Name: הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: למדו פרוטוקול דיסוציאציה מכנית לבידוד מהיר של מקרופאגים מגנגליון השורש בעכברים. שיטה זו מאפשרת ניתוח פנוטיפי ומיון תאים פלואורסצנטי לחקר תגובות נוירואימונולוגיות בכאב נוירופתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי: הקרן לחינוך הרדמה ומחקר (XY); המחלקה לטיפול בהרדמה מרבית (XY); ו-1R01NS100801-01 (GZ). מחקר זה היה נתמך בחלקו על ידי HDFCCC המעבדה לניתוח תא משאבים משותפים באמצעות מענק NIH (P30CA082103).

כל ניסויים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו ונערכו על פי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. לאסוף DRG המותני מפני עכברים ניסיוניים
<ol><li>לפני תחילת הניסוי, להכין את פתרון העבודה של בינוני הצפיפות מעבר הצבע (למשל, חלחול) על ידי ערבוב 9 כרכים של המדיום עם 1 נפח של Ca+ +/Mg+ + +-10X לחינם hbss. . שמור על הקרח</li>
	<li>הדבר עם העכבר באמצעות 2.5% Avertin. ודא כי החיה מורדם לחלוטין על ידי חוסר תגובה הצביטה האחוריות. הערה: שני העכברים זכר ונקבה בגילאי 6-8 שבועות שימשו.</li>
	<li>מבשם העכבר ההמרה עם 10 מ ל של טרום מקורר 1x PBS.<ol>
<li>למקם את העכבר במצב פרקדן עם ארבע כפות רגליים מאובטח עם הקלטת בתוך מכסה כימית. הרם את העור מתחת לכלוב הצלעות על ידי מלקחיים, ובצע חתך קטן עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף את הכבד ואת הסרעפת.</li>
		<li>המשיכו להשתמש במספריים כדי לחתוך את הסרעפת ואת כלוב הצלעות, פתחו את חלל הצפק כדי לחשוף את הלב הפועם.</li>
		<li>חותכים במהירות את התוספת. הימנית עם מספריים קשתית לאחר הדימום הוא ציין, הכנס מחט של 30 גרם לקצה האחורי של החדר השמאלי, ובאיטיות להזריק 10 מ ל לפני מקורר 1x PBS לבשם החיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע כריתת למינציה מלאה15 על העכבר ממוקם בתנוחה נוטה. הערה: אם תרבות התא מתוכננת, לרסס את העכבר עם 70% אתנול לפני החיתוך ולהשתמש טרום מעוקר כלי ניתוח לניתוח.<ol>
<li>השתמש בגודל 11 אזמל לעשות חתך אחד האורך לרוחב עמוק החל מאזור בית החזה מטה אל האזור הסאקרל. להסיר את העור על ידי המספריים כדי לחשוף את שכבת השריר.</li>
		<li>השתמשו בפרידמן-פירסון Rongeur כדי לקלף את רקמות החיבור והשרירים עד לחשיפת תהליכי השידרה והתהליכים הדו הדו-צדדיים.</li>
		<li>השתמש מספריים האביב Noyes כדי לפתוח בזהירות את עמוד השדרה השמאלית, ואז לעבור לכיוון של פרידמן-פירסון Rongeur כדי להסיר את העצמות החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה עם עצבים שלמים השדרה מחוברת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בזהירות בנתח המותניים והצלעות מותניים המותני (L4/L5 DRG במחקר שלנו) ולמקם אותו 1 מ ל של קרח קר Ca+ +/Mg+ +-חינם 1X Hbss ב-dounce רקמת הומוגנגניזר. . עכשיו הרקמות מוכנות לשלב 2 הערה: קצץ את עצב העמוד השדרה המצורפת ל-DRG אם אפשר.</li>
</ol>2. לבודד תאים בודדים מ-DRG המותני העכבר
<ol><li>המגון את רקמת DRG עם מכתש רופף ב-20-25 פעמים.</li>
	<li>מקום סטרילי 70 יקרומטר תא ניילון מסננת בשפופרת סטרילי 50 mL. הרטוב מסננת התא עם 800 μL של קרח קר 1x HBSS, ואת הזרימה-through נאסף בצינור חרוט.</li>
	<li>לאסוף את ההשעיה רקמת הומוגניים מתוך הומוגניצר באמצעות פיפטה ולעבור דרך הרטוב 70 יקרומטר מסננת תא ניילון לתוך צינור הצינורית של 50 mL.</li>
	<li>לשטוף את ההומוגנידה פעמיים עם 800 μL של קרח קר 1x HBSS ולאחר מכן decant לתוך שפופרת באותו 50 mL עם מסננת תאים כדי להגדיל את התשואה.</li>
	<li>הוסף 1.5 מ ל של צפיפות הקרח בינונית-קר isotonic מעבר בינוני (מוכן בשלב 1.1) לתוך שפופרת סטרילי 5-mL פוליסטירן מוקצף.</li>
	<li>להעביר את התא המגון מצינור 50 mL (בשלב 2.4) לתוך צינור FACS, מערבבים היטב עם צפיפות מעבר הצבע בינוני על ידי ליטוף למעלה ולמטה. הוסף 500 μL נוספים של 1x HBSS כדי לחתום את החלק העליון.</li>
	<li>כדור התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>המכיל את המיאלין במדיום מבלי להפריע. לגלולה הסלולרית בתחתית הצינורית</li>
	<li>השהה מחדש את התאים במאגר ה-PBS או ה-FACS המכיל 5% סרום של שור עוברי (FBS) לניתוח FACS. הערה: לפחות 50,000 כדי 100,000 תאים צפויים מ L4/L5 DRG של עכבר אחד.<ol>
<li>מחדש את התאים DRG מכני מכנית (L4/L5) ב 100 μL של PBS המכיל 5% סרום שור עוברי ולאחר מכן דגירה עם α-עכבר CX3CR1-APC נוגדן (1:2000) בחושך על 4 ° c עבור 1 h.</li>
		<li>שטוף את התאים עם 5 מ ל של PBS פעם אחת; צנטריפוגה את התאים 360 x g עבור 8 דקות ב 4 ° c.</li>
