שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

רנ"א קטן מווסת תהליכים ביולוגיים רבים. לכן חשוב לפתח שיטות רגישות ולא משוחדות כדי לזהות אותם. פרוטוקול הפרוטוקול שלנו מספק צעדים קדימה לעבר מטרה זו.

הפרוטוקול שלנו סובל מפחות בעיות הטיה, מאשר שיטות ניפוח קלאסיות של ספריית RNA קטנה, וחשוב מכך הוא מאפשר זיהוי רגיש יותר של שני שיניים או מזו-RNAs. כגון מיקרו-RNAs צמחיים. לאחר חילוץ RNA הכולל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.

לפני להפעיל ג'ל אוריאה 15% TBE במשך רבע שעה ב 200 וולט. ומערבבים חמישה עד עשרים מיקרוגרם של רנ"א כולל, בנפח של 5 עד 15 מיקרוליטר, עם נפח שווה של צבע טעינת formamide בצינור 200 מיקרוליטר. לאחר חמש דקות ב 65 מעלות צלזיוס, בתרמוצ'ית עם מכסה מחומם, מיד למקם את הצינורות על קרח לטעון את האחרון ולדגום על הג'ל עם נתיב אחד לפחות ביניהם.

לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב 200 וולט עד bromophenol היגר כשני שלישים של אורך הג'ל. כדי לטעון את ה- RNA, נקבו תחילה את החלק התחתון של צינור צנטריפוגה מיקרו 0.5 מיליליטר חופשי, עם מחט מד 21, והמקמו את הצינור המנוקב בתחתית עגולה ללא גרעין שני צינור מיקרו צנטריפוגה מיליליטר. לאחר מכן, אין לארוב את הג'ל בטמפרטורת החדר עם כתם ג'ל חומצת גרעין במים במשך עשר עד רבע שעה, לפני צפייה בג'ל על טרנסילומינטור.

חותכים את RNA מדגם בין 17 ל 29 להקות סולם נוקלאוטיד, ולהעביר את חתיכת הג'ל לתוך הצינור מנוקב. לסובב את הג'ל במיקרו צנטריפוגה במהירות מקסימלית במשך שתי דקות, ולהסיר את הצינור 0.5 מיליליטר אשר צריך עכשיו להיות ריק. מוסיפים 300 מיקרוליטרים של גרעין חינם 0.3 טוחנות נתרן כלורי לג'ל כתוש, ומנחים את הצינור על מסובב לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, מעבירים את חתיכות הג'ל המרוסקות לעמוד ספין, וצנטריפוגה לשתי דקות במהירות המרבית במיקרו צנטריפוגה. לקבלת חיסול מתאם ראשוני ללא תיחום, יש לערבב ביסודיות עשרה מיקרוליטרים של מים חופשיים עם דגימת ה-RNA המופקת, ולהוסיף שישה מיקרוליטרים של שלושה טוחנות נתרן אצטט עם ערבוב. הוסף 40 microliters של חרוזים טיהור מגנטי, ו 60 microliters של isopropanol לדגימה עם ערבוב יסודי.

ולהדרור את ההשעיה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מניחים את הדגימה על מתלה מגנטי, עד שהפתרון מתבהר. מוציאים את העל-טבעי הצלול ומוסיפים 180 מיקרוליטרים של אתנול טרי 80% לחרוזים.

לאחר 30 שניות, להסיר את האתנול ולסובב בקצרה את הצינור. הסר כל נוזל שיורית שאולי אסף בתחתית הצינור, ולאפשר את חרוזים להתייבש במשך שתי דקות לפני השעיית המדגם מחדש 22 microliters של 10 מילימולרים טריס. לאחר שתי דקות למגנט את הדגימה עד הפתרון נראה ברור.

לאחר מכן, לערבב 20 microliters של על טבעי ברור עם שישה microliters של שלושה אצטט נתרן טוחן בצינור חדש, ולהוסיף 40 microliters של חרוזים מגנטיים ו 60 microliters של 100% isopropanol. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, מגנטים את הדגימה עד שהפתרון נראה ברור, לפני הסרת העל-טבעי. לטפל המדגם עם 180 microliters של 80% אתנול מוכן טרי במשך 30 שניות לפני הסרת אתנול מסתובב במורד המדגם, והסרת כל נוזל שיורית שהצטבר בתחתית הצינור.

