Name: אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: למדו לאפיין נשאי ממברנה מונעי פרוטון ב-E. coli באמצעות הכנת שקעי ממברנה. שיטה זו מאפשרת לכמת אפיניות לסובסטרטים ולהבין מנגנוני תחבורה בקלות רבה יותר משיטות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

התמיכה בפרויקט זה הגיעה ממכללת מוסמכים BGSU, ומשרד BGSU של תוכניות ומחקר ממומנים.

<ol><li>Haferkamp, I., Linka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+and+characterisation+of+membrane+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology+%28Stuttgart%29%22%5BJournal%5D)">Functional expression and characterisation of membrane transport proteins.</a> Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).</li>
<li>Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+Chlorella+hexose+transporter+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).</li>
<li>Sauer, N., Stolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUC1+and+SUC2%3A+two+sucrose+transporters+from+Arabidopsis+thaliana%3B+expression+and+characterization+in+baker%27s+yeast+and+identification+of+the+histidine-tagged+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein.</a> The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).</li>
<li>Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+sugar+transporters+during+seed+development%3A+molecular+characterization+of+a+hexose+and+a+sucrose+carrier+in+fava+bean+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds.</a> Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).</li>
<li>Huang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GhDREB1+enhances+abiotic+stress+tolerance%2C+delays+GA-mediated+development+and+represses+cytokinin+signalling+in+transgenic+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).</li>
<li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cells+are+not+just+green+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).</li>
<li>Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+dynamics+of+aggresome+formation+by+a+cytosolic+GFP-chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera.</a> Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).</li>
<li>Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+copper-dependent+endocytosis+and+vacuolar+degradation+of+the+yeast+copper+transporter%2C+Ctr1p%2C+by+the+Rsp5+ubiquitin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase.</a> Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).</li>
<li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li>
<li>Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+inward-rectifying+potassium+channel+by+the+Arabidopsis+KAT1+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA.</a> Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).</li>
<li>Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+plant+plasma+membrane+transporter+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes.</a> FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).</li>
<li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).</li>
<li>Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+LjSUT4%2C+a+vacuolar+sucrose+transporter+from+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).</li>
<li>Kovermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+vacuolar+malate+channel+is+a+member+of+the+ALMT+family%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family.</a> The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).</li>
<li>Blattner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), e29191(2011).</li>
<li>Takabatake, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cDNAs+encoding+mitochondrial+phosphate+transporters+in+soybean%2C+maize%2C+rice%2C+and+Arabidopis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis.</a> Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).</li>
<li>Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+transporter+for+dicarboxylates+and+tricarboxylates+in+plant+mitochondria.+Bacterial+expression%2C+reconstitution%2C+functional+characterization%2C+and+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).</li>
<li>Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tonoplast+Glu%2FAsp%2FGABA+exchanger+that+affects+tomato+fruit+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition.</a> The Plant Journal. 81 (5), (2015).</li>
<li>Kashiwagi, K., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+assays+of+polyamine+transport+systems+in+Escherichia+coli+and+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).</li>
<li>Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretion+of+putrescine+by+the+putrescine-ornithine+antiporter+encoded+by+the+potE+gene+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).</li>
<li>Tsuchiya, T., Rosen, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transport+driven+by+a+proton+gradient+and+inverted+membrane+vesicles+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li>
<li>Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+Tn10+insertion+sites+in+a+collection+of+Escherichia+coli+strains+used+for+genetic+mapping+and+strain+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).</li>
<li>Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).</li>
<li>Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+a+laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a laboratory Manual</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+biochinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using biochinic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wright, J. K., Overath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+lactose%3A+H%2B+carrier+of+Escherichia+coli+and+characterization+of+galactoside+binding+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport.</a> European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).</li>
<li>PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).</li>
<li>Kirchberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biochemical+analysis+of+the+plastidic+ADP-glucose+transporter+%28ZmBT1%29+from+Zea+mays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).</li>
<li>Deniaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+chloroplast+ATP%2FADP+transporter+in+E.+coli+membranes%3A+behind+the+Mistic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).</li>
<li>Sze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-Translocating+ATPases%3A+Advances+Using+Membrane+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles.</a> Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).</li>
<li>Bush, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-coupled+sugar+and+amino+acid+transporters+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants.</a> Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).</li>
<li>Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+membrane+vesicle+from+Escherichea+coli+prepared+by+different+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures.</a> Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).</li>
<li>Seckler, R., Wright, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sideness+of+native+membrane+vesicles+of+Escherichea+coli+and+orientation+of+the+reconstituted+lactose%3A+H%2B+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).</li>
<li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).</li>
<li>Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+effects+of+N-terminal+codon+bias+in+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes.</a> Science. 342 (6157), 475-479 (2013).</li>
<li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+in+Campylobacter+jejuni+and+its+functional+transfer+into+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli.</a> Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

