Name: קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: למד שיטת סקר לפעילות נוקלאז כסמן ביולוגי למחלה באמצעות חומצות גרעין רגשים. שיטה זו מאפשרת זיהוי פעילויות נוקלאז ידועות ולא ידועות בקלות ובגמישות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר בלוסה הרננדז (אוניברסיטת ליניפינג) על התיקון הקפדני של כתב היד והעצות החשובות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן קנוט ואליס ולנברג ובאזור המחקר האסטרטגי של הממשלה השבדית במדעי החומרים על חומרים פונקציונליים מתקדמים באוניברסיטת Linköping (גרנט הפקולטה SFO-Mat-ליו No. 2009-00971).

1. העיצוב וההכנה של הספרייה לאוסיונומן
<ol><li>עיצוב ספריה<ol>
<li>בהתבסס על הקריטריונים הבאים לעצב ספרייה של פלורסנט המאובתים בדיקה בדיקה בין 8 ו 12-מר ארוך כדי למנוע היווצרות מבנה משני, עם אורך שווה עבור כל הבדיקות.<ol>
<li>כלול לפחות דנ א אחד ורצף RNA אחד אקראי המכיל שילוב של אדנין (א), גואנין (G), ציטוסין (C) ו תימין (T)/uracil (U) (ה-DNA ו-RNA בדיקות בטבלה 1). הערה: ה-DNA ו רצפי RNA המתוארים בטבלה 1 היו שימושיים כמו מצעים הראשונית לסיווג סוג לא ידוע של פעילות נוקלאז, או dnase או rnase. שני רצפים אלה מומלצים כנקודת המוצא עבור כל הקרנה, כפי שהם הראו יכולת רחבה כדי לזהות הפרופילים של פעילות נוקלאז בחיידקים ודגימות רקמות. אם הפעילות נוקלאז לא נצפתה עם אלה רצפי DNA ו-RNA, את העיצוב של עוד oligמונוקלאודים נדרש.</li>
			<li>כלול רצפי polynucleotide המורכב סוג אחד של נוקלאוטיד כדי לקבוע את התלות רצף עבור פעילות נוקלאז נתון (dna-פולי, dna-פולי, dna-פולי C, dna-פולי g, rna-פולי, rna-פולי U, rna-פולי C ו-rna-פולי G בטבלה 1).</li>
			<li>באמצעות אותו רצף של שאריות נוקלאוטיד כמו ה-DNA הראשוני רצפי RNA, כוללים רצפים המכילים המקבילה נוקלאוסייד מחסה שינויים כימיים ב 2 '-מיקום של סוכר ריבוז, כגון 2 '-fluoro ו 2 '-O-מתיל, כצעד מחמיר להגברת הסלקטיביות של הנוקלאוסים.<ol>
<li>כלול רצפים ששונו באופן מלא המורכב כולו של 2 '-Fluoro נוקלאוטיו מקבילים או 2 '-O-מתיל נוקלאוסייד (All 2 '-F וכל 2 '-OMe, טבלה 1)</li>
				<li>כלול רצפים של צ'יאריק המורכב מפורנים טבעיים לא שונו ו 2 '-fluoro פירימידין נוקלאוסייד (RNA pyr-2f, שולחן 1).</li>
				<li>כלול רצפים של צ'יאריק המורכב מפורנים טבעיים שאינם שונו ו-2 '-O-מתיל-מתיונין נוקלאוסייד (RNA Pyr-2Ome, שולחן 1).</li>
				<li>כלול רצפים של צ'יאריק המורכב פירורימיסועד טבעי 2 '-fluoro פורין נוקלאוטיב (RNA Pur-2 ' F, שולחן 1).</li>
				<li>כלול רצפים של צ'יאריק המורכב פירורימיסועד טבעי 2 '-O-מתיל משני הצדדים האנלוגיים (RNA Pur-2Ome, שולחן 1).</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>מחלת השמש וההכנה לאחסון הערה: השיטות הזרחניות מעוצבות ע י השיטה. לאחר הסינתזה, האוקליונודים מטוהרים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים והמסה נמדדת על ידי ספקטרומטר מסה.<ol>
<li>שימוש בצנטריפוגה ומדלל אותם במאגר טריס-edta (TE) כדי למנוע השפלה של נוקלאז. לקבוע את עוצמת הדילול בהתאם לתשואה של כל בדיקה כדי לעבד פתרון מניות עם ריכוז של 500 pmol/μL.</li>
		<li>בשנת 4 ° c או טמפרטורת החדר לטווח קצר. לאחסון לטווח ארוך (חודשים עד שנים), החנות לליגונוב 20 ° c. עם השעיית מחדש של ליאופונומטר בתוך TE, לאחסן את פתרונות המניה ב-20 ° c או, רצוי, ב--80 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. התרבות החיידקית
<ol><li>לקחת אחד בחרוזים זכוכית נקבובי מן הבקבוקון אחסון קריוגני תחת תנאים סטריליים.</li>
