Name: בידוד של מקרופאג קבוצות מערכות ותאים סטרומה מתוך שריר הלב של האדם והעכבר דגימות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: למד לבודד מקרופאגים ותאי סטרומה משור הלב של אדם ועכבר באמצעות עיכול אנזימטי וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת חקר מגוון תאי החיסון בדלקת ובתיקון הלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה התאפשר על ידי מימון המסופק ממכון גילוי הילדים של אוניברסיטת וושינגטון וביה לילדים סנט לואיס (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), הקרן של בארנס-בית חולים יהודי (8038-88), ו NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. נתמך על ידי NIH K08 HL123519 ובורוז קרן ברוך הבא (1014782).

הפרוטוקול המוצג אושר על ידי אוניברסיטת וושינגטון בלוח הסקירה המוסדי של סנט לואיס (#201305086). כל הנושאים מעניקים הסכמה מושכלת לפני איסוף המדגם והניסויים מתבצעים בהתאם לפרוטוקול הלמידה המאושר. הפרוטוקול המוצג מבוצע עם אישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש באוניברסיטת וושינגטון בבית הספר לרפואה וכדלקמן ההנחיות המתוארות במדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. הכנת דגימות של רקמת לב האדם
<ol><li>פלאש הסבר לבבות על ידי cannulating השמאלי והימני של עורק העורקים הכליליים ואת מבשם עם 200 mL של תמיסת מלח קר.</li>
	<li>ריקון הרקמות האפימיות של LVAD על ידי canנולגאת כלי הקיבול ומבשם עם 50 mL של תמיסת מלח קר.</li>
	<li>מנתח רקמות הדגימה מן הקיר פסגה או לרוחב של החדר השמאלי בתמיסת מלח קר או hbss באמצעות מספריים סטרילי.</li>
	<li>בזהירות לנתח את שומן אפיארdial וכורתיים מתוך הדגימה באמצעות מספריים עדינים.</li>
	<li>נתח נתחי רקמות לחתיכות במשקל כ 200 מ ג עם עזרה של להב סטרילי או מספריים.</li>
</ol>2. הכנת לב העכבר
<ol><li>המתת חסד העכבר על ידי שיתוף2 חנק או נקע בצוואר הרחם.</li>
	<li>פתח את חלל החזה בעזרת מספריים חדים. השתמש במכשיר קהה. כדי להרים את הלב כלפי מעלה מבשם הלב עם ה-PBS הקרה באמצעות מחט של 25 גרם המצורפת למזרק של 5 מ ל. מעשה עד שהלב מופיע בצבע.</li>
	<li>הסר את הלב והמקום בצלחת פטרי סטרילית על הקרח.</li>
</ol>3. הכנת תא יחיד הבולם
<ol><li>מניחים נתחי רקמת לב אנושיים (~ 200 מ"ג) או לב מורין בצלחת פטרי סטרילית. שימוש דק ברקמה או במספריים סטריליים.</li>
	<li>הגדר את העיכול:<ol>
<li>השתמש בנפח העיכול הסופי של 3 מ ל לחלק רקמת הלב האנושית (200 mg) או ללב מורין אחד. ריכוזי האנזים הסופיים הם כדלקמן: Collagenase1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hyaluronidase (60 U/mL).</li>
		<li>עבור כל תגובת עיכול להוסיף DMEM ואת כל האנזימים ל 15 מ"ל צינור חרוט. בעזרת מלקחיים נקיים, מניחים את הרקמה הקצוצה לתוך כל צינורית התגובה. מערבבים היטב על ידי הורטקנג עדין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מעכל עבור 1 h ב 37 ° c בחממה רועדת מוגדר מהירות נמוכה עד בינונית.</li>
	<li>לאחר 1 שעות של עיכול, להוציא את הצינורות מתוך החממה ומקום על הקרח. הגדר את 50 mL חרוט צינורות עם מסננת תא 40 יקרומטר על גבי. להרטיב את המסננים עם 2 מ ל של הפסקת אנזימים (ED) מאגר.</li>
	<li>לנטרל את אנזימי העיכול על ידי הוספת 8 מ ל של מאגר ED לכל צינור עיכול. לאחר מכן יוצקים את כתוצאה 13 ml שילוב כולל דרך מסננת תא 40 יקרומטר לתוך הצינורות החרוטי 50 mL. העבר את הדגימות חזרה בצינור החרוט החדש של 15 מ"ל. זה מאפשר להתאים את התא אופטימלית וממזער את אובדן התאים במהלך צנטריפוגה.</li>