במחקר הנוכחי, אנו מתווה שיטה לאפיון של האנטיפורטר על ידי הבעת הראשונה של החלבון ב -E. coli ולאחר מכן יצירת ממברנה ושלפוחיות, כך חלבון ביטא הטרוסקסואלים ניתן לקבל במערכת ללא תא. בנוסף לציוד שנמצא ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית, אסטרטגיה זו דורשת שימוש בעיתונות הצרפתית, בultracentrifuge, ובגישה למתקן לניהול רדיואיזוטופ אספלי.
דרישה בסיסית של טכניקה זו היא כי החלבון הטרוולוגי מכוון כראוי קרום פלזמה של E. coli. אסטרטגיה זו עשויה להיות גם שימושי עבור ניתוח פונקציונלי של שנאים אר...

חלבונים המעורבים בסחר של מטבוליטים מהווים רמה חיונית של רגולציה פיזיולוגית, אבל הרוב המכריע של מובילי הצמח ממברנה עדיין לא התאפיין מבחינה פונקציונלית. מספר אסטרטגיות יושמו על מנת לאפיין את החלבונים בתחבורה הרומן. הטרוולוגי ביטוי אורגניזמים כגון E. coli ו איקריוטית תאים כגון שמרים, xenopus oocytes, תאים מהיונקים, תאים חרקים ותאי הצמח כל שימשו כדי לקבוע את פעילות התחבורה שלהם1. תאים איקריוטית הם המועדף על הביטוי של חלבונים איקריוטית, כי הרכב הסלולר הבסיסי, העברת אותות מסלולים, תמלול ותרגום machineries תואמים את התנאים המקומיים.
שמרים כבר אורגניזם מודל חשוב לאפיון של חלבונים התחבורה הרומן בצמחים. הצמח הראשון של התחבורה חלבון אשר התבטא בהצלחה ב שמרים (סכמיקו פומבה) היה המוביל ההקז HUP1 מ כלורלה2. מאז, הרבה העברת צמחים חלבונים האופיינים פונקציונלית באמצעות מערכת ביטוי שמרים. אלה כוללים, הצמח מובילי סוכר (SUC1 ו SUC23, VfSUT1 ו VfSTP14) ואת מובילי האוקאין (AUX1 ו-PIN5). החסרונות של ניצול שמרים כדי לבטא חלבונים צמחיים יכולים לכלול פעילות לקויה של חלבונים מקומי פלסטיות מכיוון שמרים חסר זה אורגנל, mistargeting6, והיווצרות של אגרגטים מקופלים והפעלה של תגובות המתח שמרים בשל הבעות יתר של חלבונים ממברנה7,8,9.
ביטוי הטרוולוגי של חלבונים בתחבורה בקסנפוס אוציטים שימשו רבות לאפיון האלקטרולוגי של מובילי10. המפעל הראשון של הרכב חלבונים המאופיינת באמצעות ביטוי הטרוולוגי ב Xenopus oocytes היו ערוץ האשלגן KAT110 ו-arabidopsis טרנספורטר הקסז STP111. מאז, xenopus oocytes המועסקים כדי לאפיין רבים הובלה צמחים חלבונים כגון מובילי קרום פלזמה12, וולאר סוכרוז SUT413 ו המשלח מאלער ארמיטה ALMT914. מגבלה חשובה של Xenopus oocytes עבור התחבורה אומר הוא כי הריכוז של מטבוליטים תאיים לא יכול להיות מניפולציות1. יתר על כן, הידע המקצועי נדרש כדי להכין Xenopus oocytes והשונות של אצוות oocyte קשה לשלוט.
