עיצוב, סינתזה ומאפייני פוטוכימיקלים של תרכובות בכלוב לחיצים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק שיטה מעשית להכנת תרכובות photocaged עם תכונות נוספות כגון מנושלות מים או יכולת מיקוד הסלולר. באמצעות הליך סינתטי פשוט, טכניקה זו יכולה לשמש כדי להרחיב את המעבדה על תרכובות בכלוב כדי להפוך תרכובות בכלוב עם תכונות נוספות מבלי להתפשר על רגישותם. סינתזה זו יכולה להתבצע במעבדה סטנדרטית כמו תרכובות בכלוב קליק שלנו יציבים הקרנת צילום כאשר מומסים ממיסים אורגניים שאינם נוקלאופיליים כגון dichloromethane או דימתיל סולפוקסיד.

הדגמת ההליך עם הירונה ססקי תהיה אקינובו סוזוקי, פוסט דוק, האנמי אאוקי ו ריי ווטאקי, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה. התחל על ידי הוספת 709.6 מיליגרם של paBhc מתנול ו 397.6 מיליגרם של n n-carbonyldiimidazole לתוך בקבוק 30 מיליליטר עגול התחתון. מוסיפים שישה מיליליטר יבשים של דיכלורומטן לבקבוק ומערבבים את הפתרון בטמפרטורת הסביבה במשך שעה.

בסוף הדגירה, מוסיפים 342.8 מיליגרם של 4-דימתילמינופילורידין ו-552 מיקרוליטרים של טרט-בוטיל שישה אמינו הקסיל קרבמט, ומערבבים את הפתרון בטמפרטורת הסביבה במשך שלוש שעות נוספות. לאחר מכן השתמשו באידוי סיבובי תחת ואקום כדי להסיר את הממס וחומרים נדיפים אחרים, ולהשתמש כרומטוגרפיה עמוד פלאש ג'ל סיליקה כדי לטהר את השאריות ישירות. כדי להתקין יחידה פונקציונלית לתוך תרכובת הכלוב ללחיצה, להמיס 249 מיליגרם של נחושת שני פנטהידרט סולפט ב 10 מיליליטר של מים מוחלפים יונים לתת 0.1 נחושת גופרתית טוחנת.

להמיס שמונה מיליגרם של שני paclitaxel מדומה paBhc, 7.5 מיליגרם של טריס (3-הידרוקסיפרופילטריאזולימילמיל)אמין, 162.4 מיליגרם של נתרן-l-אסקורבאט, ו 3.1 מיליגרם של 15-כלורו-3, 6, 9 טריוקסיפנטילדקיל אזיד בממס מעורב של 2.5 מיליליטר של חיץ פוספט טוחן 0.1 ו 0.5 מיליליטר של דימתיל סולפוקסיד. לאחר מכן, להוסיף 81.2 microliters של 0.1 תספורת נחושת גופרתית טוחנת לתערובת התגובה ומערבבים את התערובת בטמפרטורת הסביבה במשך 80 דקות, ניטור התקדמות התגובה עם HPLC. בסוף התגובה, לפתור את המדליפים עם 3.5 מיליליטר של 75%אצטיל פתרון מים nitryl ולהחיל את הפתרון וכתוצאה מכך ישירות על מערכת HPLC חצי הכנה כדי לטהר את המוצר הרצוי.

עבור מדידות יעילות קוונטית, תחת מנורות פלואורסצנט מכוסה אור UV לחתוך את המסנן, לדלל את פתרון מלאי מדגם ב 10 microliters של דימתיל סולפוקסיד עם 10 מיליליטר של חיץ KMOPS. העבר aliquot של הפתרון לתוך אותה מבחנה המשמשת בתגובת צילום של actinometer כימי. הקרין את פתרון הדגימה עם אור 350 ננומטר למשך חמש שניות, תוך הסרת 50 אליקוטים מיקרוליטר מהפתרון מוקרן מעת לעת לניתוח על ידי HPLC.

לאחר מכן לקבוע את זמן ההקרנה בשניות שבו 90% מהחומר ההתחלתי הגיב על ידי חלקות מתאימות של היעלמות תלויי זמן של החומר ההתחלתי. עבור פילוח Ligand HaloTag של תרכובת בכלוב ללחיצה, לקצור את אוכלוסיית תא היעד של עניין עם ניתוק התא המתאים reagent ולהשעות מחדש את התאים ב 2.5 פעמים 10 לתאים החמישי למיליליטר של ריכוז DMEM. ואז לזרוע כ 10 לתאים החמישיים לכל מנה לתוך 35 מיליליטר זכוכית תחתונה מנות עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

למחרת בבוקר, לדלל 14 מיקרוגרם של ה-DNA PC שלושה קולטן גורם גדילה הילה פלזמה DNA בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל 700 microliters של מדיום סרום מופחת. לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של reagent lipofection ב 150 microliters של מדיום סרום מופחת לכל אחד מארבעה צינורות ולאפשר את הצינורות לעמוד בטמפרטורת הסביבה במשך חמש דקות. בסוף הדגירה, מוסיפים 150 מיקרוליטרים של דנ"א פלזמה מדולל לכל אחת מדגימות השפתיים המדוללים ומדגרים את הדגימות בטמפרטורת הסביבה במשך חמש דקות נוספות.

בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS לכל מנה ולהוסיף 1.5 מיליליטר של מדיום סרום מופחת לכל תרבות. מוסיפים 150 מיקרוליטרים של קומפלקס ריג'נט ליפוקציה פלסמיד לכל מנה ומחזירים את התאים לאנקובטור תרבות התאים למשך 48 שעות. בסוף הדגירה, שאפו את העל-טבעיים והוסיפו מיליליטר אחד של DMEM טרי בתוספת שתי הילה הקסדצית של ה-paBhc לכל מנה.

לאחר 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, שאפו את המדיום המכיל את התרכובת הכלואה ושטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS פלוס כדי להסיר את כל תרכובות לא מאוגדות. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מדיום סרום מופחת לכל מנה ומחזירים את התאים לאנקובטור תרבות התאים למשך 30 דקות נוספות כדי להסיר את התרכובות שנכנסו לתאים. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS בתוספת למנה ולהוסיף מיליליטר אחד של בינוני ללא פנול אדום לכל תרבות.

לאחר מכן להקליט את תמונות florescence על ידי לייזר סריקת מיקרוסקופיה פלורסנס confocal. עבור אפנון מתווך צילום של לוקליזציה קינאז באמצעות תרכובת בכלוב ללחיצה, זרע כחמש פעמים 10 לתאי TOC-A-אחד החמישי בשני מיליליטר של מדיום F12 של האם לכל צלחת תחתונה זכוכית 35 מיליליטר. למחרת, להדביק את התאים עם קידוד פלסמיד עבור GFP diacyllycerol קינאז גמא במשך 48 שעות כפי שהודגם רק.

לאחר סיום ההחלפה, החלף את על-טבעי ההמרה בשני מיליליטר של מדיום סרום מופחת. הוסף 20 microliters של 100 פעמים paBhcAA פתרון עבודה לתאים עבור דגירה חמש עד 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. בסוף הדגירה, מניחים את המנה על השלב האובייקטיבי של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד באור כפול של תאורת פלואורסצנטיות.

תמונה התאים כל 10 שניות במשך 10 דקות תוך הקרנה של התאים בנקודות הזמן הניסיוניות המתאימות אורכי גל על פי פרוטוקול הניסוי. באמצעות שיטה זו כפי שהודגם, תרכובות בכלוב ללחיצה של כמה מולקולות מעניינות ביולוגית, כולל paclitaxel וחומצה אצ'ידונית, ניתן לסנתז בהצלחה. מאפיינים נוספים כגון מיזות המים ויכולת מיקוד הסלולר ניתן להציג לתוך paclitaxel מדומה paBhc באמצעות נחושת אחת קטליזציה מחזורית לחץ תגובה.

אלה paclitaxels בכלוב ללחיצה אז ניתן להצטלם כדי לייצר תרכובות ההורה שלהם על הקרנה ב 350 ננומטר. המאפיינים הפיזיים והפפוטוכימיים של התרכובות הכלוכלות הניתנות ללחיצה מסוכמים בטבלה. בניסויים בתאים חיים, המיקוד של הילה paBhc hex fitzi לתאי יונקים מתורבתים מבטא באופן חולף חלבון HaloTagged קולטן גורם גדילה אפידרמיס גורם אות florescence ירוק מן הפלואורסין מויטי PAHBHC hex fitzi הילה על קרום התא.

כמו כן, הטיפול בתאי CHO-K1 מבטא באופן חולף GFP דיאצ'ל גליצרול קינאז גמא עם חומצה אצ'ידונית גורם לאפנן של לוקליזציה תת תאית של גמא גליצרול קינאז דיאצ'ל. שינויים דומים דיאסיל גליצרול קינאז גמא לוקליזציה נצפו גם בתאים שטופלו paBhc-AA לאחר חשיפה לאור UV. בעת ביצוע ניסויי caging בפתרונות מימדיים הגדלת מדיום תרבות, הקפד תמיד לעבוד תחת מנורה פלואורסצנטי עם מסנן אורך גל קצר כתרים.

בעקבות הליך זה, אתה יכול ללמוד תרכובות בכלוב כי כבר בשפע לשימוש בניסויים ביולוגיים בשל חוסר מיסות מים, חרניות קרום או יכולת מיקוד הסלולר.