	<li>לסובב את דגימות ב 400 x g עבור 6 דקות (צנטריפוגה להגדיר ב 4 ° c). להיפטר supernatant עוזב 0.5 mL של מדיה. השהה מחדש את הגלולה על ידי ליטוף עדין והוסף 1 mL של מאגר הליזה ACK. בעדינות מערבולת הצינור והדגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות לבצע הליזה תא דם אדום (RBC).</li>
	<li>לאחר 5 דקות במאגר ACK, הוסף 9 מ"ל של DMEM למדגם. לשים את המכסה בחזרה על הצינורות בעדינות להפוך את הצינורות לערבב, ולסנן דרך מסננת תא 40 יקרומטר. לאסוף את פילטרט ב 15 מ"ל שפופרות חרוט.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x g עבור 6 דקות ולהיפטר supernatant.</li>
	<li>הוסף 1 מ ל של מאגר FACS והשהה מחדש את הגלולה. לאחר מכן העבירו את התאים במאגר FACS לשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. צנטריפוגה שוב ב 400 x g עבור 5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה ב 100 μl של מאגר facs. השעיית תא בודד מוכן כעת לצביעת נוגדנים.</li>
</ol>4. מכתים את הנוגדן
<ol><li>פאנל הנוגדן האנושי טיפוסי מורכב של נוגדנים הבאים: CD45-PercpCy 5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. נא פנה לטבלה 1. הוסף את כל הנוגדנים לדגימות הלב ב-1:50 דילול ו-דגירה עבור ~ 30-40 דקות ב 4 ° c בחושך. המשך לשלב 4.4 למטה.</li>
	<li>עבור תאים סטרומה (תאים אנדותל, פיברובלסט, תאי שריר חלק), הוסף DRAQ5 (1 הריכוז הסופי μM) ו-CD45-percpCy 5.5. נא פנה לטבלה 1. המשך 30 דקות ב -4 ° c בחשכה. המשך לשלב 4.4 למטה.</li>
	<li>עבור מקרופאגים לב מורלין להוסיף את הנוגדנים הבאים: CD45-PercpCy 5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421, ו Ly6G-FITC. . אנא פנה לשולחן 2 הוסף את כל הנוגדנים לדגימות הלב ב-1:100 דילול ו-דגירה עבור ~ 30-40 דקות ב 4 ° c בחושך. המשך לשלב 4.4 למטה.</li>
	<li>שטוף את הדגימות פעמיים במאגר FACS. עבור כל כביסה, להוסיף 1 מ ל של מאגר FACS, בעדינות מערבולת, ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות, להשעות מחדש ב 350 μl של מאגר facs ולהוסיף dapi (1 μm, ריכוז סופי). הדגימות מוכנות כעת לניתוח/מיון של FACS.</li>
</ol>

<ol><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), e36814(2012).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+facilitate+electrical+conduction+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages facilitate electrical conduction in the heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+macrophages+promote+diastolic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).</li>
<li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li>
<li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li>
<li>Dick, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewing+resident+cardiac+macrophages+limit+adverse+remodeling+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction.</a> Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).</li>
<li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפרוטוקול מאפשר חילוץ של תת קבוצות ממקרופאג שונות משריר הלב האנושי. הפרוטוקול הוא פשוט ולוקח 3 כדי 4 שעות כדי להכין ההשעיה תא יחיד מוכן ניתוח FACS. למרות שהפרוטוקול הוא פשוט יחסית לביצוע, ישנם היבטים טכניים מסוימים שצריך להיחשב שיצמצם את השונות. ראשית, עבודה בזמן האופנה עם רקמת האדם היא הכרחית עבור הכדאיות האופטימלית של תאים. חשוב לשמור את הרקמה מלוחים קר/HBSS כדי למזער את מוות התאים. יש צורך גם להסיר שומן אפיארדיאל ורקמת חיבור אחרים מתוך הדגימה שריר הלב. הרקמות וזמני העיכול העקביים של הרקמה תפחית את הדגימה מהווריאציה לד...