		<li>ואז להשעות מחדש את הגלולה בתא 300 μL של PBS עבור ניתוח FCAS. אם מתוכנן מיון תאים, השהה מחדש את התאים במאגר ה-FACS במקום זאת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+regulation+by+non-neuronal+cells+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation.</a> Science. 354 (6312), 572-577 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+types+of+macrophage+in+dorsal+root+ganglia+and+spinal+nerves+proximal+to+sciatic+and+spinal+nerve+transections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat.</a> Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).</li>
<li>Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+cargo+including+microRNA+regulates+sensory+neuron+to+macrophage+communication+after+nerve+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma.</a> Nature Communication. 8 (1), 1778(2017).</li>
<li>Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+differences+in+neuropathic+pain+modalities+revealed+by+correlating+behavior+with+global+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling.</a> Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).</li>
<li>Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglion+Infiltration+by+Macrophages+Contributes+to+Paclitaxel+Chemotherapy-Induced+Peripheral+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy.</a> The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).</li>
<li>Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+macrophages+reduces+axonal+degeneration+and+hyperalgesia+following+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury.</a> Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).</li>
<li>Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+monocytes+synergistically+promote+the+transition+from+acute+to+chronic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury.</a> Nature Communication. 7, 12029(2016).</li>
<li>Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cysteine+protease+cathepsin+S+in+neuropathic+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia.</a> Pain. 130 (3), 225-234 (2007).</li>
<li>Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK%2FNF-kappaB-dependent+satellite+glia+activation+induces+spinal+cord+microglia+activation+and+neuropathic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury.</a> Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).</li>
<li>Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+macrophages+in+generation+of+nerve+injury-induced+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia.</a> Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).</li>
<li>Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+the+peripheral+nervous+system+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury.</a> Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).</li>
<li>Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy6G-+myeloid+cells+mediate+mechanical+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Lin, Y. T., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Isolation+and+Primary+Culture+to+Study+Neurotransmitter+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release.</a> Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).</li>
<li>Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+macrophage+ablation+in+transgenic+mice+expressing+a+Fas-based+suicide+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).</li>
<li>Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+peripheral+not+central+immune+responses+to+pain-inducing+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury.</a> Science Reports. 7 (1), 16460(2017).</li>
<li>Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+Activation+of+Primary+Sensory+Neurons+Contributes+to+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine+protease+inhibitor+SerpinA3N+attenuates+neuropathic+pain+by+inhibiting+T+cell-derived+leukocyte+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase.</a> Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים הקשורים לכתב יד זה.