	<li>כדי לבודד מושבות בקטריאלי בודדים (סלמונלה ו -E. coli), השתמש בשיטת הרביע24 על ידי בריפסים/גלגול החרוז ישירות על צלחת פטרי המכילה טריטיק סויה אגר (ת א) בינונית בתוספת כבשים בהתרסה דם.</li>
	<li>מודאת התרבות ב 37 ° c עבור 24 שעות.</li>
</ol>3. הכנה לסופרנטאנט
<ol><li>העברת מושבה אחת ממדיה מוצקה ל-50 מ"ל סויה טריטיק (TSB) ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 24 h ב 200 rpm.</li>
	<li>לדלל את התרבות (1:500) ב TSB (תת תרבות) ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 24 h ב 200 rpm בחממה רועד. הערה: צפוי כי לאחר 24 שעות של דגירה התרבויות החיידקי הם בשלב נייח להגיע ערכים גבוה יותר מ 109 cfu/mL.</li>
	<li>לאחר תקופת הדגירה, להעביר את התרבויות הכתיר צינורות סטרילי וצנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 30 דקות.</li>
	<li>אספו את הסופרנטאנט. והשתמשו בו מיד לחלופין, תוכלו לאחסן את הסופרנטנים ב -4 ° צ' או 20 ° c.</li>
</ol>4. שיטת הפעולה של nuclease
<ol><li>הכנת פתרונות עבודה<ol>
<li>להכין 20 μl עבודה פתרון עבור כל לווין ב 1.5 mL נוקלאז ללא תשלום מיקרוצנטריפוגה צינורות ידי דילול (1:10 יחס) פתרון המניה (500 pmol/μl) עבור ריכוז עבודה סופי של 50 pmol/μl. למטרה זו, מערבבים 18 μL של פוספט מאגר מלוחים (PBS) המכיל MgCl2 ו-cacl2 עם 2 μl של פתרון מניות בדיקה. הערה: הקפד לשים לב כי בפתרון העבודה, מערכות העיבוד החלשות הינן פגיעות יותר לירידה בביצועי נוקלאז, ולכן מומלץ להכין את פתרונות העבודה לפני הגדרת התגובה.</li>
		<li>הימנע מגע ישיר בזמן ההכנה ולשמור בחושך (עטוף בנייר כסף), כאשר התמודדות עם fluorophores.</li>
	</ol></li>
	<li>התגובה הוגדרה<ol>
<li>מחמם את הפלואורומטר (כגון כפייה 1) עד 37 ° c.</li>
		<li>הכן סט (צינור אחד/בדיקה) של 1.5 mL נוקלאז חינם מיקרוצנטריפוגה צינורות עבור כל מדגם (TSB, E. coli ו סלמונלה) ותווית בהתאם.</li>
		<li>בזהירות להוסיף 96 μL של מדיה תרבותית סטרילית TSB, סלמונלה supernatant או E. coli supernatant (משלב 3.4.). לאחר מכן, להוסיף 4 μL/שפופרת של פתרון עבודה בדיקה בהתאם. בצע שלב זה בטמפרטורת החדר. הערה: 10 הבדיקות שימשו לסיבוב הראשון של ההקרנה ו 6 הבדיקות עבור הסיבוב השני.</li>
		<li>מערבבים ביסודיות על ידי ליטוף למעלה ולמטה כדי לקבל פתרון הומוגנית. הימנע להציג בועות אוויר לתוך דגימות תוך ערבוב.</li>
		<li>טעינת 95 μL של כל פתרון (בדיקה + supernatant או מדיה תרבות) לתוך באר נפרדת של התחתון שחור, לא מטופלים 96 צלחת הבאר. מזער את היווצרות בועות בבארות עם העמסה על ידי לחילוק בזהירות עם הקצה קרוב לקיר של הבאר.</li>
		<li>. תכסה את הצלחת עם המכסה שלו בחן חזותית את המכסה ולבדוק סימנים העט או הצטברות חלקיקים אבק שעשויים להחדיר חפצי מדידה. החלף את המכסה עבור אחד חדש אם זהו המקרה.</li>
	</ol></li>
	<li>הגדרת מדידה<ol>
<li>פתח את תוכנת הרכישה (Gen5 3.05) על-ידי לחיצה על סמל קיצור הדרך של התוכנה (איור S1A).</li>
		<li>בחר באפשרות ' קרא כעת ' מחלון מנהל המשימות ובחר באפשרות ' חדש ' כדי ליצור את פרוטוקול המדידה הקינטית (איור S1B).</li>
		<li>לחץ על קבע טמפרטורה בחלון הדו שיח שכותרתו הליך ובחר 37 ° c. אשר ושמור את ההגדרות על-ידי לחיצה על אישור (איור S1C).</li>
		<li>לחץ על התחל הקינטיקה בחלון הדו שכותרתו פרוצדורה. לאחר מכן, בחלון הדו המוקפץ, שכותרתו צעד קינטי, בחר 2 h בתיבה קלט זמן ריצה ו-2 דקות בתיבה קלט מרווח . אשר ושמור את ההגדרות על-ידי לחיצה על אישור (איור S1D).</li>
		<li>לחץ על לקרוא בחלון הדו שכותרתו הפרוצדורה. לאחר מכן, בחלון הדו המוקפץ, הנקרא שיטת קריאה, בחר בעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית כשיטת זיהוי, נקודת קצה/קינטית כסוג קריאה ומסננים כסוג אופטיקה. אשר ושמור את ההגדרות על-ידי לחיצה על אישור (איור S1E).</li>