ביטוי הטרוולוגי באורגניזם מודל E. coli היא מערכת אידיאלית במונחים של אפיון של הרכב הרומן הייצור חלבונים. עם הגנום הרציף15, המאפיינים המולקולריים והפיזיולוגיים של E. coli ידועים היטב. כלים מולקולריים וטכניקות מבוססים היטב16. בנוסף, וקטורים ביטויים שונים, זנים שאינם פתוגניים ומוטציות זמינים17,18,19. יתר על כן, E. coli יש שיעור צמיחה גבוהה והוא יכול להיות בקלות גדל בתנאי מעבדה. חלבונים רבים ניתן להתבטא בקלות ומטוהרים בכמויות גבוהות E. coli9. כאשר חלבונים לא יכולים להיות ישירות במערכות הסלולר, החוקה של חלבונים לתוך ליפוזומים גם היה מוצלח, אם כי מאתגר חדשנות לאפיון של חלבונים קרום מטוהרים. אפיון פונקציונלי של הובלה מיטוכונדריאלי של הצמח חלבונים כולל מובילי מסיסות כגון מובילי פוספט סויה, תירס, אורז, arabidopsis, dicarboxylate אוחר-tricarboxylate המוביל ב arabidopsis הושגה באמצעות מערכת זו מודל20,21. עם זאת, רקומביננטי חלבונים של חלבון העגבניות SICAT9 נמצאו לא פונקציונלי בניסויים מחדש, וחברים אחרים של משפחת טרנספורטר החתול נמצאו לא פונקציונלי ב xenopus oocyte בחני22. לכן, יש צורך בכלים מולקולריים נוספים לאפיון מובילי הקרום.
חמש מערכות תחבורה פוליאמין. נמצאו ב -אי קולי23 הם כוללים שני מובילי ABC מדיה ספיגה של spermidine וריקבון, מחליף ריקבון/הצפרים, מחליף cadaverine/ליזין, היצואן spermidine ומייבא ריקבון. הריקבון מחליף PotE היה מאופיין באמצעות שלפוחית הזרע, שם הפנים החוצה הוכנו על ידי לישיתאים עם העיתונות הצרפתית ומדידת ספיגה של הריקבון לתוך השלפוחיות בתמורה הצפרים24. ושלפוחית מספרת שימשו גם כדי לאפיין מוביל סידן, אשר מתווך את ההובלה של סידן בתגובה למעבר פרוטון25. ניסויים אלה התבקשו מאיתנו לפתח אסטרטגיה לאפיון של מחליפי פוליאמין אחרים. בתחילה יצרנו זן של אי קולי חסר. בחומר מחליפי החומר כאן, אנו מדגימים את האפיון התפקודי של צמח פוליאמין antiporter על ידי הביטוי הטרוולוגי במתח שהשתנה E. coli , הדור של שלפוחיות קרום באמצעות העיתונות הצרפתית, וקרינה assays.