כאן אנו מציגים שיטה חדשה ביעילות להעשיר מקרופאגים מבודדים מ DRG העכבר. הגישה המקובלת לבודד התאים החיסוניים drg דורש עיכול אנזימטית15,18, אשר מוחלף כעת עם המגון מכני בפרוטוקול שלנו כדי להגביל את הנזק הסלולרי בלתי רצוי ולהגדיל את התשואה. לכן, הפרוטוקול החדש הוא הרבה פחות זמן רב. חשוב מכך, עיכול האנזים עלול לגרות את המקרופאגים ולשנות את החתימה המולקולרית. לעומת זאת, הגישה המכנית שלנו מגבילה מאוד את הלחץ התאי.
באמצעות ניתוח FACS, אנו עוד ל...

יש כעת ראיות רבות כי התאים החיסוניים תורמים לכאב נוירופתי בעקבות פציעת העצב ההיקפי1,2. תאים היקפיים, כולל מקרופאגים בוגרים, ידועים כתגובה לפגיעה ברקמות ולזיהום מערכתי באמצעות phagocyציטוזה, מצגת אנטיגן, ושחרור cyטוקין. מקבילים נזק עצבי המושרה מיקרוגלייה הפעלה בקרן השדרה, מקרופאגים ב גרעינים שורש השורש (drg) גם להרחיבבאופן משמעותי לאחר פגיעהבעצב 3,4. במיוחד, ישנם האינטרסים גוברת כדי לקבוע אם המקרופאגים תורמים להתפתחות כאב נוירופתי לאחר פגיעה בעצב היקפי על ידי אינטראקציה עם נוירונים חושים ב drg5,6,7, בן שמונה , מיכל בן 10 , מיכל עשור , 11. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה גם לסבך את התרומה של מקרופאגים drg בתיקון סיבי לאחר פציעה העצב12,13. עוד מחקר מציע כי מקרופאג תת אוכלוסיות (כלומר, CD11b+Ly6Chi CD11b+Ly6Cנמוך/ תאים) עשוי לשחק תפקיד אחר ברגישות יתר מכני14. לכן, פנוטיפים במהירות את התגובה של מקרופאגים DRG בהקשר של פגיעה בעצב עשוי לעזור לנו לזהות גורמים נוירוחיסוניים התורמים לכאבים נוירופתיים.
מקובל, הפרוטוקול לבודד מקרופאגים ב-drg כרוך בשלבים מרובים כולל עיכול אנזימטי15,16. הטכניקה היא לעתים קרובות זמן רב והוא יכול להיות יקר עבור ניסויים בקנה מידה גדול. למרות העיכול מתון עם קולגן הסוג השני (4 מ"ג/mL) ו dispase סוג II (4.7 mg/mL) עבור 20 דקות היה מומלץ בעבר15, זה אפשרי כי תאים לאחר החשיפה אנזים זה נוטים לנזק לתאים או מוות התא, אשר עשוי להוביל נמוך תשואה. בנוסף, ההפרש באיכות האנזימים מאצווה לאצווה עלול להשפיע עוד יותר על היעילות של תהליך זה. חשוב מכך, מקרופאגים שנחשפו לעיכול האנזים עשוי להיות גירוי בלתי צפוי, וכך יכול להיות מאוד שונה מהמצב in-vivo. השינויים עשויים לסבך את תוצאת המחקר הפונקציונלי.
כאן נתאר פרוטוקול ללא אנזים כדי לבודד במהירות DRG מקרופאגים ב-4 ° c באמצעות דיסוציאציה מכנית. הדגימות נשמרות בקרח. כדי להגביל את הלחץ התאי כתוצאה מכך, הגישה שלנו מספקת יתרון כדי לשמור על עקביות של הבידוד, ואת התאים הבודדים הם ככל הנראה בריאים יותר מגורה פחות. אנחנו עוד להציג את הראיות כדי לאמת את האיכות של תאים מבודדים עם מיון המופעל באמצעות תאים פלואורסצנטית (FACS).