מקרופאגים מייצגים את הסוג הנפוץ ביותר התא החיסונית בלב, והם משחקים תפקידים משמעותיים ביצירת מענה דלקתי ומשנה תגובות בעקבות פגיעה לב1,2,3,4. בעבר, הקבוצה שלנו זיהה שתי קבוצות מערכות מרכזיות של מקרופאגים בליבו של מוראו נגזר ממקורותהתפתחותיים ברורים 5,6. באופן כללי, אוכלוסיות נפרדות של הרקמה תושב מקרופאג מערכות המשנה הלב יכול להיות מזוהה מבוסס על הביטוי משטח התא של CCR2 (C-C מוטיב קולטן כימוקין 2). CCR2- מקרופאגים (משטח התא ביטוי: CCR2-MHCIIנמוך ו CCR2-mhciiגבוה) הם של מוצא עובריים (פרימיטיבי ואריטרומטיות לינאואיד), מסוגל לחדש את עצמו, ולייצג אוכלוסייה דומיננטית תחת תנאים הומסטטיים. תושב CCR2+ מקרופאגים הם של מוצא מוחלט המטופאות, נשמרים באמצעות גיוס מתוך במחזור מונוציטים, ומייצגים אוכלוסיה קטין תחת תנאים הומסטטיים. פונקציונלית, CCR2- מקרופאגים ליצור דלקת מינימלית הם קריטיים להתפתחות כלילית בלב התחדשות הלב5,7. לעומת זאת, CCR2+ מקרופאגים ליזום תגובות דלקתיות חזקים בעקבות עלבונות לב ולתרום לפציעה קרדיולוגית מודלקת, שיפוץ לוואי של החדר השמאלי, ואת אי ספיקת לב התקדמות8,9.
לאחרונה, הצגנו שריר הלב האנושי גם מכיל שתי קבוצות מערכות נפרדות של מקרופאגים המזוהים באופן דומהגם CCR2 או CCR2+8. ביטוי גנים וניתוחים פונקציונליים חשף כי האדם CCR2- ו CCR2+ מקרופאגים לייצג תת מערכות מבחינה פונקציונלית ו הם אנלוגית פונקציונלית CCR2- ו CCR2 מקרופאגים נמצא בלב העכבר. האדם CCR2- מקרופאגים לבטא רמות עמידות של גורמי גדילה, כולל IGF1, Pdgf, Cyr61, ו-HB-egf. CCR2+ מקרופאגים מועשרים נוגדנים ו ציטוקינים המעודדים דלקת, כגון il-1b, il-6, ccl-2, ccl-7, ו-tnf-a. מגורה CCR2+ מקרופאגים להפריש רמות גבוהות במידה ניכרת של ציטוקינים דלקתיות interleukin-1β (IL-1β) בתרבות. כיצד ערכות המשנה הללו לתרום באופן מהותי לתיקון רקמות ושמאלית חדרית (LV) שיפוץ בהקשר של פציעה בלב נשאר שטח של מחקר פעיל.
זרימה-cyמקרופאג try ניתוח מבוסס של טרוגניות בעכבר וללב האדם דורש לעכל את רקמת הלב ויצירת השעיית תא יחיד ואחריו הניתוח cy, מיון התא עבור תהליכים נוספים במורד הזרם כגון בצובר ברצף RNA/תא יחיד RNA רצפי או culturing תאים עבור assays פונקציונלי. הפרוטוקול המקורי לביצוע השעיית תא בודד מלבבות מורדין דווחו לראשונה על ידי קבוצת נחרנדורף בנחדורף ואח '. 200710. המעבדה שלנו הותאמה ושינתה את הפרוטוקול לחלץ מקרופאגים משריר הלב האנושי. באמצעות הפרוטוקול אותו אך עם שינוי קל בצביעת והערכה, התאים CD45- סטרומה משריר הלב האנושי וניתן גם לקצור. מוצג כאן, בטקסט ובווידאו, הוא פרוטוקול המתבצע באופן שגרתי עבור חילוץ של מקרופאגים או סטרומה משריר הלב האנושי.
דגימות של רקמות לב מתקבלים מחולים מבוגרים עם שריר הלב מורחבים (DCM: אידיופטית או משפחתית) או מחלת שריר הלב (ICM) שעברו שמאל חדרית לסייע המכשיר (LVAD) השרשה או השתלת לב. לבבות הסבר או ליבות LVAD הם בלתי מפותחים עם תמיסת מלח קר לפני תחילת תהליך העיכול. חשוב לציין כי "איכות" של הדגימה הרקמה נקבע במונחים של מידת צלקות או הסתננות רקמת שומן יכול מאוד להשפיע על התשואה של מקרופאגים. דגימות לב עם אזורים גדולים של צלקות יהיה הרבה יותר תאים התשואה הנמוכה והוא יכול להוות מגבלה טכנית רצינית כאשר הרצוי המטה ניתוח שיטות דורשים תא מתורבת culturing.

