Name: עיצוב, סינתזה ומאפייני פוטוכימיקלים של תרכובות בכלוב לחיצים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: למד שיטת סינתזה לתרכובות בכלוב לחיצים עם תכונות נוספות כמו מסיסות במים ויכולת מיקוד תאית. פרוטוקול זה מאפשר הכנת תרכובות פוטוכימיות יציבות לשימוש במחקר עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספר JP16H01282 (TF), מענק סיוע למחקר מדעי על אזורים חדשניים "הזיכרון דינמיות," ו JP19H05778 (TF), "מולסרטים."

. אין לנו מה לגלות

בעבר פיתחנו תרכובות בכלוב bhc של מולקולות פעיל ביולוגית שונים המוצגים יעילות photolytic גבוהה28,45,46,47. במטרה להרחיב את הרפרטואר של קבוצות bhc הזדקנות, אנו דיווחו גם על פלטפורמות של תרכובות בכלוב מודולרי שניתן לשנות בקלות על ידי המבוא של יחידות פונקציונליות שונות32,40,41. הפרוטוקול הנוכחי, לפיכך, מייצג שיטה לסינתזה של מבשר בלייזר של קבוצות Bhc הזדקנות שניתן לשנות באמצעות מחזוריות הנחושת (I). הסינתזה של הראשון לחיץ, פאבכצ2הו (2), הושג באמצעות רצף התגובה ארבעה צעדים החל מסחרית הזמין 4-ברומorcinol (איור 1a). היתרון של הפרוטוקול הנוכחי הוא שאין שלבי טיהור מפרך (לדוגמה, הפרדות כרומטוגרפיות של עמודות) נדרשות.
כפי שניתן ללחוץ עלהספר הראשון (2) בכדי להסוות קבוצות פונקציונליות שונות, תרכובות בכלוב לחיצים של amines, אלכוהול, ו-חומצות קרבוקסילית ו-מסונתז באמצעות 2 כקודמן (איור 1b). בעוד האלכוהול שונו. בתור הקרבונטים שלהם בהליכים כלליים 1 ו-2, CDI שימש להכנת carbamates הניתנים ללחיצה, בעוד שימוש ב-4 ניטרוגליצרין בכלורוקקסיל המשמש להכנת קרבונטים. כפי שמצוין על-ידי מנגנון התגובה, ניתן להשתמש בשני הריאגנטים להכנת כרמי וקרבונטים. יש לציין כי התשואה של תרכובת הכלוב הרצויה תלויה במבנה הכימי של המולקולה כדי להיות כלואה. דוגמאות אחרות ניתן לראות בדוחות הקודמים שלנו28,30,33,48.
השינוי בקליק התבצע לאחר מכן באמצעות שינוי קל של הפרוצדורה המדווחת49. התוספת של tris (triazolylmethyl תיל) אמין מבוססי ליגנדס הוא הכרחי כדי להשיג את המוצרים הרצויים בטוב לתשואות גבוהות. כיוון שמגוון רחב של אזימוט זמין הן ממקורות מסחריים והן מהליכי ספרות, אנו יכולים להכין תרכובות כליות מודולריות שונים עם מאפיינים נוספים כגון מסיסות מים ויכולת מיקוד הסלולר (איור 2).
התשואה הקוונטית של פוטטולזיס נמדדה על פי הליך מדווח28,50. איור 3 מראה כי הצריכה photolytic של 2 ʹ-GLC-ptx-פטק ושחרורו של ptx הוטלו על ידי ריקבון יחיד מעריכי ועלייה, בהתאמה, מציע לא סינון פנימי של הקרינה או תופעות משניות רצויות. משופר פוטוליזה התשואות הקוונטים (Φ) ו פוטוליזה יעילות (εΦ) נצפו על התרכובות בכלוב הלחיץ למדי לעומת אלה של תרכובות בכלוב שדווחו בעבר (שולחן 1)41, 43. מאחר והיעילות של הפוטטולוזיס (εΦ) של תרכובות בכלוב בכלובים גבוהה מ-100 פי שניים מאלה של48תרכובות בכלובים מסוג 2-ניטרווליקסיל, השיפור המסומן בשל נוכחותם של קבוצות פאבhc כולאת בבירור יתרון עבור מערכת זו.
כניסוי של הוכחת רעיון, הmoiety הידרופיפילית הוכנס לתוך 2 ʹ-פאבלודק-פאקס (4) והוכנס לתוך מתחם 3 (איור 2). מסיסות המים של 2 ʹ-glc-פמוקסיק-PTX היה 650 פעמים יותר גבוה מזו של ההורה PTX (שולחן 1). המיקוד הסלולר סלקטיבי הושג באמצעות מערכת תג-בדיקה, ופאבכצ-hex-הקס-FITC/Halo (8) הנושאת את הלוטאג ' ליגאג ' והייתה מכוונת בהצלחה לקרום התא של תאי היונקים המתורבתים המבטאים את חלבון ההיתוך של ההלותג/egfr ( איור 4). אפנון מתווכת התמונה של הלוקליזציה התת-תאית של קינאז הושג גם באמצעות מתחם כלוב לחיץ 5 (איור 5).
לסיכום, הדגמנו בהצלחה שיטה להכנת פלטפורמות לחיצים עבור תרכובות צילום בכלוב של מולקולות מעניינות ביולוגית, כי ניתן לשנות בקלות עם תכונות נוספות, כגון מסיסות המים הסלולר יכולת המיקוד. מאחר שקבוצת פאבhc כולאת יכולה לשמש להכנת כל מולקולות עם קבוצות פונקציונליות מסוימות, יישום הפרוטוקול הנוכחי אינו מוגבל למולקולות המתוארות להלן. באמצעות פלטפורמה מודולרית, כלומר הקבוצה פאבhc כולאת, תרכובות בכלוב הרצוי ניתן להכין בקלות, ואת התכונות הפיזיות והכימיות שלהם יכול להיות מאופנן באמצעות שינוי לחץ.