<table><tbody><tr><td>AP20187</td><td>Clontech</td><td>635058</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-עכבר CX3CR1-APC נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>149007</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים (70 מ"מ ניילון)</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Dounce הומוגנייזר רקמות</td><td>Wheaton</td><td>357538 ( 1 מ"ל)</td><td></td></tr> <tr><td>שפופרות FACS (5 מ"ל)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x, Ca++/Mg++-free)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Spring Scissor</td><td>FST</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P4937-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma</td><td>P4864-10 מ"ל</td><td></td></tr></tbody></table>

הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

ישנם אינטרסים הגדלים כדי ללמוד את האינטראקציות המולקולריות והסלולר בקרב תאים חיסוניים ונוירונים חושים בתוך גנגליה שורש הגוף לאחר פציעה עצבית היקפית. תאים מונציטוטיים היקפיים, כולל מקרופאגים, ידועים להגיב לפגיעה ברקמה באמצעות phagocyציטוזה, מצגת אנטיגן, ושחרור cy,. ראיות מתעוררים יש מעורב את התרומה של מקרופאגים השורש הדו להתפתחות הכאב נוירופתי ותיקון סיבי בהקשר של פגיעה בעצב. פנוטיפים במהירות (או "בידוד מהיר של") התגובה של מקרופאגים השורש הדו בהקשר של פגיעה בעצב רצוי לזהות את הגורמים הנוירוחיסוניים לא ידוע. כאן אנו מדגימים כיצד המעבדה שלנו במהירות וביעילות מבודד מקרופאגים מהגנגוליה השורש הגבי באמצעות פרוטוקול דיסוציאציה ללא אנזים מכני. הדגימות נשמרות על הקרח. כדי להגביל את הלחץ התאי פרוטוקול זה הוא הרבה פחות זמן רב בהשוואה לפרוטוקול אנזימטי הסטנדרטי ושימש באופן שגרתי עבור ניתוח מיון התאים שלנו מסוג פלואורסצנטית.

כדי לאמת את התאים הבודדים, בחרנו לראשונה את מקרופאג המושרה ואפופטוזיס (מאפיה) עכברים הטרנסגניים17. השורה הזאת מבטאת inducible סמים-FK506-מחייב חלבון (FKBP)-גן היתוך ההתאבדות בשיא הירוק חלבון (eGFP) תחת השליטה של היזם של CSF1 קולטן (CSF1R), אשר מבוטא במיוחד הן מקרופאגים והן microglia. הזרקה מערכתית של dimerizer חלבון מחייב, AP20187 (AP), מעורר ואפופטוזיס של התאים המבטאים את הטרנסגנטית. הביטוי של EGFP גם מאפשר לנו לפקח על מקרופאגים ב-DRG. כדי לרוקן מקרופאגים בעכברי המאפיה, התחלנו את הלימודים שלנו עם...