		<li>בחלון הדו המוקפץ שכותרתו ' שלב קריאה ' (קינטי), בחר בירוק מתוך ערכת המסננים. אשר ושמור את ההגדרות על-ידי לחיצה על אישור (איור S2A).</li>
		<li>בחלון הדו שכותרתו פרוצדורה, בחר במכסה ולחץ על הלחצן אימות כדי להבטיח שהפרוטוקול שנוצר יהיה חוקי. הדבר מאושר על-ידי חלון דו-שיח מוקפץ (איור S2B).</li>
		<li>בחרו ' פרוטוקול ' בשורת התפריטים ובחרו ' פרוצדורה ' (איור S2C).</li>
		<li>בחלון הדו שיח שכותרתו נוהל, להגדיר את הבארות להיות נמדד (איור S2D).</li>
		<li>הזן את שם הניסוי בתיבת הקלט של שם הקובץ (איור S2E).</li>
		<li>העמיסו את הצלחת עם המכסה שלה לתוך קורא לוחית. ודא כי הצלחת היא בכיוון הנכון.</li>
		<li>הפעל את הרכישה על-ידי לחיצה על ' קרא לחצן חדש ' בסרגל הכלים (איור S2F).</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח מידע<ol>
<li>לחץ על אחת הבארות שנמדדו בחלון הדו שכותרתו צלחת 1 (איור S3A).</li>
		<li>לחץ על בחר בארות וכלול את כל הבארות הנמדדות בחלון הדו של הבחירה היטב . אשר ושמור את ההגדרות על-ידי לחיצה על אישור. (איור S3B).</li>
		<li>בחירת נתונים בחלון הדו שכותרתו לוחית 1 כדי להמחיש את תוצאות הטאבים (איור S3C).</li>
		<li>יצא את הנתונים לגיליון כפולה על-ידי בחירה בייצוא מהיר מהתפריט תלוי ההקשר (איור S3C).</li>
		<li>בגיליון הכפולה, סמן את עמודות הנתונים בהתאם לדוגמה ולבדיקה.</li>
		<li>צור גרפים קינטית, שימוש בקו עם סמנים סגנון, על ידי התוויית יחידות פלואורסצנטית יחסית (rfu) לעומת הזמן (ציר x: הציר של התגובה ואת ציר y: rfu). הערה: התיאור של יצירת גרף חל בעת שימוש בתוכניות גיליון אלקטרוני (לדוגמה, Excel). עם זאת, כל התוכניות האחרות ניתן להשתמש כדי ליצור גרפים מהנתונים הגולמיים שהתקבלו, על ידי התוויית RFU לעומת הזמן.</li>
		<li>חשב את קצב התגובה האנזימטית עבור כל מרווח נמדד בהתאם לנוסחה הבאה25: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq1.jpg"> rate =, כאשר אם הוא rfu בנקודת זמן המרווח המקסימלי ו- Ii הוא rfu בנקודת זמן הרווח המינימלי, ו- Tf ו- Ti הם נקודות הזמן של המרווח המקסימלי והמזערי, בהתאמה.</li>
		<li>בחר את הקצב עם הערך הגבוה ביותר (Rmax) עבור כל עיקול. אם יש יותר מ-Rמקסימום אחד לדוגמה, בחר את האחד שמופיע בנקודת זמן המדידה המוקדמת ביותר.</li>
		<li>חשב את היחס בין Rmax לבין הערך הממוצע של מרווח הזמן שבו מופיע rmax : מקדם קצב =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq2.jpg">
</li>
		<li>חישוב הפרש הקיפול (FD) בין מקדם הקצב של סלמונלה ו -E. coli עבור כל לווין.</li>
		<li>שקול ערך הפרש מתקפל גבוה מ-3 כמשמעותי.</li>
		<li>שקול את הבדיקות המשמעותיות עם ערכי ההפרש הגבוהים ביותר בקיפול (FD) כבדיקות מועמדות וכבסיס לעיצוב הספרייה בסיבוב ההקרנה הבא.</li>
	</ol></li>
</ol>5. מעגל ההקרנה קריטריונים בחירה (איור 1)
<ol><li>סיבוב ראשון של הקרנה<ol>
<li>בצע את התאמת פעילות נוקלאז (כמתואר בסעיף 4) באמצעות DNA, RNA ו-polynucleotide בדיקות.</li>
		<li>להעריך את ההעדפה של כימיה DNA או כימיה RNA על ידי השוואת מספר וביצועים (הערך FD) של DNA ו-RNA בדיקות מועמד.</li>
		<li>בחר את סוג של חומצות גרעין הכימיה עיבוד המספר הגדול ביותר של בדיקה המועמדים, כפי שמודגם באיור 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסבב השני של ההקרנה<ol>
<li>בצע את השינוי הפעילות נוקלאז (כפי שמתואר בסעיף 4) באמצעות בדיקה שונה באופן מלא ומרגשים שעוצבו על בסיס המצע חומצת גרעין נבחר בסיבוב ההקרנה הראשון.</li>