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3H-putrescine</td><td>PerkinElmer</td><td>NET185001MC</td><td></td></tr><tr><td>3H-spermidine</td><td>PerkinElmer</td><td>NET522001MC</td><td></td></tr><tr><td>4-chloro-1-naphthol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8890</td><td></td></tr><tr><td>14C ארגינין</td><td>Moravek Inc.</td><td>MC137</td><td></td></tr><tr><td>Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-His (C-term)-HRP נוגדן</td><td>ThermoFisher</td><td>R931-25</td><td>מזהה את תג הפוליהיסטידין C-terminal (6xHis), דורש את קבוצת carboxyl החינמית לזיהוי</td></tr> ערכת בדיקת חלבון <tr><td>Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Pierce BCA protein asay ערכת.</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0404</td><td></td></tr><tr><td>Carboxypeptidase B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9584-1mg</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Sorvall</td><td></td><td>SS-34 רוטור זווית קבועה ורוטור זווית קבועה GA-6</td></tr><tr><td>מטחנת רקמות Dounce</td><td>LabGenome</td><td>7777-7</td><td>Corning 7777-7 הומוגנייזר פיירקס עם פיית מזיגה.</td></tr><tr><td>Ecoscint-H</td><td>National Diagnostics</td><td>LS275</td><td>קוקטייל נצנוץ</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סעפת סינון</td><td>Hoefer</td><td>FH225V</td><td></td></tr><tr><td>תא לחץ צרפתי</td><td>גלן מילס</td><td>FA-080A120</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G6904</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת</td><td></td><td></td> Glycerol <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> GraphPad Prism<a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a><tr><td>מי חמצן</td><td>KROGER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>מונה נצנוץ נוזלי</td><td>בקמן</td><td>LS-6500</td><td></td></tr><tr><td>Maleate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנני ממברנה ניטרוצלולוז</td><td>Merck Millipore</td><td>ב-0.45</td><td>ומיקרו; ערכת</td></tr><tr><td>ניקוי M PCR</td><td>Genscript</td><td></td><td>QuickClean II</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>ThermoFisher</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>putrescine</td><td>fluka</td><td>32810</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>J.T.Baker</td><td>4008</td><td></td></tr><tr><td>זני ספרמידין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2501</td><td></td></tr>: <tr><td>E. coli ודלתא; potE740(del)::kan, &delta; cadB2231::Tn10</td><td>כתב יד זה</td><td>זמין לפי בקשה.</td><td>הזן חסר במחליפי פוליאמין PotE ו-CadB.</td></tr><tr><td>מוצרי מחקר</td> <td>Tris-base</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>Sorvall MTX 150</td><td>46960</td><td>Thermo Fisher S150-AT רוטור זווית קבועה</td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה</td><td>ThermoFisher</td><td>45237</td><td>צינורות צנטריפוגה לרוטור S150-AT</td></tr><tr><td>וקטור: pBAD-DEST49</td><td>וקטור ביטוי ThermoFisher</td><td></td><td>Gateway עבור E. coli</td></tr></tbody></table>

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -e. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

מספר שיטות פותחו כדי לאפיין פונקציונלית שנאים ממברנה הרומן. Polyamines נמצאים בכל מקום בכל האורגניזמים, אבל מחליפי פוליאמין בצמחים לא זוהו. כאן, אנו לתאר שיטה לאפיון האנטיאמין נוגדי סבלים באמצעות ממברנה שלפוחית שנוצר מן הליזה של התאים קולי של es, הטרוסקסואלים המביעים באופן מצער צמח antiporters. ראשית, אנו הAtBAT1 באופן מאוד הביע מאמץ של E. coli לקוי של המרת פוליאמין ו ארגינין מובילים. שלפוחיות הופקו באמצעות מכבש צרפתי, מטוהרים על ידי משתמשים בשיטת סינון ממברנה ומנוצל באמצעות מדבקות של מצעים המסומנים כדי להדגים את ספציפיות המצע של המוביל. מאמר זה הוכיח כי AtBAT1 הוא מוביל פרוטונים בתיווך של ארגינין, חומצה γ-עמינח בוטירית, בריקבון ובספרצין. זן מוטציה שפותחה עבור הטיפול של AtBAT1 עשוי להיות שימושי עבור ניתוח פונקציונלי של משפחות אחרות של צמח ובעלי חיים מחליפי פוליאמין. כמו כן ההשערה שניתן להשתמש בגישה זו כדי לאפיין סוגים רבים אחרים של סבלים, כל עוד חלבונים אלה יכולים להתבטא בקרום התא החיידקי. E. coli היא מערכת טובה לאפיון של מובילי הרומן, שכן ישנן שיטות מרובות שיכולות להיות מועסקים לטרנספורטי מוטייז.

השלבים העיקריים בפרוטוקול זה מסוכמים תמונה באיור 1. בקצרה, E. coli תאים חסרים כל מחליפי פוליאמין והבעת AtBAT1 הם מתורבתים, centrifuged, שטף עם מאגר נתון לפירוק תאים באמצעות עיתונות צרפתית. לוליזיס נוטה לייצר שלפוחיות כי הם בעיקר בתוך החוצה ללכוד את המאגר מחוץ לתאים. פסולת תא מוסרת על-ידי צנטריפוגה, וצעד נוסף של הארכה משמש לאיסוף גלולה ממברנה. את הגלולה ממברנה מושעה מחדש Tris-מלפיאט מאגר pH 5.2 ומאוחסן ב-80 ° c. ההובלה מתבצעת ב-12 ° c, אשר נמ...