<table><tbody><tr><td>15 מ"ל צינורות קונוקאליים</td><td>תרמו פישר</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>40 ומיקרו; m מסננות תאים</td><td>תרמו פישר</td><td>50-828-736</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>תרמו פישר</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>ACK מאגר ליזה</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז 1</td><td>סיגמא</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>תרמו פישר</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Sigma</td><td>D4527-20KU</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermo Fisher</td><td>62251</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M pH 8</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> נטרול אנזים <td>490 מ"ל HBSS, 10 מ"ל FBS, 1 גרם BSA</td></tr><tr><td>FACS מאגר</td><td></td><td></td><td>976 מ"ל PBS, 20 מ"ל FBS, 4 מ"ל EDTA (0.5 מ')</td></tr> <tr><td>עוברי סרום בקר</td><td>Gibco</td><td>A3840201</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1x</td><td>Gibco</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>VWR</td><td>63042-052</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase type 1-s</td><td>Sigma</td><td>H3506-500MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>תרמו פישר</td><td></td><td></td>172931</tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של מקרופאג קבוצות מערכות ותאים סטרומה מתוך שריר הלב של האדם והעכבר דגימות

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

מקרופאגים מייצגים את אוכלוסיית התא הטרוגנית ביותר ושופע החיסונית בלב הם מרכזיים בנהיגה בדלקת ותגובות מענה לאחר פציעה לב. כיצד קבוצות מערכות שונות של מקרופאגים לארגן את התגובות החיסונית לאחר פגיעה בלב הוא תחום פעיל של מחקר. מוצג כאן הוא פרוטוקול פשוט כי המעבדה שלנו מבצעת באופן שגרתי, עבור החילוץ של מקרופאגים מן העכבר ושריר הלב האנושי באמצעות דגימות שהתקבלו מאנשים בריאים וחולים. בקצרה, פרוטוקול זה כרוך בעיכול אנזימטי של רקמת הלב כדי ליצור השעיה תא בודד, ואחריו כתמים נוגדן, ולזרום cy, לנסות. טכניקה זו מתאימה עבור בחני פונקציונלי שבוצעה על תאים ממוינים, כמו גם בצובר תאים בודדים RNA ברצף. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הפשטות שלה, יום מינימלי הווריאציה היום והישימות רחב המאפשר חקירה של מקרופאג טרוגניות על פני מודלים העכבר השונים ישויות המחלה האנושית.

