Name: שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 -O-מתיל RNAs (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: למד פרוטוקול משופר להכנת ספריית רנ"א קטן עם פחות הטיה ורגישות גבוהה יותר לזיהוי 2'-O-מתיל RNAs. השיטה מאפשרת זיהוי אמין של micro-RNAs צמחיים וחיסכון בעלויות באמצעות ריאגנטים ביתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי המרכז הלאומי למחקר מדעי (CNRS), האנרגיות החלופיות הצרפתיות והנציבות לאנרגיה אטומית ואוניברסיטת פריס-Sud. כל הכנות הספריה, המאייר רצף וביואינפורמטיקה ניתוחים עבור מחקר זה בוצעו במתקן I2BC הדור הבא (NGS). חברי המתקן I2BC NGS מודעים לקריאה קריטית של כתב היד והצעות מועילות.

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing%3A+implications+of+enzymatic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358(2012).</li>
<li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li>
<li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li>
<li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Silence%22%5BJournal%5D)">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4(2012).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141(2011).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3%27-adapter+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54(2012).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049(2015).</li>
<li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118(2018).</li>
<li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969(2011).</li>
<li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stimulated+ligation%3A+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li>
<li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619(2014).</li>
<li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109(2013).</li>
<li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105(2018).</li>
<li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41(2012).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009(2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הכנה קטנה של ספריית RNA נותרת מאתגרת עקב הטיה, שהוצגה בעיקר במהלך שלבים להטיות במתאם. Rnas עם 2 '-OMe שינוי ב 3 ' סוף שלהם כגון צמח mirnas, pirna חרקים, נמטודות ויונקים, ו rnas מתערב קטן (sirna) חרקים וצמחים הם קשים במיוחד ללמוד כי 2 '-OMe שינוי מעכב 3 ' מתאם הקשר. מספר פתרונות הוצעו בספרות כדי לשפר את פרוטוקולי ההכנה של הספרייה sRNA, אך רוב הקיטים הזמינים מסחרית עדיין מבוססים על פרוטוקול ה-TS הקלאסי, הכולל הטיה חמורה. כמה ' הטיה נמוכה ' ערכות קיימות, עם זאת, כולל את הקיט Nf עם מתאמים אקראיים ו-פג בתגובות הקשר, וערכות כמ...