כאן אנו מציגים פרוטוקול דיסוציאציה מכנית לבודד מקרופאגים במהירות מתוך גנגליון שורש השורש עבור פנוטיפים וניתוח פונקציונלי.

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

ראיות מתעוררות סיבכו את התרומה של מקרופאגים גנגליון שורש הגב להתפתחות כאב נוירופתי ותיקון אקסונאלי בהקשר של פגיעה עצבית. במהירות phenotyping התגובה של מקרופאגים גנגליון שורש הגבי הוא הרצוי לזהות את הגורמים הנוירואימוניים לא ידוע. כאן אנו מדגימים כיצד המעבדה שלנו מבודדת במהירות וביעילות מקרופאגים מחבורת השורש הגבית באמצעות פרוטוקול דיסוציאציה מכני ללא אנזימים.פרוטוקול זה הוא הרבה פחות זמן רב בהשוואה לפרוטוקולים אנזימטיים סטנדרטיים, ואנחנו כבר השתמשנו בו באופן שגרתי לניתוח מיון התאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות שלנו. לפני תחילת הניסוי, להכין את פתרון העבודה של המדיום שיפוע צפיפות על ידי ערבוב תשעה כרכים של המדיום עם נפח אחד של סידן ומגנזיום חינם 10X HBSS ולשמור אותו על קרח. ודא שהעכבר הוא הרדמה מלאה על ידי חוסר תגובה לצביטת הכפות האחורית.התחל על ידי הצבת עכבר הרדמה בתוך מכסה המנוע אדים כימי בתאונת סופין עם ארבע כפות מאובטח עם סרט הדבקה. השתמש מדפים כדי להרים את העור מתחת לבית החזה. ואז עם מספריים כירורגיים, לעשות חתך קטן כדי לחשוף את הכבד ואת הסרעפת.באמצעות אותם מספריים, חותכים את הסרעפת ואת בית החזה. ואז לפתוח את חלל pleural לחשוף את הלב הפועם. הבא עם מספריים איריס, לחתוך במהירות את התוספת פרוזדורים הימנית.לאחר הדימום הוא ציין, להכניס מחט 30 מד לתוך הקצה האחורי של החדר השמאלי לאט להזריק 10 מיליליטר של PBS 1X מקורר מראש כדי לבלבל את החיה. כדי לבצע כריתת למין הגבית, מניחים את העכבר במצב נוטה. השתמש בגודל 11 אזמל כדי להפוך שני חתכים עמוקים אורך הצדדי החל מאזור בית החזה עד לאזור sacral.לאחר מכן להסיר את העור חושף את שכבת שריר הגב. לאחר מכן, עם Friedman-Pearson rongeur, לקלף את רקמות החיבור והשרירים עד תהליכי עמוד השדרה lumbosacral ותהליכים רוחביים דו צדדיים נחשפים. ראשית, השתמש ברונגור פרידמן-פירסון כדי לפתוח בזהירות את עמוד השדרה הגבי, ולאחר מכן עבור בין מספריים של פרידמן-פירסון ונויס כדי להסיר את עצמות החוליות, ולחשוף את חוט השדרה עם עצבי עמוד שדרה שלמים מחוברים.בזהירות לנתח DRG מותני ipsilateral ו contralateral. מניחים אותו למיליליטר אחד של סידן קר כקרח ו- HBSS 1X ללא מגנזיום ב homogenizer רקמת Dounce. הומוגניזציה של רקמת DRG ב homogenizer Dounce עם עלה רופף במשך 20 עד 25 פעמים.