עיבוד העובר, קליפת ביצה, ופטרייתי תרבות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

יש לנו פרוטוקולי הכנה מדגמיים סטנדרטיים להדמיית עוברי צבים צבועים, קליפות ביצים נוקשות ותרבויות פטרייתיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה. שיטות מקיפות אלה משתמשות בשינויים עדינים לפרוטוקולים ידועים כדי לעבד שלוש רקמות עדינות המאפשרות הבחנה בין מבנים מקוריים ועיבוד הממצאים. הפגנת ההליך איתי תהיה ג'סיקה גיבונס, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.

לפני איסוף ביצי צב מאתר שדה בעונת הקינון, לעשות ארבעה עד שישה חורים 0.25 ס"מ לאורך הצדדים של קופסאות פלסטיק על המכסים שלהם כדי לאפשר אוויר. לפני מילוי הקופסאות בתערובת לחה של תערובת מצעים של ורמיקוליט וטחב כבול ביחס של אחד לאחד. באתר הקינון, להסיר בעדינות את האדמה כדי לחשוף את הביצים ולנגב את פני השטח של כל ביצת צב עם תמיסת יוד מדוללת כדי להגן מפני זיהום מיקרוביאלי במהלך הדגירה.

מניחים מקסימום של שמונה עד תשע ביצים לכל תיבה באותו כיוון ויישור כפי שהם הונחו, שמירה על אחיזות בודדות נפרדות זו מהשנייה. כאשר כל הביצים נאספו, באופן ידני לקבור את הביצים חצי המצעים ולה מניחים את תיבות חבצלות בתוך אינקובטור 30 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 17 ימים כדי לקבל שלבים עובריים 12, 13 ו 18 עוברים בהתאמה. מוסיפים מים מזוקקים כדי להרטיב חלקית את מדיום המצעים כל יומיים כדי למנוע התייבשות, ולשמור על רמת הלחות להתפתחות עוברית תקינה.

בשלב המתאים של הפיתוח, השתמש במספריים מחודדים כדי לבצע חתך בצד אחד של קליפת הביצה הגבית וממברנת החלמון יחד, אנכי לציר הארוך של הביצה. לאחר מכן, חותכים את הצד השני של הביצה לאורך הציר הקצר, ולהשתמש מדפים לקלף לפתוח את החתיכה excised עם הצד העובר למעלה. חותכים את הצד הצדדי השני של קליפת הביצה ומ מניחים את חתיכת הקליפה הנכרתת לתוך PBS.

באמצעות סטריאומיקרוסקופ ומלקיחות, לקלף את העובר ואת קרום החלמון מן קליפת הביצה. השתמש במטסים ובמיקרו מספריים כדי להסיר את הממברנות העובריות הנוספות, ולהשתמש בכף עובר כדי להעביר את העובר לצלחת פטרי של PBS טרי. לאחר שטיפת כל דם וחלמון, מניחים עד שלושה עוברים לכל באר של צלחת 12 באר, המכיל 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס במשך יומיים עד שלושה ימים.

כאשר הדגימות מופיעות לבנות, השתמשו בתוספים פוליסטירן עם תחתיות רשת פוליאסטר כדי לשטוף את העוברים עם שלוש חמש דקות שטיפה ב- PBS טרי לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, לייבש דגימות בסדרת אתנול עולה במשך שעה אחת לכל ריכוז. לאחר טבילת האתנול השנייה, ייבשו את העוברים בסדרה של HMDS לריכוזי אתנול למשך 20 דקות לטבילה עם צלחות פטרי מכוסות חלקית.

לאחר מכן מניחים את העוברים בתתכונת HMDS סופית של 100%, מכוסה לחלוטין או חלקית במכסה המנוע של האדים בן לילה. ייבוש איטי על ידי הגדלה הדרגתית של ריכוז HDMS לאתנול חשוב לחשיפת מבנה משטח מעולה בעוברים. למחרת בבוקר, השתמש בקלטת מוליך פחמן מקל כפול כדי להרכיב בזהירות את הדגימות מיובשות לחלוטין על תקע סיכת אלומיניום סטנדרטי.

כאשר כל הדגימות כבר רכוב, להציג את הדגימות לתוך תא מעיל sputter כדי לצפות את הדגימות עם סרט דק מאוד של זהב במשך 60 עד 120 שניות ב sputter 35 מיליאמפר. לאחר מכן הדקו היטב את ברגי הסט כדי לטעון את הדקים על לוחות היציצה המתאימים. השתמש בכלי חילופי הדגימה כדי להעביר את מחזיק הדגימה לתא הדגימה של מיקרוסקופ האלקטרונים הסריקה להדמיה.