RNAs קטנים (sRNAs) מעורבים בשליטה של מגוון תהליכים ביולוגיים1. התקנות הרגולטוריות של eukaryotic הן בדרך כלל בין 20 ל-30 nt; שלושת הסוגים העיקריים הם microRNAs (miRNA), piwi-אינטראקציה RNAs (piRNA) ו-RNAs מתערב קטן (siRNA). רמות הביטוי המוטעות היו מעורבים במגוון מחלות2. זה מדגיש את החשיבות של miRNAs בריאות ומחלות והדרישה לכלי מחקר מדויקים, כמותיים כדי לזהות sRNAs בכלל.
רצף הדור הבא (NGS) הוא שיטה נפוצה ללימוד sRNAs. היתרונות העיקריים של ngs לעומת גישות אחרות, כגון ה-PCR כמותי או טכניקות microarray (qpcr), הם שהוא אינו זקוק לידע פריורי של רצפי srna ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לגלות rnas הרומן, ובנוסף הוא סובל פחות מ אותות רקע ואפקטי רוויה. עוד, הוא יכול לזהות הבדלים נוקלאוטיד יחיד ויש לו תפוקה גבוהה יותר מאשר מיקרו מערכים. עם זאת, NGS יש גם כמה החסרונות; העלות של הפעלה ברצף נותרת גבוהה יחסית ותהליך רב הנדרש כדי להמיר מדגם לספריה לרצף עשוי להציג הטיות. בתהליך ההכנה האופייני של ספריית srna, מתאם 3 מגיע לראשונה ל-srna (לעתים קרובות ג'ל מזוקק מ-rna הכולל) בגרסה קטומה של rna ליגאז 2 (RNL2) ומתאם 3 מקדים (איור 1) בהיעדר ATP. הדבר מגביר את היעילות של הקשר המתאם של sRNA ומפחית את היווצרות התגובות הצדדיות כדוגמת sRNA circularization או קונקטאריזציה. לאחר מכן, 5 ' מתאם הוא ליגיום על ידי RNA ליגאז 1 (RNL1), ואחריו תמלול הפוכה (RT) ו-PCR הגברה. כל השלבים הללו עשויים להציג הטיה3,4. כתוצאה מכך, קריאת מספרים עשויה שלא לשקף רמות ביטוי בפועל של sRNA המובילות לתבניות ביטוי מלאכותיות התלויות בשיטה. SRNAs ספציפיים עשוי להיות מוגדר או לא מיוצג בספריה, ומאוד מיוצגת על-ידי sRNAs שעשוי להימלט מזיהוי. המצב מורכב במיוחד עם mirnas צמחים, sirnas בחרקים וצמחים, ו pirnas בחרקים, נמטודות ויונקים, שבו 3 ' מסוף נוקלאוטיד יש 2 '-O-מתיל (2 '-OMe) שינוי1. שינוי זה מעכב בחוזקה 3 ' מתאם התאמה5, ביצוע הכנה ספריה עבור סוגים אלה של RNA משימה קשה.
העבודה הקודמת הוכיחה שלקשר מתאם מציג הטיה רצינית, עקב השפעות רצף/מבנה RNA6,7,8,9,10,11. מדרגות במורד הזרם של המתאם כגון תעתיק הפוך ו-PCR לא תורמים באופן משמעותי להטיה6,11,12. הטיה ליפטיים היא כנראה בשל העובדה כי מולקולות מתאם עם רצף נתון יהיה אינטראקציה עם מולקולות sRNA בתערובת התגובה לטופס מקפלים שכונתיות, כי יכול להוביל תצורות חיוביות או שלילי לצורך הארכה (איור 2). נתונים מsorefan ואח '7 מראים כי RNL1 מעדיף הקשר נטוש יחיד, בעוד RNL2 מעדיף סטרנד כפול לצורך הארכה. העובדה שמבני הקיפול המשותף של המתאם/sRNA נקבעים על-ידי המתאם הספציפי ורצפי sRNA מסביר מדוע sRNA ספציפי מיוצג באמצעות ערכת מתאם נתונה. חשוב גם לציין שבתוך סדרה של ספריות sRNA שיש להשוותו, יש להשתמש באותם רצפי מתאמים. אכן, זה בעבר נצפתה כי שינוי מתאמים על ידי המבוא של רצפי ברקוד שונים משנה את פרופילי mirna ב רצף ספריות9,13.
אקראיות של רצפי מתאמים ליד צומת החיבור עלולה להקטין את הביסים האלה. Sorefan ועמיתיו7 מתאמים משומשים עם 4 נוקלאוטידים אקראיים בגפיים שלהם, המיועדים "high Definition" (HD) מתאמים, והראו כי השימוש במתאמים אלה מוביל לספריות שמשקפות טוב יותר את רמות הביטוי srna אמיתי. עבודה עדכנית יותר אישרה תצפיות אלה וחשף כי האזור האקראי אינו צריך להיות סמוך לצומת החיבור11. סוג זה של המתאמים נקרא "MidRand" מתאמים. יחד, תוצאות אלה מדגימות כי עיצוב מתאם משופר יכול להפחית את ההטיה.
במקום לשנות את המתאמים, הטיה ניתן לדכא דרך האופטימיזציה של תנאי התגובה. פוליאתילן גליקול (יתד), סוכן macromolecular צפיפות הידוע כדי להגדיל את יעילות לקצץ14, הוכח להפחית באופן משמעותי הטיה15,16. מבוסס על תוצאות אלה, כמה "נמוך הטיה" ערכות הופיעו בשוק. אלה כוללים ערכות המשתמשות ב-יתד בתגובות הקשר, או בשילוב עם מתאמים קלאסיים או מתאמי HD. ערכות אחרות להימנע לחלוטין, ולהשתמש 3 ' פוליאדלציה ומיתוג תבנית עבור 3 ' ו 5 ' מתאם התוספת, בהתאמה12. בעוד אסטרטגיה אחרת, הארכה של 3 מתאמים מלווה בצעד מעגלי, ובכך משמיט את החוגה של 5 מתאמים17.
במחקר קודם חיפשנו פרוטוקול הכנה של ספריית sRNA עם הרמות הנמוכות ביותר של הטיה ואת הזיהוי הטוב ביותר של 2 '-OMe RNAs12. בדקנו כמה מהעירייה ' הטיה נמוכה ' ערכות, אשר היה זיהוי טוב יותר של 2 '-OMe RNAs מאשר פרוטוקול רגיל (TS). באופן מפתיע עם זאת, עם השינוי (השימוש של מתאמים אקראיים, פג בתגובות לתיקון והסרה של עודף 3 ' מתאם על ידי טיהור) האחרון ביצע את הפרוטוקולים האחרים לאיתור של 2 '-OMe RNAs. כאן, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול מבוסס על פרוטוקול TS, ' TS5 ', אשר היה הזיהוי הכללי הטוב ביותר של 2 '-כולל RNAs. הפרוטוקול יכול להיות בעקבות באמצעות ריאגנטים מערכת ה-TS ומגיב אחד מן הקיט ' Nf ' או, כדי לחסוך כסף, באמצעות ריאגנטים תוצרת בית, עם ביצועים שווים. אנו מספקים גם פרוטוקול מפורט לטיהור של sRNA מ-RNA הכולל והכנת מתאם 3 מראש.

