קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

פרוטוקול זה מספק חלופה רבת עוצמה לסינון פעילות גרעין כמו סמן ביולוגי של מחלה, עם מתודולוגיה קלה ליישום גם עבור חוקרים שאינם מתמחים כמו בדיקות חומצת גרעין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לבחור בדיקות חומצת גרעין שיכול לזהות פעילויות גרעין ידועות ולא ידועות, תוך ניצול האינטראקציה הדינמית של גשושית-גרעין. יתרונות נוספים של מתודולוגיה זו הם גמישותה, יכולת הרבייה הגבוהה וקלות השימוש בה.

ההפגנה תבוצע על ידי חדיג'ה, סטודנטית לתואר שני, ובאריס, פוסט-דוק מהמעבדה שלנו. בעת תכנון ספריית אוליגונוקלאוטיד, כוללים לפחות דנ"א אחד ורצף אקראי אחד של רנ"א המכיל שילוב של אדנין, גואנין, ציטוצין ותיאמין או אורסיל. כדי להכין את הבדיקות oligonucleotide, לסובב את גשושי oligonucleotide lyophilized לדלל כל בדיקה במאגר טריס-EDTA בריכוז 500 picomolar לכל microliter כדי למנוע השפלה נוקלאז.

לתרבות חיידקים על מדיום מוצק, יש לגלגל חרוז זכוכית נקבובי יחיד מאחסון קריוגני ישירות על צלחת תרבות אחת המכילה TSA בתוספת דם כבשים מנופח כדי לפס החוצה מושבות חיידקיות בודדות. לאחר מכן מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לתרבות חיידקית במדיום נוזלי, מעבירים מושבה אחת מתרבות בינונית מוצקה ל-50 מיליליטר של TSB עבור דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ב-200 סיבובים לדקה.

למחרת, לדלל את התרבות ביחס של 1 עד 500 TSB טריים ולהחרב את החיידקים במשך 24 שעות נוספות ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סיבובים לדקה באינקובטור רועד. כדי להקים בדיקת פעילות גרעין, תחילה לחמם מראש פלואורומטר ל 37 מעלות צלזיוס בזהירות להוסיף 96 microliters של TSB סטרילי או supernatant מ סלמונלה או E.Coli נוזלי תרבות בינונית אחד 1.5 מיליליטר ללא נוקלאז צינור microcentrifuge לכל בדיקה. הוסף ארבעה microliters של פתרון עבודה בדיקה לכל צינור ולהשתמש פיפטה לערבב ביסודיות כל תוכן צינור עד פתרונות הומוגניים מושגים, דואג להימנע בועות.

לאחר מכן, בזהירות לטעון 95 microliters של כל פתרון קרוב לקיר של בארות בודדות של תחתית שחורה, לא מטופלים 96 צלחת גם, דואג להימנע בועות. לאחר הוספת כל הפתרונות, כסו את הלוח ובדקו ויזואלית את המכסה לסימוני עט או אבק שעשויים להציג חפצי מדידה. כדי להגדיר את התוכנה למדידת פעילות גרעין, פתח תוכנת רכישה מתאימה.

בחר קרא כעת מחלון מנהל המשימות ובחר חדש כדי ליצור את פרוטוקול המדידה הקינטית. לחץ על הגדר טמפרטורה כדי לבחור 37 מעלות צלזיוס ולאשר ולשמור את ההגדרות על ידי לחיצה על אישור. לחץ על התחל קינטיקה. בחלון המוקפץ, בחר שעתיים בתיבת הקלט זמן ריצה ושתי דקות בתיבת הקלט של מרווח הזמן לפני שתלחץ על אישור כדי לאשר ולשמור את ההגדרות.

לחץ על קרא. בחלון הנפתח, בחר בעוצמת פלואורסצנטיות כשיטה לזיהוי, נקודת קצה קינטית כתב קריאה ומסננים כסוג אופטיקה. לאחר מכן לחץ על אישור. בחלון הנפתח, בחרו 'ירוק' מ'ערכת המסננים' ולחצו על הלחצן 'אשר'. בחלון פרוצדורה, בחר השתמש במכסה ולחץ על אמת.

יופיע חלון מוקפץ המאשר שהפרוטוקול שנוצר חוקי. תחת תפריט פרוטוקול, בחר פרוצדורה. בחלון פרוצדורה, הגדר את הבאר שיש למדוד והזן את שם הניסוי בתיבת הקלט שם הקובץ.

לאחר מכן לטעון את הלוח לתוך קורא הלוח, דואג כי הצלחת היא בכיוון הנכון ולחץ על כפתור קרא חדש כדי להתחיל את הרכישה. לניתוח נתונים, פתחו את הנתונים בתוכנת הניתוח המתאימה ובחרו אחת מה בארות הנמדדות בחלון הלוח אחד. לחצו על 'בחר בארות' וכלולו את כל הבארים שנמדדו בחלון הדו-שיח 'בחירת באר' לפני שתלחץ על 'אשר'. לאחר מכן בחרו 'נתונים' בחלון הלוח אחד כדי להמחיש את התוצאות בטבלה ולחצו על QuickExport כדי לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני.

בגיליון אלקטרוני, סמן את עמודות הנתונים בהתאם לצורך עבור כל דגימה ובדיקה, והתוות את יחידות הפלואורסצנטיות היחסיות לעומת הזמן כדי שהנתונים ייצרו גרפים קינטיים. בניסוי מייצג זה, לאחר סבב ההקרנה הראשון, על-טבעי תרבות הסלמונלה דיווחו על העדפה ברורה לבדיקות RNA על פני בדיקות הדנ"א. בהתבסס על זיהוי של RNA כסוג חומצת הגרעין המועדף על ידי גרעיני סלמונלה, ספרייה חדשה RNA בלבד נועד לשמש בסיבוב השני של ההקרנה.

לעומת זאת, E.Coli בתרבות פקדים בינוניים הפגינו יכולת מוגבלת מאוד להשפיל בדיקות RNA. לאחר סבב שני של הקרנה באמצעות נוקלאוטידים שעברו שינוי כימי שמטרתם להגדיל את הספציפיות של בדיקות ה-RNA, ניתן לזהות RNA pyrimidine 2'O-methyl ו- RNA purine 2'O-methyl על בסיס השינויים הכימיים שלהם כמציגים את ההתנהגות הקינטית בעלת הביצועים הטובים ביותר בהשוואה לפירמידין RNA 2'fluoro ו- RNA purine 2'fluoro בהתאמה. תוצאות אלה מצביעות על כך שלסלמונלה יש פעילות RNAse חשובה עם העדפת כימיית מצע דיפרנציאלית שניתן להשתמש בה לבחירת בדיקות המסוגלות לזהות באופן ספציפי חיידק זה.

הליך זה מאפשר בחירת בדיקות שמצליחות לזהות פעילויות גרעין הקשורות לתנאי מחלה, כגון סרטן או זיהום חיידקי, ומאפשר פיתוח של כלי אבחון קליניים חדשניים.