוספת שני מיליליטר של PBS קר כקרח. צנטריפוגה המדגם במשך חמש דקות ב 400 פעמים g ולהשליך את העל טבעי.

תן שימוש חוזר לכדור התא עם 60 מיקרוליטרים של מאגר FACS ותהליך הכתמת FACS עוקבת בהתאם לפרוטוקולים שתוארו קודם לכן. נוזל BAL צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 400 פעמים g. שאף את העל-טבעי והקפיא אותו בחנקן נוזלי ואחריו אחסון ארוך טווח במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח חלבון נוסף.

לאחר שימוש חוזר גלולת התא BAL עם שני מיליליטר של חיץ FACS קר, להעביר את ההשעיה לתוך צינור FACS חמישה מיליליטר באמצעות מסנן רשת 100 מיקרון כדי לרסן את השערות. לאחר צנטריפוגה המדגם שוב, resuspend את גלולה עם 60 microliters של חיץ FACS ותהליך הכתמת FACS הבאים על פי פרוטוקולים שתוארו קודם לכן. עכשיו, להעביר את רקמת הריאה השמאלית מתעכל לתוך צינור FACS חמישה מיליליטר באמצעות מסנן רשת 100 מיקרון כדי לחלץ גושים.

לסיים את תהליך העיכול על ידי הוספת שני מיליליטר של חיץ FACS קר כקרח לפני צנטריפוגה המדגם במשך חמש דקות ב 400 פעמים g. להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה עם 60 microliters של מאגר FACS ותהליך עבור כתמים FACS הבאים על פי פרוטוקולים שתוארו קודם לכן. לניתוח FACS, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של פתרון חסימת נוגדנים CD16/CD32 ל-60 מיקרוליטר של תאים בצינור של חמישה מיליליטר.

דגירה התאים בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לחסום כריכה לא ספציפית של אימונוגלובולין לקולטנים Fc. בינתיים, הכינו תמהיל ראשי עם מאגר FACS ונוגדנים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר החסימה, אין לשטוף את התאים.

הוסף 20 מיקרוליטרים של תערובת אב נוגדנים לכל מדגם כדי להשיג נפח סופי של 100 מיקרוליטר. דגירה הדגימות במשך 20 דקות, בחושך, בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף כל מדגם עם מיליליטר אחד של חיץ FACS וצנטריפוגה כמו קודם.

השלך את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת החיץ עם מאגר FACS לריכוז התאים המתאים למדידות FACS. לבסוף, הוסף מספר קבוע של חרוזי כיול מסחריים זמינים בזוגות פלואורוכרום לכל מדגם כדי לקבוע מספרי תאים מוחלטים. בצע ציטומטריית זרימה באמצעות אסטרטגיית gating המוצגת בפרוטוקול הטקסט עבור תאי דם, BAL ורקמות.

24, כמו גם 72 שעות לאחר החדרה תוך-אצ'ית, הביטוי של TNF-אלפא ברקמת הריאה היה מוסדר באופן משמעותי, להגיע לעלייה מתמשכת יותר מ 50-פי לעומת חיות הבקרה. פלישת לאוציט לתוך רקמות וחלל מכתביים היא סימן היכר ומאפיין להתפתחות של פגיעה חריפה ריאות. ניתוח FACS חשף חדירה משמעותית של גרנולוציטים נויטרופילים לתוך interstitium הריאות, עם ספירת תאים מוחלטת גדל כמעט פי תשעה לעומת הפקדים לאחר 24 שעות.

ספירת גרנולוציטים נויטרופילים מוחלטת ירדה מעט לאחר 72 שעות, עם זאת, עליית הפקטור בהשוואה לפקדים נשארה. בקנה אחד עם חדירת גרנולוציטים נויטרופילים interstitial, ביטוי MMP-9 ברקמת הריאה כולה גדל באופן משמעותי במהלך תקופת התצפית הכוללת. גרנולוציטים נויטרופילים לא רק גדלו ברקמת הריאה, אלא גם בנוזל BAL.

עליית הקיפול בהשוואה לבעלי חיים שולטים הייתה בולטת יותר מאשר ברקמת הריאה. בצקת ריאות עקב פגיעה חמורה של מחסום alveolocapillary הוא פתוגנומוני להתפתחות של פגיעה ריאות חריפה. ניתוח של תוכן אלבומן בנוזל BAL על ידי ELISA חשף אובדן משמעותי של תפקוד מחסום ב 24 שעות ו 72 שעות לאחר החדרת LPS.

מיקום קטטר נכון הוא חיוני להחדיר דו-צדדית של LPS. לעתים קרובות, שינויים בדפוסי הנשימה, כגון שיעול או התנשפות, מצביעים על ההטבה האינטראצ'ית הנכונה של הנוזל. לאחר אינדוקציה של פגיעה חריפה בריאות, מספר צעדים הבאים, כגון ניתוח FACS, PCR, זיהוי חלבון, עשוי להתבצע כדי לענות על שאלות המחקר המתאימות.