אנו מתארים שיטה לאפיון של מובילי הממברנה המונעת על ידי פרוטון בתכשירים ושלפוחית ממברנה המיוצרים על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli והליזה של תאים באמצעות עיתונות צרפתית.

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו לאפיון מובילי ממברנה הוא שאתה יכול לקבוע את הזיקה היחסית של המשגר עבור מצעים ספציפיים, כמו גם לקבל תובנה על מנגנון התחבורה. האפיון של חלבוני קרום המשתמשים שיפוע חלבון כדי לנהוג הובלת מצעים מתאים במיוחד זה מקדם וריתוך החוצה שאנו מדגימים כאן. בעוד שחקירה זו דורשת ציוד מיוחד כגון עיתונות צרפתית וגישה לאולטרהצנטריפוגה, אנו חושבים שזה עשוי להיות קל יותר מבחינה טכנית מאשר בדיקות הדורשות הובלות קרום כדי להיות מחדש לתוך ליפוזומים מלאכותיים.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לכמת את הזיקה היחסית למצעים שונים ולעשות מבחן תחרות כדי לבחון את ההשפעה של מצעים מתחרים על סורגים תחבורה. במקרה של טרנספורטר BAT1 המשמש להמחשת הנחיה זו, הצלחנו גם להראות הפעלת מצע של המשגר על ידי ארגינין. כדי להתחיל בהליך זה, תרבות תאי מוטציה E.coli מוכן המבטאים את חלבון היעד על ידי חיסון מושבה אחת בחמישה מיליליטר של פוליאמין 3 מדיה עם אנטיביוטיקה מתאימה וגדל אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס.למחרת, להעביר את התרבות הזאת 500 מיליליטר של פוליאמין טרי 3 מדיה כי הוא הוסיף עם 0.0002% arabinose ולגדול עד שתרבות התא מגיע OD600 של בין 0.6 ו 0.8. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 2000 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לאסוף את גלולת התא. להשעות מחדש את גלולה ולשטוף אותו שלוש פעמים עם חיץ אחד על ידי צנטריפוגה ב 2000 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בכל פעם.הנפח הסופי של תאים במאגר אחד אחרי הסיבוב השלישי צריך להיות 10 מיליליטר. הגדר תא לחץ צרפתי 35 מיליליטר ויוצקים את ההשעיה התא לתוך הגוף של התא. הפעל את המחשב באמצעות המתג ב- RHS בחלק האחורי של היחידה והגדר את מתג בורר היחס כגבוה.הפעל את מתג המשאבה. הבוכנה תתחיל לעלות מהבסיס כדי לעקור את האוויר בתא. להגביר את הלחץ על ידי הפיכת שסתום להגביר את הלחץ בכיוון השעון עד המד מגיע 640 PSI.זה ייצור לחץ פנימי של 10,000 PSI. לאחר התא הגיע ללחץ היעד, לפתוח את הרכבה שסתום זרימה מעט על ידי הפיכתו נגד כיוון השעון. התאם את פתיחת השסתום כדי לאפשר קצב זרימה של כ -10 טיפות בלבד לדקה.כאשר קו העצור בגוף הבוכנה מגיע לראש תא הזרימה, לכבות את מתג המשאבה. הנך את הלוח התחתון על-ידי מיקום מתג בורר היחס למטה ולאחר מכן, הגדרת מתג המשאבה. כאשר הצלחת התחתונה נסוגה לחלוטין, להפחית את לחץ המערכת לאפס על ידי הפיכת שסתום להגביר את הלחץ באופן מלא נגד כיוון השעון.כבה את מתג המשאבה כבה את המחשב. צנטריפוגה העיתונות הצרפתית eluant ב 10, 000 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להסיר תאים שבורים ופסולת תאים. השליכו את גלולת הכדור והעברו את העל-טבעי לצינורות אולטרה-מרכזיים.Ultracentrifuge העל וכתוצאה מכך ב 150, 000 פעמים G ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי גלולה ורי הווסיקים קרום. לשטוף את ורי הממברנה פעם אחת ללא השעיה מחדש במאגר 2. לאחר מכן, השתמש מטחנת רקמת Dounce כדי להשעות מחדש את ארס הממברנה במאגר 2.