		<li>להעריך את ההעדפה לקראת רצפים המכילים 2 '-Fluoro ו 2 '-O-מתיל נוקלאוטידים מקבילים על ידי השוואת התוצאות שהתקבלו עבור 2 '-Fluoro ו 2 '-O-מתיל בדיקה מועמד שונה.</li>
		<li>בחר את סוג השינוי האנלוגי של נוקלאוטידים, המספר הגדול ביותר של הבדיקות המועמדות, כפי שמודגם באיור 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleases%3A+diversity+of+structure%2C+function+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li>
<li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911(2018).</li>
<li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li>
<li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li>
<li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional%2C+surface-attached+extracellular+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574(2014).</li>
<li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125(2014).</li>
<li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, Pt 1 184-190 (2010).</li>
<li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li>
<li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li>
<li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li>
<li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity%3A+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death & Disease. 7 (11), 2458(2016).</li>
<li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li>
<li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnases+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li>
<li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li>
<li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tipping+the+balance%3A+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li>
<li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li>
<li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li>
<li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li>
<li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li>
<li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communication+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li>
<li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064(2012).</li>
<li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Clinical+Enzyme+Measurements%22">Manual of Clinical Enzyme Measurements</a>. , Worthington Diagnostics. (1972).</li>
<li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234(2016).</li>
<li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+confidence+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li>
<li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+overview%3A+selection%2C+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li>
<li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display%3A+concept%2C+innovations%2C+applications+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li>
<li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+binding+proteins%3A+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li>
<li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Aptamers%3A+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li>
<li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+peptide+libraries%3A+mining+for+cell-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