הפרוטוקול תיאר מאפשר בידוד של מקרופאגים מהעכבר ושריר הלב האנושי. באמצעות הפרוטוקול אותו, אבל עם כתמים שונים האסטרטגיה לאחר הפעולה, התאים סטרומה יכול גם להיות נקצרו משריר הלב האנושי. תוצאות FACS המוצגות כאן נרכשו על פלטפורמת השלישי BD או BD. שולטת הפיצוי נוצרו מדגימות של בקרת צבע אחת מתוך הטחול מוכתם. איור 1 מציג את הליבה האנושית של lvad לא מעובד. איור 2 מציג את התוכנית לאחר מיון הזרימה של CCR2- and CCR2+ מקר...

מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד קבוצות מערכות שונות של מקרופאגים ותאים אחרים שאינם חסינים מפני שריר הלב של האדם והעכבר על ידי הכנת תא השעיה יחיד באמצעות עיכול אנזימטי. מערכות המשך הזדהות לצורך זרימה cy, מבוססי זיהוי ואפיון של מקרופאגים מבודדים מוצגים גם.

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

הלב מכיל אוכלוסייה הטרוגנית של תאים חיסוניים המ ממלאים תפקידים מכריעים בדלקת לב, כמו גם תיקון. על מנת להבין את ההטרוגניות של תאי החיסון ולקבל תובנה נוספת על תפקודם, חשוב לקבל שיטה שתאפשר התאוששות של תאים אלה מהלב. טכניקה זו יכולה לעזור לחשוף את המגוון החיסוני, כמו גם תאים לא חיסוניים השוכן בלב בריא או חולה.ישנם שלושה יתרונות עיקריים לטכניקה זו. ראשית, זוהי זרימת עבודה אחת פשוטה שמובילה לדור של השעיית תא בודד של סוגי תאים שונים בתוך שלוש שעות מהזמן. שנית, זה מוביל להתאוששות גבוהה של אוכלוסיות תאים חיסוניים ולא חיסוניים קיימא.ושלישית, זוהי שיטה מאוד תכליתית והוא יכול להיות מיושם על רקמות לב גם מינים אחרים. חשוב לשים לב לכמות הרקמה המשמשת לתגובת עיכול אחת. השתמש מספריים סטריליים, לנתח דגימת רקמה מן הקיר משמש או בצדדים של החדר השמאלי מלוחים קרים או HBSS.בזהירות לנתח את שומן מוקד וגיד chordae מן הדגימה. בעזרת להב סטרילי או מספריים, לנתח את נתחי הרקמה לחתיכות במשקל של כ 200 מיליגרם. לאחר המתת חום העכבר, לפתוח את חלל החזה בעזרת מספריים חדים.השתמש בהמוסטטים קהים כדי להרים את הלב כלפי מעלה. לנטרל את הלב עם PBS קר באמצעות מחט מד 25 מחובר מזרק חמישה מיליליטר. מנווט עד הלב נראה blanched בצבע.מוציאים את הלב ומ מניחים אותו בצלחת פטרי סטרילית על קרח. מניחים 200 מיליגרם של נתחי רקמת לב אנושית או לב מורין בצלחת פטרי סטרילית. יש לטחון טחון דק את הרקמה באמצעות להב סטרילי או מספריים.כדי להגדיר עיכול, בצינור חרוט 15 מיליליטר, להכין נפח עיכול סופי של שלושה מיליליטר עבור כל נתח רקמת לב אנושית או לב מורין אחד עם אנזימים קולגן I, DNase I, ו hyaluronidase בריכוזים של 450, 60, ו 60 יחידות למיליליטר. הוסף 2.5 מיליליטר של DMEM לתוך הצינור. בעזרת מלקחיים נקיים, מניחים את הרקמה הטחון דק לתוך כל צינור תגובה.מערבבים היטב על ידי מערבולת עדינה. לעכל במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד להגדיר למהירות תסיסה נמוכה עד בינונית. לאחר שעה של עיכול, מוציאים את הצינורות מהחממה ומ מניחים על קרח.