הכינו 100 אליקוטים מיקרוליטרים של ההכנות לממברנה בצינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ואחסנו אותם במינוס 80 צלזיוס. ראשית, לשטוף ולהשעות מחדש את ורידים ב 30 מילימולר של טריס ב pH 7.8, המכיל 0.1 מילימולר של קובלט II כלוריד. הוסף מיקרוליטר אחד של carboxypeptidase A נתרן כלורי, טריס, קובלט II כלוריד לכל מדגם 100 microliter.דגירה ב 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הוסף חמישה microliters של פתרון המכיל נתרן EDTA ו 2-Mercaptoethanol ב PH 7.5 כדי לעצור את העיכול. להדק את הפתרון בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת כדי להשבית לחלוטין את האנזים.לאחר מכן, להוסיף בין חמישה ל 10 microliters של פתרון המכיל ליתיום dodecyl סולפט, גליצרול, ברומופניול כחול, ו טריס ב pH 7.5 כדי 100 microliters של המדגם ולנתח דגימות על ידי אלקטרופורזה. כדי לבצע סופג אמינו, להניח מסנן nitrocellulose לח עם 25 מילימולר נתרן מימן פוספט על ג'ל פוליאקרילמיד. מניחים אותם בין שני מסנני תאית לחים, ולבסוף, בין שני רפידות סריקת פלסטיק לחות.מניחים את המכלול הזה בין האלקטרודות של תא המכיל 25 מילימולר נתרן מימן פוספט בטמפרטורה שבין שתיים לארבע מעלות צלזיוס. אלקטרונים מפעימות את החלבונים ב-20 וולט וב-2-3 אמפר למשך שלוש שעות. לחסום את קרום nitrocellulose בחסימת חיץ לילה בשתי מעלות צלזיוס.למחרת, דגירה nitrocellulose ב 20 מיליליטר של אחד עד 5, 000 דילול של נוגדן HRP C-מסוף שלו חוצץ חסימה במשך שעתיים לשטוף פעמיים עם 50 מיליליטר של חיץ במשך סך של 60 דקות. כדי לדמיין את כתם האמינו, להמיס שישה מיליגרם של 4-כלורו-1-naphthol ב 20 מיליליטר של אלכוהול denatured ולהוסיף 80 מיליליטר של 15 מילימולרים טריס ו 50 microliters של 30% מי חמצן. לרחוץ את נייר המסנן בתסומה זו מצע במשך 20 דקות.כאשר התפתח צבע מספיק, שוטפים את הממברנה במים ומאפשרים לה להתייבש. כדי להתחיל, דגירה 100 aliquot microliter של ורי ממברנה ב 12 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הוסף מאגר 3 המכיל פוליאמינים radiolabeled בריכוז סופי של 50 מיקרומולרים וריסקי הממברנה ב 1.5 צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר ליזום תחבורה.נהל את הובלה ב 12 מעלות צלזיוס לדקה אחת. לאחר מכן, להעביר את תערובות התגובה לסעפת סינון ולסנן אותו דרך מסנן קרום חנקן 0.45 מיקרומטר. הוסף שלושה מיליליטר של חיץ אשד קר כקרח המכיל ריכוז גבוה פי עשרה של פוליאמינים ללא תווי קרח, ואחריו שלושה מיליליטר של חיץ התזה ללא הפוליאמינים כדי להפחית את הכריכה הלא ספציפית.מעבירים את המסננים השטופים ל-20 בקבוקונים חד פעמיים חד פעמיים המכילים 10 מיליליטר של נוזל תכלת, ולהשתמש בדלפק תבליט נוזלי כדי לקבוע את הרדיואקטיביות. חשב את ספיגת הפוליאמין נטו כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לקבוע את הק"מ עבור המצע על ידי מדידת ספיגת מצע radiolabeled לתוך וויסקלים המבטאת את חלבון היעד ולחשב את קינטיקה מיכאליס-מינטן בשיטת רגרסיה לא ליניארית.