שינויים של פעילות נוקלאז היו קשורים עם מגוון רחב של פנוטיפים למחלות, כולל סוגים שונים של סרטן וזיהומים חיידקיים. שינויים אלה מוצעים להיות סוכן סיבתי של מצב14, ואילו במקרים אחרים הם תוצאה של האירוע הפיזיולוגי המזיק20 או סוכן פתוגניים16,26. לא באופן מפתיע, ניסיונות להשתמש בנוקלאוסים ובפעילות נוקלאז כפי שתוארה ביואריקר אבחון15,22,23...

הנוקלאוסים הם מחלקה של אנזימים המסוגלים לעזוב את איגרות הזרחן היוצרות את המבנה העמוד השדרה של מולקולות חומצות גרעין. הגיוון העצום של הנוקלאוסים הופך את הסיווג שלהם לקשה למדי. עם זאת, ישנם מספר קריטריונים נפוצים המשמשים לתיאור נוקלאוסים, כגון העדפה מצע (חומצה deoxyribonucleic (DNA) או חומצה ריבונוקלאית (RNA)), אתר המחשוף (לאנונוקלאוסים או אקסקליסים), או תלות יון מתכת, בין השאר1. הנוקלאוסים הם בעלי שימור מאוד אנזימים קטליטי שיש להם תפקידים בסיסיים הן, prokaryotic ואורגניזמים איקריוטית ושימשו, ולהמשיך לשמש, כמו כלים לעריכת גנים2. הם גם שחקנים בסיסיים בתחזוקת DNA ושכפול, עוזר לשמור על יציבות הגנום והשתתפות בתהליכי קריאה-הוכחה3. בחיידקים, למשל, הנוקלאוסים זוהו כגורמים חשובים התקפה אלימה, מסוגל לקדם הישרדות חיידקית על ידי הפחתת היעילות של המערכת החיסונית של המחשב המארח4,5,6,7 ,8. ב יונקים, הנוקלאוסים הציעו להיות מעורב ב אפופטוזיס9, ביוגנזה מיטוכונדריאלי ותחזוקה10 וגישור של התגובות החיסונית אנטיבקטריאלי ו אנטי ויראליות מולדים11. לא באופן מפתיע, שינויים בפעילות נוקלאז, אם שיפור או חוסר, היו מעורבים במגוון רחב של מחלות אנושיות. מחלות אלה נעות בין מגוון רחב של סרטן12,13 כדי היפרפרס לב10 או מחלות אוטואימוניות14. לכן, הנוקלאוסים הפכו למועמדים מעניינים כסמנים לקבוצה הטרוגנית של התנאים האנושיים. למעשה, הנוקלאוסים כבר הראו את הפוטנציאל שלהם ככלי אבחון מוצלח לאיתור זיהומים הנגרמים על ידי סוכני בקטריאלי ספציפיים, כגון האורהולוקוקוס אוes, האנציצ'יה קולי15, 16. בסוגים רבים של סרטן, הביטוי של הדומיין נוקלאז המכילים חלבון 1 (SND1) ריבונוקלאז מעיד על פרוגנוזה גרועה17. בחולי סרטן הלבלב, ריבונוקלאז מוגבה (rnase i) רמות סרום דווחו18 הציע להיות משויך עם פנוטיפים תאים סרטניים19. בתנאי לב האיסכמי, כגון אוטם שריר הלב או בלתי יציבה ומלא יציבות, deoxyribonuclease אני (dnase i) רמות סרום הוכחו להיות סמן אבחון חוקי20,21.
זה כבר שיערו כי השרטוט הגלובלי של פעילות נוקלאז עשוי להיות שונה במצבי בריא ומחלות. למעשה, דיווחים אחרונים השתמשו הבדלים בפעילות נוקלאז להבדיל בין פנוטיפים בריאים סרטניים22 או לזהות זיהומים חיידקיים פתוגניים באופן ספציפי מינים15,23. ממצאים אלה נפתחו שדרה חדשה לשימוש נוקלאוסים כמו סמנים של המחלה. לכן, קיים צורך בפיתוח שיטת הקרנה מקיפה מסוגל לזהות בשיטתיות הבדלים הקשורים המחלה בפעילות נוקלאז, אשר עשויה להיות חשיבות מרכזית בפיתוח של כלי אבחון חדשים.
להלן, אנו מציגים ומתארים חדש בגישה לסינון חוץ גופית (איור 1) כדי לזהות בדיקה רגישה וספציפית מסוגל להפלות בין פעילות נוקלאז בריא ולא בריא, או פעילות ספציפית לסוג של תא או חיידקים. ניצול של המודולריות של חומצות גרעין, עיצבנו ספרייה הראשונית של פלורסנט מנוחלת בדיקה המורכב של מערכת מקיפה של רצפים וchemistries שונים, שניהם להיות פרמטרים חשובים עבור עיצוב הספרייה. הבדיקות הללו הינן מקיפים את משני הגלים האלה באמצעות פלואורוופפור (פלואורואסעין אמדיום, משפחתי) ומוצא (הגאות מקומד 2, TQ2) ב -5 ' ו -3 ' מסתיים בהתאמה (שולחן 1). באמצעות העברת האנרגיה הזאת תהודה פלורסנט (למדוד) המבוססת על בסיס פלואורומטרי כדי לאמוד את הקינטיקה של השפלה אנזימטית, היינו מסוגלים לזהות בדיקה המועמדים עם פוטנציאל להפלות דפוסי הדיפרנציאליות של פעילות נוקלאז קשורה למצבי בריאות או מחלות. עיצבנו תהליך איטראטיבי, שבו הספריות החדשות נוצרות על בסיס הבדיקות הטובות ביותר, המאפשר זיהוי של בדיקת מועמדים ספציפית יותר בשלבי ההקרנה הבאים. יתר על כן, גישה זו מנצלת את האופי הקטליטי של הנוקלאוסים כדי להגביר את הרגישות. הדבר מושג על ידי ניצול האופי הפעילות של בדיקת הכתב ואת היכולת של נוקלאוסים לעבד באופן רציף מולקולות מצע, הן המייצג יתרונות מרכזיים על נוגדנים חלופיים או מולקולה קטנה מבוססת שיטות הקרנה.
גישה זו מציעה מודולרי מאוד, גמיש וקל ליישם כלי הקרנה לזיהוי של חומצות גרעין ספציפיות מסוגל להפלות בין מדינות בריאות ומחלות, פלטפורמה מצוינת לפיתוח של חדש כלי אבחון שניתן להתאים ליישומים קליניים עתידיים. ככזה, גישה זו שימש כדי לזהות את הפעילות נוקלאז נגזר סלמונלה typhimurium (להלן המכונה סלמונלה) עבור זיהוי ספציפי של חיידקים זה. בפרוטוקול הבא, אנו מדווחים על שיטה למסך עבור פעילות נוקלאז חיידקי באמצעות ניתוח קינטי.