הגדר צינורות חרוטיים 50 מיליליטר עם מסננת תא 40 מיקרון על גבי. הרטב את המסננים עם שני מיליליטר של מאגר השבתת אנזימים. לאחר מכן, להשבית את אנזימי העיכול על ידי הוספת שמונה מיליליטר של מאגר ניתוב אנזימים לכל צינור עיכול.ואז לשפוך את וכתוצאה מכך 13 מיליליטר של תערובת הכוללת דרך מסננת תא 40 מיקרון לתוך צינורות חרוט 50 מיליליטר. העבר את הדגימות המסוננות בחזרה בצינורות חרוט טריים של 15 מיליליטר. לסובב את הדגימות ב 400 פעמים g במשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס.השלך את העל-טבעי והשאיר 0.5 מיליליטר של מדיה. תוסיפו את גלולת התא על ידי צינורות עדינים והוסיפו מיליליטר אחד של מאגר תזת ACK. מערבולת עדינה הצינור והדהירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי לבצע תותבת תאי דם אדומים.לאחר חמש דקות במאגר ACK, הוסף 9 מיליליטר של DMEM לדגימה. שים את המכסה בחזרה על הצינורות בעדינות להפוך את הצינורות לערבב. מסננים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון ואוסף את הסינון בצינורות חרוטיים 15 מיליליטר.צנטריפוגה הצינורות ב 400 פעמים g במשך שש דקות ולהשליך את supernatant. הוסף מיליליטר אחד של מאגר FACS ולחץ מחדש על גלולה. ואז להעביר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.צנטריפוגה שוב ב 400 פעמים g במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והתקן מחדש את גלולת הכדור ב- 100 מיקרוליטרים של מאגר FACS. השעיית תא בודד מוכנה כעת להכתמת נוגדנים.הוסף לוח נוגדנים אנושי טיפוסי לדגימות הלב בדילול של 1 עד 50. השתמש בנוגדנים שונים עבור תאים סטרומה מקרופאגים לב מורין. דגירה במשך 30 עד 40 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.הוסף מיליליטר אחד של חיץ FACS, בעדינות מערבולת וצנטריפוגה ב 400 פעמים g במשך חמש דקות. חזור על שלב כביסה זה בפעם השנייה. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בדגימה ב- 350 מיקרוליטרים של מאגר FACS והוסף DAPI כדי להגיע לריכוז סופי של מיקרומולר אחד.הדגימות מוכנות כעת לניתוח FACS. בפרוטוקול זה הושג בידוד של מקרופאגים מעכבר ומ שריר הלב האנושי. איור זה מראה ליבת LVAD אנושית לא מעובדת ומעובדת.ערכת gating עבור מיון זרימה של CCR2 שלילי CCR2 מקרופאגים אנושיים חיוביים מן שריר הלב האנושי, כמו גם עבור CD45 תאים סטרומה שליליים מן קרדיומיופתיה איסכמי אנושי הוצגו. התמונות של רייט מוכתם FACS ממוין CD45 חיובי CD45 תאים שליליים CD45 להראות קרום התא שלם המציין את הכדאיות. גם ערכת המיון של מקרופאגים מלב עכבר הצליחה.משקל הרקמה המשמשת לתגובה אנזימטית הוא קריטי לעיכול יעיל. השתמש לא יותר מ 200 מיליגרם של רקמה עבור ריכוזי האנזים המצוין בפרוטוקול. בעקבות שיטה זו, תאים יכולים להיות מתורבתים עבור גירוי במבחנה assays.ניתן למיין תאים עבור רצף RNA בצובר או רצף תא בודד. שיטה זו שימשה טכניקה שלא תסולא בפז בגילוי הטרוגניות המקרופאג' הבלתי מוכרת בעבר הקיימת בלב האדם הבריא או המחלה. בשיטה זו ואחריו רצף תאים בודדים, מחקרים מתנהלים כדי לחשוף כיצד תאים חיסוניים ולא חיסוניים שונים משתנים מלב חולה לעומת הלב הבריא.