תרכובות בכלוב מתוכננים מולקולות סינטתיים, אשר הפונקציות המקוריות שלהם הן מסיכה באופן זמני על ידי קבוצות מחוברות הגנה באמצעות שמירה על התמונה. מעניין, תרכובות בכלוב של מולקולות רלוונטיות ביולוגית לספק שיטה הכרחית עבור השליטה זמן טמפורלית של הפיזיולוגיה התאית1,2,3,4,5 ,6. ב-1977, אנגלס ושלגר דיווחו על מחנה ה-2-ניטרולוקסיל של קמפ, כחומר לחדירות הקרום והנגזרת של מחנה7. בשנה הבאה דיווח קפלן על 1-(2-ניטרופניל) אתיל אסטר של ATP (NPE-ATP) וקרא למתחם זה "כלוב" ATP8. מאז, מגוון של קבוצות מגינים נשלפים כימית כגון 2-ניטרוגליצרין benzyls, p-הידרוקסיפנאס9, 2-(2-ניטרוגליצרין פניקסיל)10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, ו (coumarin-4-yl) מתושלח14,15,16 שימשו להכנת תרכובות בכלוב.
סינתזה של תרכובות בכלוב עם מאפיינים נוספים רצוי כגון חדירות הממברנה, מסיסות המים, ואת יכולת המיקוד הסלולר צפוי להקל על יישומים ביולוגיים התא. מאחר והתכונות הפיזיות והפוטוכימיות של מולקולות אלה תלויות בעיקר במבנה הכימי של קבוצות ההגנה הנשלפת של פוטוכימיקלים ששימשו להכנת המכונות, רפרטואר מגוון של קבוצות צילום-caging נדרש. עם זאת, מגוון מבניים של קבוצות כולאת זמין כרגע כי התצוגה יעילות פוטוליזה גבוהה היא מוגבלת. זה יכול להיות מכשול כדי להגדיל את השימוש בתרכובות בכלוב.
כדי לטפל בבעיה זו, הרפרטואר של קבוצות צילום-caging הורחב על ידי שינוי כימי של הקבוצה הקיימת הגנה מפני התמונות או עיצוב של photoremovable חדש כרומטוגרפי עם תכונות פוטופיסיים ופוטוכימיות מעולה. דוגמאות כוללות: נירורואכרופאריאן (ndbf)17, [3-(4, 5-דימוקסי-2-ניטרופניל) -2-בוטיל]18,19, מדגם 2-בנזיל-כלוב הפוטו20, התחליפי מתכות (DEAC45021 , דקסס22, 7-אזיטידיקסיל-4-מתילקוארין23, וסטיריל קומרנס24), cyanine נגזרות (cטרם-פאן)25, ונגזרים בודיפיה26,27.
בנוסף, פיתחנו בעבר (6-bromo-7-הידרוקסיקוארין-4-yl) מתיל (bhc) הקבוצה בהצלחה מסונתז תרכובות בכלובים שונים של נוירוטרנסמיטורים28, שליחים שני29,30, ו מ32,33 מציגאת החלקים הגדולים והשני של הפוטון. אם מאפיינים נוספים ניתן להתקין בקלות לתוך קבוצות כולאת מבלי להתפשר על רגישות התמונה שלהם, אז הרפרטואר של תרכובות בכלוב ניתן להרחיב34,35,36, 37,38,39. לפיכך עיצבנו תרכובות בכלוב מודולרי המרכיבות שלושה חלקים, כלומר הקבוצה Bhc כמו הליבה תגובה לתמונה, ידיות כימיות להתקנה של פונקציות נוספות, ואת המולקולות כי הם להיות רעולי פנים40, 41.
לפיכך, מאמר זה מספק שיטה מעשית להכנת תרכובות בכלוב של מולקולות רלוונטיות ביולוגית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות להכנת פלטפורמה ללחיצה לקבוצות צילום, הכנסת פונקציות נוספות להרחבת הרפרטואר של תרכובות בכלובים, המדידה הפיזית והפוטוכימית ומיקוד התאים הסלקטיבי של מתחם כלוב לחיץ לצורך יישום סלולארי נוסף.