<table><tbody><tr><td>תחתית שחורה, לא מטופלת 96 צלחת באר</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000631</td><td></td></tr><tr><td>Cytation1</td><td>BioTek</td><td>CYT1FAV</td><td></td></tr><tr><td>צינורות Eppendorf</td><td>Thermofisher</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>25922</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון אחסון קריוגני Microbank המכיל חרוזים</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>22-286-155</td><td></td></tr><tr><td>בדיקות חומצות גרעין</td><td>Biomers.net</td><td>#</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline המכיל MgCl2 ו-CaCl2</td><td>Gibco&trade;</td><td></td><td></td>14040117</tr><tr><td>סלמונלה אנטריקה. Enterica</td><td>ATCC</td><td>14028</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>10647633</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון סויה אגר עם דם כבשים דפיברין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>10362223</td><td></td></tr><tr><td>מרק סויה טריפטי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>22092</td><td></td></tr></tbody></table>

קינטי הקרנה של פעילות nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

הנוקלאוסים הם מעמד של אנזימים הנשברים חומצות גרעין על ידי מזרז את ההידרוליזה של איגרות הזרחן המקשרות בין סוכרים מריבוז. הנוקלאוטיות מציגות מגוון תפקידים פיזיולוגיים חיוניים באורגניזמים prokaryotic ו איקריוטית, החל לשמור על יציבות הגנום כדי לספק הגנה מפני פתוגנים. השתנה פעילות נוקלאז כבר שויך עם מספר תנאים פתולוגיים כולל זיהומים חיידקיים וסרטן. למטרה זו, פעילות נוקלאז הראתה פוטנציאל גדול להיות מנוצלת כמו סמנים ספציפיים. עם זאת, שיטת סינון איתנה המבוססת על פעילות זו נותרה רצויה מאוד.
בזאת, אנו מציגים שיטה המאפשרת הקרנה לפעילות נוקלאז באמצעות חומצות גרעין בדיקה כמו מצעים, עם היקף ההבחנה בין תנאים פתולוגיים ובריאים. שיטה זו מציעה את האפשרות לעצב ספריות בדיקה חדשות, עם הגדלת הספציפיות, באופן איטרטיבי. כך, סיבובים מרובים של הקרנה נחוצים כדי לחדד את עיצוב הבדיקות עם תכונות משופרות, ניצול הזמינות של חומצות גרעין כימית שונה. הפוטנציאל הניכר של הטכנולוגיה המוצעת טמון בגמישות שלה, ביכולת הגבוהה ביותר, ורב-תכליתיות עבור הקרנת פעילות נוקלאז הקשורה לתנאי מחלה. צפוי כי טכנולוגיה זו תאפשר פיתוח של כלי אבחון מבטיח עם פוטנציאל גדול במרפאה.

איור 1 מציג את זרימת העבודה של מתודולוגיה זו, אשר מחולקת לשני סיבובים הקרנה. בסיבוב הראשון של ההקרנה, השתמשנו 5 בדיקות DNA (DNA, ה-dna פולי, DNA פולי, dna פולי ו-DNA פולי G) וכן גם 5 בדיקות RNA (RNA, RNA פולי A, RNA פולי rna ו-rna פולי). את הנתונים הגולמיים של סיבוב ההקרנה ניתן למצוא בטבלה השלמה 1. בסיבוב השני, בדיקה כימית שונה היו מסונתז על ידי החלפת רצף ה-RNA עם נוקלאוטידים ששונו כימית (כל 2 '-Fluoro וכל 2 '-OMethyl) או על ידי שילוב של RNA ו purines או pyrimidines כימית שו...

פעילות נוקלאז שונה היתה קשורה לתנאים אנושיים שונים, המשמש כבסיס הפוטנציאל שלה כמו סמנים. מודולרי וקל ליישם את מתודולוגיית ההקרנה הציג בנייר זה מאפשר את הבחירה של חומצות גרעין ספציפיים בדיקה לרתימת פעילות נוקלאז כמו סמנים של מחלה.