isolation-macrophage-subsets-stromal-cells-from-human-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור מקרופאגים אנושיים. מעילים באפי מעובדים על ידי צנטריפוגה הכפולה שיפוע צפיפות ולאחר מכן מונוציטים מבודדים נבדלים למקרופאגים בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון. זה ממקסם תשואות מקרופאג ומקל על קצירת תאים לניסויים הבאים.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות ראשוניות של תאי סטרומה בוושט עכבריים ואנושיים עם פנוטיפ מיופיברובלסטים. לתאים מתורבתים יש מורפולוגיה בצורת ציר, מבטאים α-SMA ווימנטין, וחסרים סמני פני תא אפיתל, המטופויאטי ואנדותל. ניתן להשתמש בתאי סטרומה מאופיינים במחקרים פונקציונליים של אינטראקציות אפיתל-סטרומליות.

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

ברקמת לב אדם מטפחת אוכלוסיות תאי מבשר perivascular מולטיפוטנטיים שעשויה להיות מתאים התחדשות שריר לב. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת בידוד סימולטני וטיהור שתי אוכלוסיות תאי סטרומה מולטיפוטנטיים קשורות כלי דם מקומיים, כלומר CD146 + CD34 - pericytes ו CD34 + CD146 - תאי adventitial, מן שריר הלב האנושי.

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

פרוטוקול זה מאפשר חוקר לבודד ולאפיין רקמות תושב מקרופאגים שונות הולמרק רקמות מודלק שחולצו מן הדיאטה-induced מודלים של הפרעות מטבוליות.

בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

במאמר זה, שיטה לבודד תאי סטרומה mesenchymal לב מדגימות bioptic endomyocardial של arrhythmogenic של שריר הלב חולים מסופק. אפיון שלהם ואת פרוטוקול כדי להגביר את הבידול adipogenic שלהם מתוארים.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה Mesenchymal לב מדגימות Bioptic Endomyocardial של שריר הלב Arrhythmogenic חולים

תקשורת זו מתארת מתודולוגיות בידוד ותרבות של מקרופאגים מכתשי מבני ומודלים מאתר למטרות ניסוי.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד, לזהות ולכמת תאים חיסוניים המתגוררים במהלך מצב יציב או דלקת שריר הלב של עכברים. הפרוטוקול משלב עיכול אנזימטי ועל מכניים לדור של השעיה תא בודד מסוגל לנתח עוד יותר על ידי cytometry זרימה.

בידוד וזיהוי של תאים חיסוניים Extravascular של הלב

על מנת לבודד ולטהר את קרום הלב למחקרים בסיסיים ולחקור את הפוטנציאל הטיפולי של הביולוגיה שלהם.

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

פרוטוקול זה מספק שיטת עיכול יעילה של collagenase לבידוד של אדיפוציטים בני קיימא ותאי SVF של מקטע כלי דם סטרומה משומן בטני אנושי בתהליך יחיד, כולל מתודולוגיה להשגת RNA באיכות גבוהה מאדיפוציטים ופנוטיפפיקציה של SVF-מקרופאגים באמצעות צביעה של סמנים מרובים הקשורים לממברנה לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד אדיפוציטים בני קיימא ומקטע כלי דם סטרומלי מרקמת השומן הקרבית האנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים

הפרוטוקול המוצג כאן מספק גישה שלב אחר שלב לבידוד מקרופאגים תושבי לב מאזור הצומת הסינואטרלי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) של לבבות העכברים.

בידוד ותרבות של מקרופאגים לבביים תושבים מהצומת הסינואטריאלית והאטריובנטריקולרית של מורין

למד לבודד מקרופאגים ותאי סטרומה משור הלב של אדם ועכבר באמצעות עיכול אנזימטי וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת חקר מגוון תאי החיסון בדלקת ובתיקון הלב.

בידוד של מקרופאג קבוצות מערכות ותאים סטרומה מתוך שריר הלב של האדם והעכבר דגימות

גלה סרטונים נוספים