<table><tbody><tr><td>אצטוניטריל, EP</td><td>Nacalai</td><td>00404-75</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל, סופר מיובש</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>010-22905</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייתית, 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4-bromoresorcinol</td><td>TCI Chemicals</td><td>B0654</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-carbonyldiimidazole</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>034-10491</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>קאנטו</td><td>07278-71</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט פנטהידרט, 99.9%</td> <td>FUJIFILM Wako</td><td>032-12511</td><td></td></tr><tr><td>דיכלורומתאן,</td><td>מיובש Kanto</td><td>11338-05</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC)</td><td>TCI Chemicals</td><td>D0254</td><td></td></tr><tr><td>4-dimethylaminopyridine</td><td>TCI Chemicals</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל-סולפוקסיד, מיובש -</td><td>super-Kanto</td><td>10380-05</td><td></td></tr> DMEM - <tr><td>תאורת פלואורסצנטי כפולה</td><td></td> של Dulbecco Modified Eagle Medium Sigma D6046-500ML, IX2-RFAW אולימפוס <td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול (99.5)</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>054-07225</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> אתיל 4-כלורואצטואצטט TCI כימיקלים C0911 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F-12 של האם עם L-גלוטמין ופנול אדום</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-08335</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-01076</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלורסנט הפוך IX-71</td> מפריד פאזה <td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזולוט, 15 מ"ל</td><td>Biotage</td><td>120-1906-D</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-חומצה אסקורבית מלח נתרן</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית סריקת לייזר, FLUOVIEW FV1200 / IX-81</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000 מגיב טרנספקציה</td><td>תרמו פישר</td><td>11668027</td><td>מגיב ליפופקציה</td></tr><tr><td>3-(N-מורפולינו) חומצה פרופנסולפונית</td><td>Dojindo</td><td>345-01804</td><td>MOPS</td></tr><tr><td>4-nitrophenylchloroformate (4-NPC)</td> <td>TCI Chemicals</td><td>C1400</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת בינוני, ללא פנול אדום</td><td>תרמו פישר</td><td>11058021</td><td>מדיום סרום מופחת אינו מכיל פנול</td></tr><tr><td>אדום 1,10-פננתרולין מונוהידראט</td><td>Nacalai</td><td>26707-02</td><td></td></tr><tr><td>כור פוטוכימי עם מנורות RPR 350 ננומטר</td><td>ריונט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אשלגן טריאוקסלטופרט (III) טריהידרט</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>W01SRM19-5000</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט Trihydrate</td><td>Nacalai</td><td>31115-05</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית, 96-98%</td> <td>FUJIFILM Wako</td><td>190-04675</td><td></td></tr><tr><td>Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)</td> <td>ALDRICH</td><td>762342-100MG</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodium Citrate Dihydrate</td><td>Nacalai</td><td>31404-15</td><td></td></tr><tr><td>קסנון אור מקור, MAX-303</td><td>Asahi Spectra</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