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

פרוטוקול זה מספק חלופה רבת עוצמה לסינון פעילות גרעין כמו סמן ביולוגי של מחלה, עם מתודולוגיה קלה ליישום גם עבור חוקרים שאינם מתמחים כמו בדיקות חומצת גרעין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לבחור בדיקות חומצת גרעין שיכול לזהות פעילויות גרעין ידועות ולא ידועות, תוך ניצול האינטראקציה הדינמית של גשושית-גרעין. יתרונות נוספים של מתודולוגיה זו הם גמישותה, יכולת הרבייה הגבוהה וקלות השימוש בה.ההפגנה תבוצע על ידי חדיג'ה, סטודנטית לתואר שני, ובאריס, פוסט-דוק מהמעבדה שלנו. בעת תכנון ספריית אוליגונוקלאוטיד, כוללים לפחות דנ"א אחד ורצף אקראי אחד של רנ"א המכיל שילוב של אדנין, גואנין, ציטוצין ותיאמין או אורסיל. כדי להכין את הבדיקות oligonucleotide, לסובב את גשושי oligonucleotide lyophilized לדלל כל בדיקה במאגר טריס-EDTA בריכוז 500 picomolar לכל microliter כדי למנוע השפלה נוקלאז.לתרבות חיידקים על מדיום מוצק, יש לגלגל חרוז זכוכית נקבובי יחיד מאחסון קריוגני ישירות על צלחת תרבות אחת המכילה TSA בתוספת דם כבשים מנופח כדי לפס החוצה מושבות חיידקיות בודדות. לאחר מכן מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לתרבות חיידקית במדיום נוזלי, מעבירים מושבה אחת מתרבות בינונית מוצקה ל-50 מיליליטר של TSB עבור דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ב-200 סיבובים לדקה.למחרת, לדלל את התרבות ביחס של 1 עד 500 TSB טריים ולהחרב את החיידקים במשך 24 שעות נוספות ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סיבובים לדקה באינקובטור רועד. כדי להקים בדיקת פעילות גרעין, תחילה לחמם מראש פלואורומטר ל 37 מעלות צלזיוס בזהירות להוסיף 96 microliters של TSB סטרילי או supernatant מ סלמונלה או E.Coli נוזלי תרבות בינונית אחד 1.5 מיליליטר ללא נוקלאז צינור microcentrifuge לכל בדיקה. הוסף ארבעה microliters של פתרון עבודה בדיקה לכל צינור ולהשתמש פיפטה לערבב ביסודיות כל תוכן צינור עד פתרונות הומוגניים מושגים, דואג להימנע בועות.לאחר מכן, בזהירות לטעון 95 microliters של כל פתרון קרוב לקיר של בארות בודדות של תחתית שחורה, לא מטופלים 96 צלחת גם, דואג להימנע בועות. לאחר הוספת כל הפתרונות, כסו את הלוח ובדקו ויזואלית את המכסה לסימוני עט או אבק שעשויים להציג חפצי מדידה. כדי להגדיר את התוכנה למדידת פעילות גרעין, פתח תוכנת רכישה מתאימה.בחר קרא כעת מחלון מנהל המשימות ובחר חדש כדי ליצור את פרוטוקול המדידה הקינטית. לחץ על הגדר טמפרטורה כדי לבחור 37 מעלות צלזיוס ולאשר ולשמור את ההגדרות על ידי לחיצה על אישור. לחץ על התחל קינטיקה. בחלון המוקפץ, בחר שעתיים בתיבת הקלט זמן ריצה ושתי דקות בתיבת הקלט של מרווח הזמן לפני שתלחץ על אישור כדי לאשר ולשמור את ההגדרות.לחץ על קרא. בחלון הנפתח, בחר בעוצמת פלואורסצנטיות כשיטה לזיהוי, נקודת קצה קינטית כתב קריאה ומסננים כסוג אופטיקה. לאחר מכן לחץ על אישור. בחלון הנפתח, בחרו 'ירוק' מ'ערכת המסננים' ולחצו על הלחצן 'אשר'. בחלון פרוצדורה, בחר השתמש במכסה ולחץ על אמת.יופיע חלון מוקפץ המאשר שהפרוטוקול שנוצר חוקי. תחת תפריט פרוטוקול, בחר פרוצדורה. בחלון פרוצדורה, הגדר את הבאר שיש למדוד והזן את שם הניסוי בתיבת הקלט שם הקובץ.לאחר מכן לטעון את הלוח לתוך קורא הלוח, דואג כי הצלחת היא בכיוון הנכון ולחץ על כפתור קרא חדש כדי להתחיל את הרכישה. לניתוח נתונים, פתחו את הנתונים בתוכנת הניתוח המתאימה ובחרו אחת מה בארות הנמדדות בחלון הלוח אחד. לחצו על 'בחר בארות' וכלולו את כל הבארים שנמדדו בחלון הדו-שיח 'בחירת באר' לפני שתלחץ על 'אשר'. לאחר מכן בחרו 'נתונים' בחלון הלוח אחד כדי להמחיש את התוצאות בטבלה ולחצו על QuickExport כדי לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני.בגיליון אלקטרוני, סמן את עמודות הנתונים בהתאם לצורך עבור כל דגימה ובדיקה, והתוות את יחידות הפלואורסצנטיות היחסיות לעומת הזמן כדי שהנתונים ייצרו גרפים קינטיים. בניסוי מייצג זה, לאחר סבב ההקרנה הראשון, על-טבעי תרבות הסלמונלה דיווחו על העדפה ברורה לבדיקות RNA על פני בדיקות הדנ"א. בהתבסס על זיהוי של RNA כסוג חומצת הגרעין המועדף על ידי גרעיני סלמונלה, ספרייה חדשה RNA בלבד נועד לשמש בסיבוב השני של ההקרנה.לעומת זאת, E.Coli בתרבות פקדים בינוניים הפגינו יכולת מוגבלת מאוד להשפיל בדיקות RNA. לאחר סבב שני של הקרנה באמצעות נוקלאוטידים שעברו שינוי כימי שמטרתם להגדיל את הספציפיות של בדיקות ה-RNA, ניתן לזהות RNA pyrimidine 2'O-methyl ו- RNA purine 2'O-methyl על בסיס השינויים הכימיים שלהם כמציגים את ההתנהגות הקינטית בעלת הביצועים הטובים ביותר בהשוואה לפירמידין RNA 2'fluoro ו- RNA purine 2'fluoro בהתאמה. תוצאות אלה מצביעות על כך שלסלמונלה יש פעילות RNAse חשובה עם העדפת כימיית מצע דיפרנציאלית שניתן להשתמש בה לבחירת בדיקות המסוגלות לזהות באופן ספציפי חיידק זה.הליך זה מאפשר בחירת בדיקות שמצליחות לזהות פעילויות גרעין הקשורות לתנאי מחלה, כגון סרטן או זיהום חיידקי, ומאפשר פיתוח של כלי אבחון קליניים חדשניים.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה, אנו מדגימים את ההליך לקביעת פעילות הליקייס של חלבון מטרה כדי לשחרר את מצע dsRNA המסומן בביוטין. פעילות האנזים זוהתה על ידי ניתוח שינוי הניידות האלקטרופורטית, ואחריו בדיקת כימילומינסנציה באמצעות סטרפטווידין מצומד אנזים כימילומינסנטי.