לניסויי התחרות, הוסיפו את המצע התחרותי שאינו מסומן במאגר ההתרשמות לצינור הצנטריפוגה המכיל 100 מיקרוליטרים של יבלות ב-12 מעלות צלזיוס ובו זמנית הוסיפו 50 מיקרומולרים של הפוליאמין עם הבליטה. למדוד את הרדיואקטיביות לכוד בתוך ורייקים כפי שתואר קודם לכן. לקבוע KM הורה עבור מצעים תחרותיים על ידי מדידת ספיגת פוליאמינים radiolabeled ואת הנוכחות של 100 micromolar או מצע לא שכותרתו גבוהה יותר ולהשתמש בשיטת רגרסיה לא ליניארית כדי להתוות את העקומה.במחקר זה, אנטי סבל מאופיין תחילה על ידי הבעת החלבון ב- E.coli, ולאחר מכן, יצירת ורי ורי ממברנה, כך החלבון לידי ביטוי הטרולוגית ניתן להתביג במערכת ללא תאים. כתם מערבי משמש כדי לוודא כי AtBAT1 הוא טרנסלוקציה לוורס. בדיקת הכתם בנוגדן אנטי-מסוף C שלו גילתה חלבון מבנה היתוך שהוא כ-72.3 קילודלטונים.עיכול של ורידים לפני SDS-PAGE הביא לירידה, אבל לא אובדן מוחלט של אות החללית. ב 12 מעלות צלזיוס, ספיגת זרע radiolabeled על ידי הווסיקים הוא הגבוה ביותר בדקה אחת ונשאר ליניארי על פני שלוש דקות. לכן, זמן הדגירה של מתקן ההובלה קבוע בדקה אחת.לאחר דקה אחת, אין ספיגת נטו של איזוטופ על ידי ורי ממברנה שהוכנו ומאוחסנים ב- pH 8.0 מכיוון שאין שיפוע פרוטונים על פני קרום הווסקל. כדי להדגים את ההשפעה של פיזור של שיפוע פרוטון מלאכותי, ורי הווסיקים קרום הם דגירה pH 8.0 חיץ במשך 10 דקות לפני הוספת מצע שכותרתו, המוביל ספיגה מינימלית של מצע radiolabeled. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך ספיגה מונחה פרוטון של זרע נובע חלבון BAT1.כדי לקבוע את הספציפיות של המצע של החלבון, ערכי ק"מ מחושבים על ידי מדידת ספיגת מצע radiolabeled בריכוזים שונים. ערכי ק"מ עבור זרע, putrescine, ארגינין עולה כי חלבון זה הוא פוליאמין זיקה גבוהה מחליף ארגינין. אהדה של המשגר למצע מסוים יכולה להיקבע בעקיפין גם באמצעות מרשם תחרות.אלה assays לחשוף כי גאבא הוא מעכב תחרותי של זרע. יתר על כן, מדידת ספיגת 50 micromolar של זרע radiolabeled בנוכחות ריכוזים משתנים של חומצות אמינו שונות מגלה כי AtBAT1 הוא גם מסוגל להעביר גלוטמט ואלנין בריכוזים מילימולרית. בעת ביצוע הליך זה, השילוב של טרנספורטר הממברנה לתוך קרום חיידקי הוא, כמובן, קריטי.אימות כי חלבון העניין משולב בקרום יכול להיעשות באמצעות נוגדנים המכוונים נגד תגי C-terminal. וריאציה גנטית של מובילים אנושיים יכולה להשפיע על ההובלה של, שניהם, מטבוליטים ותרופות כי הם מצעים של טרנספורטר מסוים. לכן, וריאציה allelic יכול להשפיע, הן, ספיגה הפרשה של תרופות.גרסאות אליליות רבות יכולות להתבצע במהירות על ידי מוטגנסיס מכוון צדדית של גן המשגר בווקטור ביטוי. לאחר מכן ניתן לבדוק בדיקות פונקציונליות של גרסאות אלה בתנאים מבוקרים מאוד באמצעות בדיקות ווסקליות מבפנים החוצה. טרנספורטרים ממברנה מהווים שמונה עד 10 של כל החלבונים ורובם לא התאפיינו לחלוטין באף אחד האורגניזמים מודל.מובילים מקומיים קרום organelle מאתגרים במיוחד לאפיין על ידי ביטוי הטרולוגי בתאים אוקריוטיים. אם ניתן להפוך את משגרי ההחלפה או המשגרים בניווי הפרוטון לממברנה זו של E.coli, ניתן לאפיין מובילים אלה באופן פונקציונלי באמצעות הבטחה זו במבחנה. האיכות והתפוקה של זיקיקים מושפעת מקצב האלוטיון של שברי תאים מהעיתונות הצרפתית.בעשיית בדיקות תחבורה של וריקלים עם איזוטופים, חשוב שיהיה מערך ניסיוני המאפשר ביצוע שכפולים ניסיוניים. ישנן דרכים רבות לעשות זאת, אך אנו חושבים שזה יעזור לנו להראות לך כיצד עשינו זאת.