עיצוב, סינתזה ומאפייני פוטוכימיקלים של תרכובות בכלוב לחיצים

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

תרכובות בכלוב לאפשר את הטיפול בתיווך התמונה של הפיזיולוגיה התא עם רזולוציה גבוהה הזמני. עם זאת, מגוון מבניים מוגבל של קבוצות כולאת זמין כעת ואת הקשיים בשינוי סינתטי מבלי להקריב את היעילות פוטוליזה שלהם הם מכשולים כדי להרחיב את הרפרטואר של תרכובות בכלוב עבור תאים חיים יישומים. כאשר השינוי הכימי של הקבוצה מסוג coumarin רין-התמונה היא גישה מבטיחה להכנת תרכובות בכלוב עם תכונות פיזיות וכימיות מגוונות, אנו מדווחים על שיטה לסינתזה של תרכובות בכלוב לחיץ שניתן לשנות בקלות עם יחידות פונקציונליות שונות באמצעות מחזוריות הנחושת (I)-מזרז הויסיזציה. המולקולה פלטפורמה מודולרית מכיל (6-bromo-7-הידרוקסיקוארין-4-yl) מתיל (bhc) הקבוצה כקבוצה צילום-caging, אשר מציג יעילות פוטוליזה גבוהה לעומת אלה של 2-ניטרובנזים קונבנציונאלי. הליכים כלליים להכנת תרכובות בכלוב לחיצים המכילים amines, אלכוהול, ו carboxylates מוצגים. מאפיינים נוספים כגון מסיסות המים ויכולת המיקוד התאים ניתן לשלב בקלות לתוך תרכובות בכלוב לחיץ. יתר על כן, התכונות הפיזיות והפוטוכימיות, כולל התשואה הקוונטית של פוטוליזיס, נמדדות ונמצאו מעולים לאלה של תרכובות הכלוב המקבילות של Bhc. לפיכך, הפרוטוקול המתואר יכול להיחשב לפתרון פוטנציאלי לחוסר גיוון מבני בתרכובות הכלוב הזמינות.