כדי להכין קליפות ביצים לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, מניחים את קליפות הביצים במים מזוקקים לפחות שעה לאחר קציר העובר כדי למנוע כל זיהום חלמון או אלבומין. לאחר מכן, האוויר מייבש את קליפות הביצים המנוקות על מגבונים אנטי-סטטיים עדינים במכסה המנוע של האדים במהלך הלילה. אחסן את קליפות הביצים המיובשות בבקבוקי דגימה נקיים, המסומנים לפי מספר ושלב העובר.

לאחר מכן, הר, מעיל sputter ותמונה דגימות קליפת הביצה כפי שהוכח רק עבור העוברים. כדי להקים תרבויות פטרייתיות שקופיות, השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך חצי עד שלושה בלוקים אינץ 'של אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מוצק, ולמקם את הבלוקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בודדות. מניחים קיסמים סטריליים בתחתית מנות פטרי נקיות להעלאת שקופיות מהם כדי ליצור מתח פנים בין הצלחת למגלשה.

מניחים כל שקופית על קיסמים בצלחת פטרי. לאחר מכן, השתמש בלולאה סטרילית כדי להעביר פטריות מאינוקולום הדגימה לכל אחד מארבעת הצדדים הצדדיים של גוש אגר. הוסיפו כמה טיפות מים מזוקקים סטריליים לצלחת הפטרי סביב המגלשה כדי להבטיח לחות לפטריות הגדלות.

לאטום חלקית את הצלחת עם סרט פרפין ולה מניחים את הצלחת באינקובטור 30 מעלות צלזיוס לתקופת הדגירה המתאימה למין הפטרייתי. בסוף הדגירה, להסיר את השקופית מן צלחת פטרי ולהשתמש מדפים סטריליים להעביר את גוש אגר דבק בחוזקה מן השקופית למיכל של 3% glutaraldehyde עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לייבש את הדגימות בסדרת אתנול עולה במשך 15 דקות לכל ריכוז.

לאחר טבילה של 90%, מעבדים את הדגימות להתייבשות סופית עם שני שינויים של 30 דקות באתנול של 100% כדי להבטיח רוויה מלאה לפני הצבת הדגימות המיובלות בתא של מנגנון הייבוש של הנקודה הקריטית. לאטום את התא ולפתוח את השסתומים כדי לאפשר פחמן דו חמצני נוזלי לפרוק פנימה ולתת אתנול לפרוק החוצה עד פחמן דו חמצני נוזלי לחלוטין ממלא את התא. לאחר מכן, לאט לאט לחמם את התא כדי להשיג נקודה קריטית כאשר לחץ התא עולה על 1,000 ק"ג של לחץ לאינץ 'מרובע, הטמפרטורה עולה על 31 מעלות צלזיוס, ואת שטח הנוזל והגז של פחמן דו חמצני הוא שיווי משקל.

ואז לאט לאט לנקז את הפחמן הדו חמצני מהתא ואת המדגם כגז, כדי למנוע כל השפעות של מתח פני השטח על המדגם, הר, צלחת, ותמונה דגימות פטרייתי כפי שהוכח. תצוגת מיקרוגרף אלקטרונים סריקה רוחבית של עובר צב צבוע שלב 12 מגלה כיצד בולטות maxillary משתרעת מעבר למלדיברולרי ומדיאלי מגביל בור האף מסומן היטב. חמש קשתות הלוע ניתן לראות גם.

בעובר שלב 15, somites שזה עתה נוצרו נראים באזור הזנב האחורי של העובר, ואת ניצנים הקדמיים להצביע בצורה קליפתית יותר מאשר ventrally. ניתן גם לדמיין תפוקה מוגדרת היטב של רכס שריון לאורך כל אזור האגף הבין-יבשתי של העובר. בשלב 18, חוטם הקרנה קצר וקצר נוצר עם מקור תחתון מעט הפוך עם וו מסוף שמתאים לחיץ המרכזי של המקור העליון.

הלסת העליונה מציגה מראה חרוט, ו ניתן לראות שן ביצה זעירה המתגבשת בקצה הלסת העליונה. ניתוח אולטרה-מבני של קליפת הביצה של קריסמיס פיקטה וקרום הקליפה על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, חושף שכבת קליפת קלקרינוס החיצונית, המחוברת היטב לקרום הקליפה הפנימי. המשטח החיצוני של קליפת הביצה מורכב מיחידות מעטפת מינרליות מכובדות היטב עשויות גושים כדוריים כדוריים המסודרים בקבוצות ובין יחידות מעטפת סמוכות, עם ריכוז של שקעים מעוגלים קטנים או נקבוביות בגדלים שונים.

מתודולוגיות נפוצות לא ניתן להכליא עבור כל הדגימה הביולוגית כדי להשיג איכות תמונה הגון באמצעות SEM. שינויים ייחודיים כפי שהוכח חיוניים עבור סוגי רקמות ספציפיים. השיטה הכימית וייבוש האוויר יכולה לשמש גם עבור דגימות אורגניות אחרות, ואת טכניקת תרבות שקופיות צימוד יכול לשמש עבור כל רכים, תרבויות מיקרוביאליות חזקות.