<table><tbody><tr><td>מכשיר ביואנלייזר 2100&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>חומצה-פנול: כלורופורם, pH 4.5 (עם IAA, 125:24:1)</td> <td>ThermoFisher</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP)</td> <td>Nex England Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP חרוזים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>ביואנלייזר ערכת DNA ברגישות גבוהה</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>ביו-אנלייזר ערכת RNA קטנה</td><td>Agilent</td><td>5067-1548</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X מסנני צינור צנטריפוגה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>CLS8162-96EA</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader transilluminator</td><td>ספקים</td><td></td><td></td>שונים</tr><tr><td>ערכת HotStart PCR, עם dNTPs</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex ערכת RNA-seq V3 קטנה</td><td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-5132-05</td><td>ג'לים אופציונליים</td></tr><tr><td>של Novex TBE 6%</td> <td>ThermoFisher</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>ג'לים של Novex TBE Urea 15%</td> <td>ThermoFisher</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט 4 ערכת התחלה כימות</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33227</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת קיוביט ssDNA ThermoFisher</td><td></td><td>Q10212</td><td></td></tr><tr><td>צבע טעינת ג'ל RNA (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>צבע טעינת ג'ל RNA (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase, מורין&nbsp;</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV טרנסקריפטאז הפוך</td><td>ThermoFisher</td><td>18090200</td><td></td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל חומצת גרעין זהב</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2, קטום</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0242S</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 50 bp DNA סולם</td><td>ThermoFisher</td><td>10488043</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq ערכת הכנה לספריית RNA קטנה</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012/24/36/48</td><td>אופציונלי</td></tr><tr><td>UltraPure Glycogen</td><td>ThermoFisher</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>ZR סולם RNA קטן</td><td>Zymo Research</td><td>R1090</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">שני המספרים האחרונים תואמים לקבוצת האינדקסים</td></tr></tbody></table>

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-o-מתיל rnas

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

המחקר של RNAs קטן (sRNAs) לפי רצף הדור הבא (NGS) הוא מאותגר על ידי בעיות הטיה במהלך הכנת הספרייה. מספר סוגים של sRNA כגון צמח microRNAs (miRNAs) לשאת 2 '-O-מתיל (2 '-OMe) שינוי ב 3 ' מסופים שלהם שלהם. שינוי זה מוסיף קושי נוסף כאשר הוא מעכב את החיבור של 3 מתאמים. בעבר הדגמנו שלגירסאות ששונו של פרוטוקול TruSeq (TS) יש פחות הטיה וזיהוי משופר של 2 ' מוכן '. כאן אנו מתארים בפרוטוקול פירוט ' TS5 ', אשר הראה את הביצועים הכוללים הטוב ביותר. TS5 ניתן לעקוב גם באמצעות ריאגנטים תוצרת בית או ריאגנטים מערכת TS, עם ביצועים שווים.