תרכובות בכלוב לחיצים של כמה מולקולות מעניינות ביולוגית, כולל חומצה ארכידונית ו paclitaxel, היו מסונתז בהצלחה (איור 1)28,41. מאפיינים נוספים, כגון מסיסות המים ויכולת המיקוד התאי, הוכנסו לפאבכצ-PTX דרך מחזוריות הנחושת (I)-מזעור הואיזאז ("לחץ") (איור 2). לאחר מכן, בכלוב הלחיץ האלה, היתה פוטולייזד לאחר מכן כדי לייצר את ההורה שלהם, לאחר ההקרנה ב-350 ננומטר (איור 3), והתכונות הפיזיות והפוטוכימיות של תרכובות הכלוב הלחיצים מסוכמות בטבלה 1. התשואות הקוואנטיות של תרכובות בכלוב לחיצים 2 ʹ-glc-פהרב-PTX (Φdis 0.14) ופאבHC-AA (Φdis 0.083) היו יותר מפעמיים מאלה של תרכובות בכלוב בכלובים רגילות 2 ʹ-בכצ-ptx (Φדיס 0.040) ו-Bhc-AA (Φdis 0.038)43. בנוסף, מסיסות המים המשופרת נצפתה עבור 2 ʹ-glc-פאבכצ-PTX, אשר מכיל moiety גלוקוז.
בניסויים בתאים חיים, המיקוד של פhc-hex-FITC/הילה לתאי היונקים המתורבוניים המבטאים בסיפוק חלבון היתוך של חלבון הלותג וקולטן לגידול באפידרמיס (EGFR) הושג בהצלחה. זריחה ירוקה של fluorescein moiety של פאבhc-hex-FITC/הילה נצפתה על קרום התא (איור 4). באמצעות מתחם כלוב של פhc, הושגה אפנון מתווך של התאמה לוקליזציה תת-תאית של קינאז. הטרנסלוקציה של דיצילין קינאז γ (DGKγ) דווחה כמופעלת בנוכחות חומצה ארכידונית (AA)44. התאים צ'ו-K1 באופן מאוד מביע ביטוי GFP-DGKγ טופלו עם או AA או פאבhc-AA (5). התוספת של AA גרם לאפנון של הלוקליזציה subcellular של DGKγ (איור 5א, ב). שינויים דומים בלוקליזציה של DGKγ נצפו עבור התאים המתייחסים לפאבhc AA לאחר החשיפה לאור UV (איור 5ג, ד).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg"> איור 1: הכנת תרכובות הכלוב הניתנים ללחיצה. (א) ריאגנטים ומצבי הפעולה: a. אתיל 4-כלורואצטט/Conc. H2SO4/rt/7 ימים/91% תשואה, b .1 M HCl/ריפלוקס/3 ימים/97% תשואה. ג. N-מתילפרולאמילין/Hcho/oh, ואז להוסיף (1) וחום ב ריפלוקס עבור 17 h/79% תשואה. (ב) syntheses של אמין הכלוב הלחוץ, ptx, ו החומצה ארכידונית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg"> איור 2: התקנת יחידות פונקציונליות לתוך תרכובות בכלוב לחיצים. (א) סינתזה של כלוב מסיסים במים באמצעות מחזוריות הנחושת (I)-מזרז הויסיזציה. (ב) מבנים של תרכובות בכלובים הניתנים ללחיצה המכילות את הלוטאג ליאג ומיקוד תאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg"> איור 3: Photolysis מתוך 2 ʹ-glc-פאבכצ-PTX (6). דגימות (10 μM) בתמיסה K-מגבים (pH 7.2) נחשפו לקרינה בשעה 350 nm. (א) עקבות של הקשחת מרשמים ל-פוטוליזה של 6 (נמדד ב254 ננומטר). הדגימות נותחו בזמן ההקרנה שצוין. (ב) מסלול הזמן לפוטוליזיס של 6. עיגולים כחולים מציגים את הצריכה של 6. קו אחיד מראה את עקומת לפחות ריבועים להתאים מעריכי פשוט מדעיכה עבור 6. ריבועים אדומים מראים את התשואה של PTX. קווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן (± SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg"> איור 4: תמונות הקרינה הפלואורסצנטית של תאים מתוך היונקים המתורבאלים עם פאבhc-הקס-FITC/Halo (8). תאים הpcDNA3-הילה-EGFR היו מודבטים עם פתרון μM 2 של מתחם 8 ב 37 ° c עבור 30 דקות. התמונות התקבלו לאחר כביסה חוזרת באמצעות PBS +. תאים HEK293Tמטופלים (A: ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ותמונה D: תמונה פלואורסצנטית). HEK293T תאים (b ו -E) ותאי הלה (C ו- F) מביעים ביטוי הילה-egfr (B ו- c: תמונות DIC ו- E ו- F: תמונות פלואורסצנטית). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg"> איור 5: תמונות פלואורסצנטית לאחר הקרנה UV של התאים CHO-K1 מודבטים עם חומצה ארכידונית בכלוב Bhc. התאים של צ'ו-K1 היו מזוהמים עם חלבון היתוך DGKγ-EGFP. (א) דמות פלואורסצנטית של תאים מזוהמים. (ב) 100 s לאחר תוספת של 10 μm פתרון של חומצה ארכידונית. (ג) תאים היו מודבטים עם פתרון μm 10 של פאבhc-AA (5) ב 37 ° c עבור 5 דקות (ד) 100 s לאחר הקרנה של 20-s UV (330 – 385 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תרכובות</td>
			<td>λmax (nm)מ
</td>
			<td>εmax (M-1 ס מ-1)b
</td>
			<td>φdisc
</td>
			<td>εφdisd
</td>
			<td>מסיסות (μM)e
</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל הפאקס</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-בהבכצ-פאקס</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0.040</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-פאבהמוק-פאקס</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0.059</td>
			<td>670</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-glc-בהבכצ-פאקס</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0.14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bhc-AA</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0.038</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>פאבhc-AA</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0.083</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: תכונות פיזיות ופוטוכימיות של תרכובות בכלוב לחיץ. א. הקליטה המרבית (nm), ב. הספיגה הטוחנת ב λmax (M-1 ס"מ-1), c. התשואה הקוונטית של העלמות חומרי המוצא ב 350 nm, d. התוצר של הספיגה הטוחנת והתשואה הקוונטית של העלמות ב350 ננומטר, אי. ריכוז התמיסה הרוויה ב-K-מגבים (pH 7.2) (μg mL-1).