לאחר מתן אפשרות חרוזים להתייבש במשך שתי דקות, להשעות אותם מחדש 10 microliters של מים ללא גרעין, במשך שתי דקות, לפני מגנטיזציה המדגם עד הפתרון הופך ברור. לאחר מכן, להעביר תשעה microliters של על טבעי לצינור חדש ולהוסיף מיקרוליטר אחד של חיץ קשירה T4 RNA, ומיקרופוליטר אחד של מים לדגימה. לטיהור ג'ל, הפעל חמישה, עשרה ועשרים מיקרוליטרים של מוצר PCR על ג'ל מקורי של 6%TBE למשך כשעה.

אין להחדיר את הג'ל שהושלם עם כתם ג'ל חומצת גרעין במים במשך עשר עד חמש עשרה דקות, ולהציג את הג'ל על טרנסילומינטור כדי לאפשר מיצוי של רצועת הספרייה 150 זוג הבסיס. מכיוון שקשה לבודד את רצועת 150 זוג הבסיס המייצגת אותם, אלה הספרייה שלנו, בשל נוכחותם של מוצרי צד נודדים היטב תצטרך לחתוך את הג'ל בזהירות רבה. ואז לבודד את RNA כפי שהוכח רק.

לשינוי קובץ רצף גולמי, הורד את קבצי רצף fastq שנוצרו במהלך ריצוף, ואת demultiplexing מראש עם bcl2fastq2 לפי הצורך. הסר רצפי מתאם באמצעות cutodapt, ולהשתמש בפקודה כפי שהודגם. השתמש seqtk כפי שצוין כדי להסיר את הנוקלאוטידים אקראיים מסוף ברצפים קורא.

לאחר מכן השתמש בפקודה awk כמצוין, כדי למחוק את הרצפים קצרים מ- 10 נוקלאוטידים. כדי למפות את הרצפים חתוך, לפתוח miRBase ולהוריד את הקובץ fa בוגרת. השתמש בפקודה כפי שצוין כדי להחליף שאריות U בשאריות T, כדי להניב רשימה מלאה של כל המיקרו RNAs במסד הנתונים, שמקורם במגוון אורגניזמים.

בחר את רצפי המיקרו RNA של האורגניזם המעניין, כאשר הפקודה מסומנת, ומפה את ההקריאות לקובץ באמצעות bowtie2, ללא אי-התאמות. השתמש בכלי כדי ליישר את הרצפים קורא למסד הנתונים, הדורש כי לקרוא ממפה לחלוטין למיקרו RNA של מסד הנתונים, עם כל אי התאמות כפי שצוין. לאחר מכן השתמש בפקודה כדי לבטל את ההיקראות שלא התיישרו.

לאחר טעינת כמויות הולכות וגדלות של ספריית PCR מוגברת על ג'ל כפי שהוכח, ניתן לחלץ את המוצרים המתאימים לגודל הצפוי. לאחר האלוטיון, ניתן לבדוק את הספרייה המטוהרת על שבב אלקטרופורזה ג'ל נימי. בנוסף למוצר הצפוי של 150 זוגות בסיסים, והגדלת חלקם של 130 מינים של זוג בסיסים המתאימים לעמעמי מתאם, נצפו בדרך כלל כאשר כמות הולכת וגדלה של מוצר PCR נטענת.

תוצאות דומות מתקבלות כאשר ספריות מתערובת של RNAs קטנים סינתטיים מוכנים באמצעות רייגנטים מערכות, או חומרים מתכלים אחרים. לשם השוואה, מוצגות תוצאות שפורסמו בעבר עבור אותו תערובת RNA קטנה. כאן, השוואה לביצועים של פרוטוקול TS5 עם פרוטוקול TS סטנדרטי לגילוי של אדם ללא שינוי ושני RNAs צמחים ראשוניים שעברו שינוי O-methal מוצגים.

הגילוי של שני piRNAs O-מתל שונה ראשוני בדגימות אנושיות נבדק גם. כפי שנצפה TS5 preformed טוב יותר באופן משמעותי מאשר TS לגילוי של שני RNAs O-מתל הממשלה, אבל לא עבור RNAs ללא שיפוץ. הכן ספריות שכפול עבור כל דוגמה בתאריכים שונים.

בדרך כלל יש שונות קטנה בין שכפולים שנעשו בו זמנית, או שיכולה להיות שונות משמעותית בין ספריות שהוכנו בתאריכים שונים.