מניחים מסננת תאי ניילון סטרילית של 70 מיקרומטר בצינור חרוט סטרילי של 50 מיליליטר. השתמש 800 microliters של קוד קרח 1X HBSS כדי להרטיב את מסננת התא. השתמש פיפטה כדי לאסוף את ההשעיה רקמה הומוגנית מן homogenizer על מסננת תאים רטובים, ולאסוף אותו לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.לשטוף את homogenizer פעמיים עם 800 microliters של קרח קר 1X HBSS, איסוף הנוזל לתוך אותו צינור חרוט 50 מיליליטר כדי להגדיל את התשואה. הוסף 1.5 מיליליטר של קר קרח שמיש בינוני צפיפות איזוטונית לתוך צינור בקבוק פוליסטירן סטרילי חמישה מיליליטר. העבר את הומוגניט התא מצינור חרוט 50 מיליליטר לתוך צינור בקבוקון זה.ופיגט למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. הוסף 500 מיקרוליטרים נוספים של HBSS 1X כדי לאטום את החלק העליון. צנטריפוגה התאים ב 800 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בזהירות שאף את העל-טבעי המכיל מילין במדיום מבלי להפריע לכדור התא בתחתית הצינור. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS המכילים סרום בקר עוברי של 5% לכדור, והשעו מחדש את תאי ה-DRG. לאחר מכן להוסיף עכבר אלפא CX3CR1 נוגדן APC לתאים דגירה בחושך בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לשטוף את התאים פעם אחת עם חמישה מיליליטר של PBS. צנטריפוגה התאים ב 360 פעמים G במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאף את העל-טבעי, ולאחר מכן השהה מחדש את גלולת התא ב-300 מיקרוליטרים של PBS לצורך ניתוח עובדות.לאחר זריקות תוך-פרטיות של חומר דימרייזר חלבון מחייב FK AP לעכברי MaFIA כדי לרוקן מקרופאגים, היה אובדן משמעותי של תאים חיוביים GFP ב DRGs של עכברים שטופלו ב- AP בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב מבוקר. ניתוח עובדות חשף דלדול מוצלח של אוכלוסייה גבוהה GFP בעכברים שטופלו ב- AP והדגים את האיכות הגבוהה של תאים מבודדים. 4% מכלל התאים המבודדים מה-DRG של בעלי חיים שטופלו ברכב היו מקרופאגים גבוהים של GFP.לעומת זאת, רק 0.4% מכלל תאי ה-DRG היו מקרופאגים גבוהים של GFP בעכבר שטופל ב- AP. תאי DRG מבודדים מכנית מעכברים מסוג בר היו מוכתמים בנוגדן CX3CR1-APC של עכבר אלפא. 6% מתאים DRG היו מקרופאגים חיוביים CX3CR1.כאשר הכדאיות התא הוערך עם propidium יודיד, זה גילה כי יותר מ 80% של תאי DRG מבודדים טריים היו קיימא. אם תפוקת התאים הלא מספקת תצוין, ייתכן שיש חשד להומוגניזציה לא מספקת או מוגזמת של רקמת DRG. בנוסף, ניתוח DRG עשוי לדרוש תרגול חוזר למתחילים.סביר להניח שניתן להרחיב את היישום של הפרוטוקול שלנו כדי לחקור תאים לא עצביים אחרים כגון תאי לווין ותאי T. ייתכן שיהיה צורך במחקרים נוספים כדי לאשר את האפקטיביות של בידוד התא.