פרוטוקול לסינתזה ומדידה של המאפיינים הפוטוכימיים של תרכובות בכלוב מודולרי עם moieties לחיץ מוצג.

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק שיטה מעשית להכנת תרכובות photocaged עם תכונות נוספות כגון מנושלות מים או יכולת מיקוד הסלולר. באמצעות הליך סינתטי פשוט, טכניקה זו יכולה לשמש כדי להרחיב את המעבדה על תרכובות בכלוב כדי להפוך תרכובות בכלוב עם תכונות נוספות מבלי להתפשר על רגישותם. סינתזה זו יכולה להתבצע במעבדה סטנדרטית כמו תרכובות בכלוב קליק שלנו יציבים הקרנת צילום כאשר מומסים ממיסים אורגניים שאינם נוקלאופיליים כגון dichloromethane או דימתיל סולפוקסיד.הדגמת ההליך עם הירונה ססקי תהיה אקינובו סוזוקי, פוסט דוק, האנמי אאוקי ו ריי ווטאקי, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה. התחל על ידי הוספת 709.6 מיליגרם של paBhc מתנול ו 397.6 מיליגרם של n n-carbonyldiimidazole לתוך בקבוק 30 מיליליטר עגול התחתון. מוסיפים שישה מיליליטר יבשים של דיכלורומטן לבקבוק ומערבבים את הפתרון בטמפרטורת הסביבה במשך שעה.בסוף הדגירה, מוסיפים 342.8 מיליגרם של 4-דימתילמינופילורידין ו-552 מיקרוליטרים של טרט-בוטיל שישה אמינו הקסיל קרבמט, ומערבבים את הפתרון בטמפרטורת הסביבה במשך שלוש שעות נוספות. לאחר מכן השתמשו באידוי סיבובי תחת ואקום כדי להסיר את הממס וחומרים נדיפים אחרים, ולהשתמש כרומטוגרפיה עמוד פלאש ג'ל סיליקה כדי לטהר את השאריות ישירות. כדי להתקין יחידה פונקציונלית לתוך תרכובת הכלוב ללחיצה, להמיס 249 מיליגרם של נחושת שני פנטהידרט סולפט ב 10 מיליליטר של מים מוחלפים יונים לתת 0.1 נחושת גופרתית טוחנת.להמיס שמונה מיליגרם של שני paclitaxel מדומה paBhc, 7.5 מיליגרם של טריס (3-הידרוקסיפרופילטריאזולימילמיל)אמין, 162.4 מיליגרם של נתרן-l-אסקורבאט, ו 3.1 מיליגרם של 15-כלורו-3, 6, 9 טריוקסיפנטילדקיל אזיד בממס מעורב של 2.5 מיליליטר של חיץ פוספט טוחן 0.1 ו 0.5 מיליליטר של דימתיל סולפוקסיד. לאחר מכן, להוסיף 81.2 microliters של 0.1 תספורת נחושת גופרתית טוחנת לתערובת התגובה ומערבבים את התערובת בטמפרטורת הסביבה במשך 80 דקות, ניטור התקדמות התגובה עם HPLC. בסוף התגובה, לפתור את המדליפים עם 3.5 מיליליטר של 75%אצטיל פתרון מים nitryl ולהחיל את הפתרון וכתוצאה מכך ישירות על מערכת HPLC חצי הכנה כדי לטהר את המוצר הרצוי.עבור מדידות יעילות קוונטית, תחת מנורות פלואורסצנט מכוסה אור UV לחתוך את המסנן, לדלל את פתרון מלאי מדגם ב 10 microliters של דימתיל סולפוקסיד עם 10 מיליליטר של חיץ KMOPS. העבר aliquot של הפתרון לתוך אותה מבחנה המשמשת בתגובת צילום של actinometer כימי. הקרין את פתרון הדגימה עם אור 350 ננומטר למשך חמש שניות, תוך הסרת 50 אליקוטים מיקרוליטר מהפתרון מוקרן מעת לעת לניתוח על ידי HPLC.לאחר מכן לקבוע את זמן ההקרנה בשניות שבו 90% מהחומר ההתחלתי הגיב על ידי חלקות מתאימות של היעלמות תלויי זמן של החומר ההתחלתי. עבור פילוח Ligand HaloTag של תרכובת בכלוב ללחיצה, לקצור את אוכלוסיית תא היעד של עניין עם ניתוק התא המתאים reagent ולהשעות מחדש את התאים ב 2.5 פעמים 10 לתאים החמישי למיליליטר של ריכוז DMEM. ואז לזרוע כ 10 לתאים החמישיים לכל מנה לתוך 35 מיליליטר זכוכית תחתונה מנות עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.