מדידת פעילות מנחת מסוקים של חלבון מטרה באמצעות דופלקסים RNA המסומנים בביוטין

Exonucleases ממלאים תפקידים קריטיים בהבטחת יציבות הגנום. אובדן תפקוד האקסונוקלאז של WRN גורם להזדקנות מוקדמת. חקר מצעים ודרישות אחרות של הנוקלאז במבחנה יכול לעזור להבהיר את תפקידו in vivo. כאן אנו מדגימים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית מהירה וניתנת לשחזור כדי למדוד את פעילות הנוקלאז שלו.

Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר

אנו מתארים מבחנים לא רציפים רגישים מבוססי ג'ל כדי לבחון את הקינטיקה של התחלת גדיל מפגר באמצעות חלבוני השכפול של בקטריופאג' T7.

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור ביוכימית מחוץ למבחנה המשתמשת בתוויות ביוטין שעשוי להיות מתאים באופן נרחב עבור לימוד אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה.

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

NMR-מבוסס על פעילות שפותחה כדי לזהות ולאפיין מעכבי של שני אנזימים ריבוהיהידרוקלז. הפרוטוקולים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב-500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי נוזל מונה המסך, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם.

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

שיטה מקבילה מאוד למדידת המחשוף הספציפי לאתר של ה-DNA ברמת מולקולה אחת מתוארת. פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה באמצעות ההגבלה אנדונוקלאז Nde. ניתן לשנות את השיטה בקלות כדי ללמוד כל תהליך שתוצאות מחשוף DNA ספציפי לאתר.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

מחקר זה מציג בדיקת FRET רציומטרית פשוטה וידידותית למשתמש לאיתור והערכה כמותית של פעילות DNase, ומדגים את יישומו בניתוח נוקלאז חלש.

הערכת פעילות DNase על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית רציומטרית

פרוטוקול זה מתאר בדיקה ביוכימית של שינוי ג'ל למדידת פעילות FEN1 (Flap Endonuclease 1) והתפתחות מעכבים.

זיהוי מבוסס פלואורסצנטי של פעילות נוקלאז FEN1 וסינון של מעכבי מולקולות קטנות

למד שיטת סקר לפעילות נוקלאז כסמן ביולוגי למחלה באמצעות חומצות גרעין רגשים. שיטה זו מאפשרת זיהוי פעילויות נוקלאז ידועות ולא ידועות בקלות ובגמישות גבוהה.

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

גלה סרטונים נוספים