characterization-membrane-transporters-heterologous-expression-e-coli

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בפרוטוקול הזה אנחנו מדגימים את הביטוי, solubilization, וטיהור של חלבון קרום הביע recombinantly, MexB, כפי מורכב חלבון מסיס חומר ניקוי. MexB היא התנגדות הממברנה multidrug טרנספורטר מן החיידק Pseudomonas aeruginosa אופורטוניסטית הפתוגן.

הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

גישה יעילה לבדיקות סקר לאיתור הביטוי של חלבונים בממברנה רקומביננטי בcoli Escherichia מבוסס על היתוך לחלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

מוצג פרוטוקול לייצור, טיהור ושימוש בשלפוחיות ממברנה חיצוניות ארוזות אנזימים (OMV) המספק יציבות אנזימים משופרת ליישום ביישומים מגוונים.

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

הציגו כאן הם פרוטוקולים ליצירת פפטיד מבוסס unilamellar שלפוחיות קטנות מסוגל לצמיחה. כדי להקל על ייצור vesiculo של פפטיד הממברנה, אלה שלפוחיות מצוידות עם תמלול-תרגום מערכת ו-פפטיד קידוד פלמיד.

ב והשרירים סינתזה של ממברנות פפטיד הפרה עבור הצמיחה שלפוחית אוטונומית

החדרה משותפת לננו-דיסקים שנוצרו מראש מאפשרת לחקור חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים בסביבות שומנים מוגדרות ללא מגע עם חומרי ניקוי. פרוטוקול זה מתאר את הכנת רכיבי המערכת החיוניים ואת הפרמטרים הקריטיים לשיפור יעילות הביטוי ואיכות הדגימה.

החדרה משותפת של חלבוני ממברנה לננו-דיסקים מוכנים מראש

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ללא תאים לייצור פרוטאוליפוזום באיכות גבוהה בשיטת דו-שכבתית-דיאליזה באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה וליפוזומים. שיטה זו מספקת אמצעים מתאימים לניתוח פונקציונלי של חלבוני ממברנה, סינון מטרות תרופות ופיתוח נוגדנים.

ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מפורטת לייצור חיידקים של חלבונים רקומביננטיים, כולל חלבונים המכילים בדרך כלל קשרים בלתי מסיסים או דיסולפידים, ארוזים בתוך שלפוחיות חוץ-תאיות הקשורות לקרום. יש לכך פוטנציאל להיות מיושם בתחומים מגוונים של מחקר מדעי, כולל ביוטכנולוגיה יישומית ורפואה.

ייצור וניתוח אופטימליים של בועיות מלאות חלבון רקומביננטי מאי-קולי

פרוטוקול זה מתאר את שיטת התחליב ההפוך המשמשת לתמצת מערכת ביטוי ללא תאים (CFE) בתוך שלפוחית חד-למלרית ענקית (GUV) לחקר הסינתזה והשילוב של חלבון קרום מודל בדו-שכבתי השומנים.

הרכבה מחדש של תעלת קולטן הגלוטמט החיידקי על ידי אנקפסולציה של מערכת ביטוי ללא תאים

למדו לאפיין נשאי ממברנה מונעי פרוטון ב-E. coli באמצעות הכנת שקעי ממברנה. שיטה זו מאפשרת לכמת אפיניות לסובסטרטים ולהבין מנגנוני תחבורה בקלות רבה יותר משיטות מסורתיות.

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

גלה סרטונים נוספים