rapid-isolation-of-dorsal-root-ganglion-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים פרוטוקול נטול אנזימים לבידוד מקרופאגים מגנגליון שורש גבי של עכבר (DRG) באמצעות טכניקת דיסוציאציה מכנית. לאחר הומוגניזציה של רקמת DRG שזה עתה נאספת, נוגדנים כנגד קולטני פני התא על המקרופאגים משמשים לסימון התאים באופן פלואורסצנטי, ולאחר מכן ביצוע ציטומטריית זרימה כדי לאשר את נוכחותם של מקרופאגים בדגימה.

בידוד מקרופאגים מגנגליון שורש גבי עכברי באמצעות דיסוציאציה מכנית

סרטון זה מדגים שיטה לקצירת תאי עצב מגרעיני השורש הגבי (DRG). DRG מעמוד השדרה של חולדה מבודד, מטופל באנזימים, ולאחר מכן מנותק מכנית כדי להשיג תרחיף חד-תאי. תאי העצב מופרדים מתאי גלייה באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות ומתורבתים במדיום גידול.

טכניקה לקצירת וניתוק גרעיני שורש גבי עבור תרביות עצביות

סרטון זה מדגים פרוטוקול להעשרת תרביות עצביות מגרעיני שורש גבי על ידי אימונופנציה, ובכך לשפר את טוהר ותועלת למחקר נוירולוגי.

העשרה עצבית של גרעיני שורש גבי על ידי אימונופנינג

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גרעיני שורש גבי (DRG) מעמוד השדרה של החולדה. DRGs שנכרתו מעמוד השדרה מטופלים באנזימים ומנתקים מכנית כדי להשיג תרחיף חד-תאי. התאים מגודלים בתרבית בתווך המכיל מעכבים וגורמי גדילה המגבילים את התפשטות תאי הגליה ומקדמים צמיחה עצבית, בהתאמה.

הקמת תרבית תאי גרעיני שורש גבי ראשונית מעמוד השדרה של חולדה

גרעיני גב שורש (DRG) הם מבנים המכילים את תאי העצב התחושתיים של מערכת עצבים ההיקפית. כאשר ניתק, הם יכולים להיות שיתוף תרבותי עם תאים כמו SC-המופק שומן גזע (ASC), מתן מודל רב ערך כדי ללמוד במבחנה התחדשות עצב וmyelination, מחקה את סביבת in vivo באתר הפציעה.

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של נוירונים של גנגליון שורש הגב (DRG) שבודדו מחולדות ואת התרבית של נוירוני DRG על מערכת תרבית תאים סטטית מתוחה מראש כדי לשפר את יישור האקסונים, עם תרבית משותפת של תאי שוואן (SCs) כדי לקדם מיאלינציה.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשחול הידראולי של חוט השדרה וכן זיהוי ובידוד של גרעיני שורש גב ספציפיים (DRGs) באותו מכרסם. בהשוואה לשיטות בידוד חוט השדרה הסטנדרטיות, שיטה זו מהירה משמעותית ומפחיתה את הסיכון לנזק לרקמות.

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

שורש העץ הגרעינים (DRG) ראשי תרבויות משמשים לעתים קרובות כדי לחקור פונקציות פיזיולוגיים או אירועים הקשורים לפתולוגיה, החישה הניריונים. כאן, נדגים את השימוש המותני תרבויות DRG כדי לזהות את השחרור של הנוירוטרנסמיטרים לאחר neuropeptide FF קולטן הקלד 2 גירוי עם אגוניסט סלקטיבי.

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

פרוטוקול זה מספק טכניקה לקציר ולתרבית גנגליון שורש גבי (DRG) שנשתל מחולדות בוגרות מסוג Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC).

קציר, הטבעה וטיפוח של גרעיני שורש גבי בהתקנים מרובי תאים לחקר תכונות עצביות היקפיות

גנגליוני שורש גביים (DRG) מכילים גופי תאי נוירון חישה ראשוניים ומעבירים אותות חושיים היקפיים לחוט השדרה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לפירוק DRG בעכברים התומכת בבידוד סטנדרטי של גנגליונים שלמים מבניים, זיהוי סגמנטלי אנטומי, הכוונה אינטואיטיבית למשתמשים מתחילים, והפחתת פגיעות ברקמה פרוצדורלית.

ניתוח ובידוד של גנגליוני שורש גבי בעכבר

למדו פרוטוקול דיסוציאציה מכנית לבידוד מהיר של מקרופאגים מגנגליון השורש בעכברים. שיטה זו מאפשרת ניתוח פנוטיפי ומיון תאים פלואורסצנטי לחקר תגובות נוירואימונולוגיות בכאב נוירופתי.

הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש

גלה סרטונים נוספים