למחרת בבוקר, לדלל 14 מיקרוגרם של ה-DNA PC שלושה קולטן גורם גדילה הילה פלזמה DNA בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל 700 microliters של מדיום סרום מופחת. לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של reagent lipofection ב 150 microliters של מדיום סרום מופחת לכל אחד מארבעה צינורות ולאפשר את הצינורות לעמוד בטמפרטורת הסביבה במשך חמש דקות. בסוף הדגירה, מוסיפים 150 מיקרוליטרים של דנ"א פלזמה מדולל לכל אחת מדגימות השפתיים המדוללים ומדגרים את הדגימות בטמפרטורת הסביבה במשך חמש דקות נוספות.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS לכל מנה ולהוסיף 1.5 מיליליטר של מדיום סרום מופחת לכל תרבות. מוסיפים 150 מיקרוליטרים של קומפלקס ריג'נט ליפוקציה פלסמיד לכל מנה ומחזירים את התאים לאנקובטור תרבות התאים למשך 48 שעות. בסוף הדגירה, שאפו את העל-טבעיים והוסיפו מיליליטר אחד של DMEM טרי בתוספת שתי הילה הקסדצית של ה-paBhc לכל מנה.לאחר 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, שאפו את המדיום המכיל את התרכובת הכלואה ושטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS פלוס כדי להסיר את כל תרכובות לא מאוגדות. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מדיום סרום מופחת לכל מנה ומחזירים את התאים לאנקובטור תרבות התאים למשך 30 דקות נוספות כדי להסיר את התרכובות שנכנסו לתאים. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת למנה ולהוסיף מיליליטר אחד של בינוני ללא פנול אדום לכל תרבות.לאחר מכן להקליט את תמונות florescence על ידי לייזר סריקת מיקרוסקופיה פלורסנס confocal. עבור אפנון מתווך צילום של לוקליזציה קינאז באמצעות תרכובת בכלוב ללחיצה, זרע כחמש פעמים 10 לתאי TOC-A-אחד החמישי בשני מיליליטר של מדיום F12 של האם לכל צלחת תחתונה זכוכית 35 מיליליטר. למחרת, להדביק את התאים עם קידוד פלסמיד עבור GFP diacyllycerol קינאז גמא במשך 48 שעות כפי שהודגם רק.לאחר סיום ההחלפה, החלף את על-טבעי ההמרה בשני מיליליטר של מדיום סרום מופחת. הוסף 20 microliters של 100 פעמים paBhcAA פתרון עבודה לתאים עבור דגירה חמש עד 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. בסוף הדגירה, מניחים את המנה על השלב האובייקטיבי של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד באור כפול של תאורת פלואורסצנטיות.תמונה התאים כל 10 שניות במשך 10 דקות תוך הקרנה של התאים בנקודות הזמן הניסיוניות המתאימות אורכי גל על פי פרוטוקול הניסוי. באמצעות שיטה זו כפי שהודגם, תרכובות בכלוב ללחיצה של כמה מולקולות מעניינות ביולוגית, כולל paclitaxel וחומצה אצ'ידונית, ניתן לסנתז בהצלחה. מאפיינים נוספים כגון מיזות המים ויכולת מיקוד הסלולר ניתן להציג לתוך paclitaxel מדומה paBhc באמצעות נחושת אחת קטליזציה מחזורית לחץ תגובה.אלה paclitaxels בכלוב ללחיצה אז ניתן להצטלם כדי לייצר תרכובות ההורה שלהם על הקרנה ב 350 ננומטר. המאפיינים הפיזיים והפפוטוכימיים של התרכובות הכלוכלות הניתנות ללחיצה מסוכמים בטבלה. בניסויים בתאים חיים, המיקוד של הילה paBhc hex fitzi לתאי יונקים מתורבתים מבטא באופן חולף חלבון HaloTagged קולטן גורם גדילה אפידרמיס גורם אות florescence ירוק מן הפלואורסין מויטי PAHBHC hex fitzi הילה על קרום התא.כמו כן, הטיפול בתאי CHO-K1 מבטא באופן חולף GFP דיאצ'ל גליצרול קינאז גמא עם חומצה אצ'ידונית גורם לאפנן של לוקליזציה תת תאית של גמא גליצרול קינאז דיאצ'ל. שינויים דומים דיאסיל גליצרול קינאז גמא לוקליזציה נצפו גם בתאים שטופלו paBhc-AA לאחר חשיפה לאור UV. בעת ביצוע ניסויי caging בפתרונות מימדיים הגדלת מדיום תרבות, הקפד תמיד לעבוד תחת מנורה פלואורסצנטי עם מסנן אורך גל קצר כתרים.בעקבות הליך זה, אתה יכול ללמוד תרכובות בכלוב כי כבר בשפע לשימוש בניסויים ביולוגיים בשל חוסר מיסות מים, חרניות קרום או יכולת מיקוד הסלולר.