שלבים קריטיים הם הבידוד של חלק RNA קטן של החומר ההתחלתי RNA הכולל (איור 3) ואת המוצר המבוקש הסופי ספרייה (איור 4). שני השלבים כרוכים בטיהור פוליאקרילאמיד ג'ל; רנ א קטן מבודד מ 15% שתנן TBE ג'ל, בעוד הספריות הסופיות מבודדות מ 6% הילידים TBE ג ' לים. רנ א קטן מבודד ג'ל ניתן לנתח על שבב האלקטרופורזה קטן RNA נימי (טבלת חומרים; איור 3 ב). זה יאפשר למשתמשים להעריך את כמות ה-RNA הקטן התאושש ואת החלק של mir...

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

רנ"א קטן מווסת תהליכים ביולוגיים רבים. לכן חשוב לפתח שיטות רגישות ולא משוחדות כדי לזהות אותם. פרוטוקול הפרוטוקול שלנו מספק צעדים קדימה לעבר מטרה זו.הפרוטוקול שלנו סובל מפחות בעיות הטיה, מאשר שיטות ניפוח קלאסיות של ספריית RNA קטנה, וחשוב מכך הוא מאפשר זיהוי רגיש יותר של שני שיניים או מזו-RNAs. כגון מיקרו-RNAs צמחיים. לאחר חילוץ RNA הכולל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.לפני להפעיל ג'ל אוריאה 15% TBE במשך רבע שעה ב 200 וולט. ומערבבים חמישה עד עשרים מיקרוגרם של רנ"א כולל, בנפח של 5 עד 15 מיקרוליטר, עם נפח שווה של צבע טעינת formamide בצינור 200 מיקרוליטר. לאחר חמש דקות ב 65 מעלות צלזיוס, בתרמוצ'ית עם מכסה מחומם, מיד למקם את הצינורות על קרח לטעון את האחרון ולדגום על הג'ל עם נתיב אחד לפחות ביניהם.לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב 200 וולט עד bromophenol היגר כשני שלישים של אורך הג'ל. כדי לטעון את ה- RNA, נקבו תחילה את החלק התחתון של צינור צנטריפוגה מיקרו 0.5 מיליליטר חופשי, עם מחט מד 21, והמקמו את הצינור המנוקב בתחתית עגולה ללא גרעין שני צינור מיקרו צנטריפוגה מיליליטר. לאחר מכן, אין לארוב את הג'ל בטמפרטורת החדר עם כתם ג'ל חומצת גרעין במים במשך עשר עד רבע שעה, לפני צפייה בג'ל על טרנסילומינטור.חותכים את RNA מדגם בין 17 ל 29 להקות סולם נוקלאוטיד, ולהעביר את חתיכת הג'ל לתוך הצינור מנוקב. לסובב את הג'ל במיקרו צנטריפוגה במהירות מקסימלית במשך שתי דקות, ולהסיר את הצינור 0.5 מיליליטר אשר צריך עכשיו להיות ריק. מוסיפים 300 מיקרוליטרים של גרעין חינם 0.3 טוחנות נתרן כלורי לג'ל כתוש, ומנחים את הצינור על מסובב לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, מעבירים את חתיכות הג'ל המרוסקות לעמוד ספין, וצנטריפוגה לשתי דקות במהירות המרבית במיקרו צנטריפוגה. לקבלת חיסול מתאם ראשוני ללא תיחום, יש לערבב ביסודיות עשרה מיקרוליטרים של מים חופשיים עם דגימת ה-RNA המופקת, ולהוסיף שישה מיקרוליטרים של שלושה טוחנות נתרן אצטט עם ערבוב. הוסף 40 microliters של חרוזים טיהור מגנטי, ו 60 microliters של isopropanol לדגימה עם ערבוב יסודי.ולהדרור את ההשעיה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מניחים את הדגימה על מתלה מגנטי, עד שהפתרון מתבהר. מוציאים את העל-טבעי הצלול ומוסיפים 180 מיקרוליטרים של אתנול טרי 80% לחרוזים.לאחר 30 שניות, להסיר את האתנול ולסובב בקצרה את הצינור. הסר כל נוזל שיורית שאולי אסף בתחתית הצינור, ולאפשר את חרוזים להתייבש במשך שתי דקות לפני השעיית המדגם מחדש 22 microliters של 10 מילימולרים טריס. לאחר שתי דקות למגנט את הדגימה עד הפתרון נראה ברור.לאחר מכן, לערבב 20 microliters של על טבעי ברור עם שישה microliters של שלושה אצטט נתרן טוחן בצינור חדש, ולהוסיף 40 microliters של חרוזים מגנטיים ו 60 microliters של 100% isopropanol. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, מגנטים את הדגימה עד שהפתרון נראה ברור, לפני הסרת העל-טבעי. לטפל המדגם עם 180 microliters של 80% אתנול מוכן טרי במשך 30 שניות לפני הסרת אתנול מסתובב במורד המדגם, והסרת כל נוזל שיורית שהצטבר בתחתית הצינור.לאחר מתן אפשרות חרוזים להתייבש במשך שתי דקות, להשעות אותם מחדש 10 microliters של מים ללא גרעין, במשך שתי דקות, לפני מגנטיזציה המדגם עד הפתרון הופך ברור. לאחר מכן, להעביר תשעה microliters של על טבעי לצינור חדש ולהוסיף מיקרוליטר אחד של חיץ קשירה T4 RNA, ומיקרופוליטר אחד של מים לדגימה. לטיהור ג'ל, הפעל חמישה, עשרה ועשרים מיקרוליטרים של מוצר PCR על ג'ל מקורי של 6%TBE למשך כשעה.אין להחדיר את הג'ל שהושלם עם כתם ג'ל חומצת גרעין במים במשך עשר עד חמש עשרה דקות, ולהציג את הג'ל על טרנסילומינטור כדי לאפשר מיצוי של רצועת הספרייה 150 זוג הבסיס. מכיוון שקשה לבודד את רצועת 150 זוג הבסיס המייצגת אותם, אלה הספרייה שלנו, בשל נוכחותם של מוצרי צד נודדים היטב תצטרך לחתוך את הג'ל בזהירות רבה. ואז לבודד את RNA כפי שהוכח רק.לשינוי קובץ רצף גולמי, הורד את קבצי רצף fastq שנוצרו במהלך ריצוף, ואת demultiplexing מראש עם bcl2fastq2 לפי הצורך. הסר רצפי מתאם באמצעות cutodapt, ולהשתמש בפקודה כפי שהודגם. השתמש seqtk כפי שצוין כדי להסיר את הנוקלאוטידים אקראיים מסוף ברצפים קורא.לאחר מכן השתמש בפקודה awk כמצוין, כדי למחוק את הרצפים קצרים מ- 10 נוקלאוטידים. כדי למפות את הרצפים חתוך, לפתוח miRBase ולהוריד את הקובץ fa בוגרת. השתמש בפקודה כפי שצוין כדי להחליף שאריות U בשאריות T, כדי להניב רשימה מלאה של כל המיקרו RNAs במסד הנתונים, שמקורם במגוון אורגניזמים.בחר את רצפי המיקרו RNA של האורגניזם המעניין, כאשר הפקודה מסומנת, ומפה את ההקריאות לקובץ באמצעות bowtie2, ללא אי-התאמות. השתמש בכלי כדי ליישר את הרצפים קורא למסד הנתונים, הדורש כי לקרוא ממפה לחלוטין למיקרו RNA של מסד הנתונים, עם כל אי התאמות כפי שצוין. לאחר מכן השתמש בפקודה כדי לבטל את ההיקראות שלא התיישרו.לאחר טעינת כמויות הולכות וגדלות של ספריית PCR מוגברת על ג'ל כפי שהוכח, ניתן לחלץ את המוצרים המתאימים לגודל הצפוי. לאחר האלוטיון, ניתן לבדוק את הספרייה המטוהרת על שבב אלקטרופורזה ג'ל נימי. בנוסף למוצר הצפוי של 150 זוגות בסיסים, והגדלת חלקם של 130 מינים של זוג בסיסים המתאימים לעמעמי מתאם, נצפו בדרך כלל כאשר כמות הולכת וגדלה של מוצר PCR נטענת.תוצאות דומות מתקבלות כאשר ספריות מתערובת של RNAs קטנים סינתטיים מוכנים באמצעות רייגנטים מערכות, או חומרים מתכלים אחרים. לשם השוואה, מוצגות תוצאות שפורסמו בעבר עבור אותו תערובת RNA קטנה. כאן, השוואה לביצועים של פרוטוקול TS5 עם פרוטוקול TS סטנדרטי לגילוי של אדם ללא שינוי ושני RNAs צמחים ראשוניים שעברו שינוי O-methal מוצגים.הגילוי של שני piRNAs O-מתל שונה ראשוני בדגימות אנושיות נבדק גם. כפי שנצפה TS5 preformed טוב יותר באופן משמעותי מאשר TS לגילוי של שני RNAs O-מתל הממשלה, אבל לא עבור RNAs ללא שיפוץ. הכן ספריות שכפול עבור כל דוגמה בתאריכים שונים.בדרך כלל יש שונות קטנה בין שכפולים שנעשו בו זמנית, או שיכולה להיות שונות משמעותית בין ספריות שהוכנו בתאריכים שונים.