design-synthesis-photochemical-properties-clickable-caged

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

חלקיקים adenovirus מתוכננים להכיל אנלוגי טבעי חומצת אמינו azidohomoalanine או סוכר...

שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

מולקולות צבע אורגניות וננו-חלקיקים הממירים חומצה אולאית אינם מסיסים במים. פרוטוקול זה מתאר שיטת 'הכנס והפעל' המאפשרת העברה של מולקולות צבע אורגניות והמרת חלקיקים מהממס ההידרופובי הראשוני שלהם למים.

שיטה &#39;הכנס והפעל&#39; ליצירת Nanoassemblies מים מסיסות המכיל פולימר amphiphilic, צבעים אורגניים וupconverting חלקיקים

צבעי ציאנין עמידים לאור מחוברים לאוליגונוקלאוטידים כדי לנטר הכלאה על ידי העברת אנרגיה.

סינתזה של בדיקות הכלאה DNA הסטה אורך גל על ​​ידי שימוש photostable Cyanine צבעים

פרוטוקול זה מפרט את הצעדים החשובים הנדרשים bioconjugation של ציסטאין המכיל חלבון על maleimide, כוללים טיהור מגיבה, תנאי תגובה, טיהור bioconjugate ואפיון bioconjugate.

סינתזה של חלבון Bioconjugates<em&gt; דרך</em&gt; כימיה ציסטאין-maleimide

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי חלבונים קושרי מולקולות קטנים באמצעות תיוג פוטו-אפיניטי. היתרון בטכניקה זו הוא שקישור ותיוג קוולנטי של חלבוני המטרה מתרחש בסביבה התאית החיה, ומסיר את הסיכון לשיבוש מבנה החלבון המקומי ותנאי הקישור עם ליזיס התאים.

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להחדרת בדיקות כימיות באופן ספציפי לתוך מקטע נוגדנים על ידי שילוב גנטי של חומצת אמינו המכילה אזיד, ולאחר מכן צימוד האזיד עם בדיקה כימית על ידי תוספת ציקלו-אזיד-אלקין המקודמת על ידי זן (SPAAC).

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

ב פרוטוקול זה, בכלובים קינאז A (PKA), bioeffector התמרה חושית אותות סלולריים, היה מרותק למיטה על משטח ננו-חלקיק microinjected לתוך ציטוזול, מופעל על ידי upconverted UV אור אינפרא אדום (ניר) הקרנה, גרימת מתח הזרם התפוררות סיבים ב ציטוזול.

מערכת משולבת להפעיל מרחוק אותות תאיים על-ידי Photoactivation קינאז בתיווך Upconversion ננו-חלקיק

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

פרוטוקול זה מתאר מבוססות אור רוברטסונית הגרעין של האורחים בתאים חיים באמצעות תגי דבק מולקולרית בכלובים. שיטה זו היא מבטיחה עבור משלוח סמים פילוח גרעיני האתר סלקטיבית.

Spatiotemporally מבוקר גרעיני טרנסלוקציה של האורחים בתאים חיים באמצעות דבקים מולקולרית בכלובים כמו Photoactivatable תגיות

למד שיטת סינתזה לתרכובות בכלוב לחיצים עם תכונות נוספות כמו מסיסות במים ויכולת מיקוד תאית. פרוטוקול זה מאפשר הכנת תרכובות פוטוכימיות יציבות לשימוש במחקר עצבי.

עיצוב, סינתזה ומאפייני פוטוכימיקלים של תרכובות בכלוב לחיצים

גלה סרטונים נוספים