improving-small-rna-seq-less-bias-better-detection-2-o-methyl

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית

MicroRNAs (miRNAs) הם סוג של מולקולות רגולטוריות שנשמרו באופן נרחב. כאן אנו מתארים שיטת שיבוט miRNA המסתמכת על שני שלבי קשירה חזקים ואחריהם ריצוף תפוקה גבוהה. השיטה שלנו מאפשרת כימות מדויק בכל הגנום של miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

אנו מתארים שיטה מבוססת ריצוף RNA ממוקדת הכוללת הכנת ספריות cDNA באינדקס, הכלאה ולכידה עם בדיקות מותאמות אישית וניתוח נתונים כדי לחקור תעתיקים נבחרים לביטוי גנים, מוטציות ואיחוי גנים. RNAseq ממוקד מאפשר הערכה חסכונית ומהירה של תמלילים נבחרים ברצף שולחני.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

פרוטוקול זה מספק חוקרים עם כלי חדש כדי לפקח על הנאמנות של שעתוק אורגניזמים דגם מרובים.

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצילות תלויי-RNA של רנ א. זה מאפשר ניתוח מהיר ותלוי האתר של RNA 2 '-או-מתילציה. גישה זו יכולה לשמש להערכה ראשונית או מרכזית של פעילות הסנחנה.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה צעד אחר צעד עבור בידוד RNAs קטנים, העשרת עבור microRNAs, והכנת דגימות עבור רצף תפוקה גבוהה. לאחר מכן נתאר כיצד לעבד רצף וליישר אותם ל-microRNAs, באמצעות כלי קוד פתוח.

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשיטת ריצוף מבוססת LC-MS שיכולה לשמש כשיטה ישירה לרצף RNA קצר (&lt;35 nt לריצה) ללא ביניים cDNA, וכשיטה כללית לרצף שינויים שונים בנוקלאוטידים במחקר יחיד בדיוק של בסיס יחיד.

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

זיהוי מהיר וכימות אמין של אירועי עריכת RNA בקנה מידה גנומי נותרו מאתגרים ומסתמכים כיום על שיטות ריצוף RNA ישירות. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באלקטרופורזה של ג'ל גרדיאנט מיקרו-טמפרטורה (μTGGE) כשיטה פשוטה, מהירה וניידת לאיתור עריכת RNA.

גישת אי-ריצוף לגילוי מהיר של עריכת RNA

ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

פרוטוקול זה מאפשר בקרת איכות ראשונית לניסויי RNA-seq עבור ביולוגים במעבדה רטובה עם ניסיון מוגבל בביואינפורמטיקה.

Rup (צינור הערכת שימושיות RNA-seq) - בקרת איכות לניסויי RNA-seq בתפזורת באיקריוטים

למד פרוטוקול משופר להכנת ספריית רנ"א קטן עם פחות הטיה ורגישות גבוהה יותר לזיהוי 2'-O-מתיל RNAs. השיטה מאפשרת זיהוי אמין של micro-RNAs צמחיים וחיסכון בעלויות באמצעות ריאגנטים ביתיים.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

גלה סרטונים נוספים