Name: שיטת אלקטרופורציה לVivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: למדו שיטת אלקטרופורציה לסימון תאי אפנדיימוגליה בודדים במוח הטלנצפלון של דג זברה. טכניקה זו מאפשרת מעקב ארוך טווח ומניפולציה של מסלולים תאיים לחקר ביולוגיה תאית ונוירוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

תודות מיוחדות לג Copti לעריכת כתב היד. אנו גם מממנים בהכרת תודה ל JN מקרן המחקר הגרמני (DFG) על ידי SFB 870 ו SPP ניתוח אינטגרטיבי של Olfaction "ו SPP 1738" תפקידים מתעוררים RNAs ללא קידוד בפיתוח מערכת העצבים, פלסטיות & מחלה ", SPP1757" Glial טרוגניות ", ואסטרטגיית מצוינות במסגרת אשכול מינכן לנוירולוגיה מערכות (EXC 2145 סינרגיה-ID 390857198).

כל החיות המשמשות בפרוטוקול זה נשמרו תחת תנאי גידול סטנדרטיים, וניסויים בוצעו על פי הנחיות הטיפול והתקנות של האיחוד האירופי וממשלת בוואריה עילית (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. הכנת תערובת פלאמיד לאלקטרופורציה
<ol><li>לדלל את הפלסטלינה של העניין במים סטריליים ולהוסיף מהיר הירוק פתרון מלאי הכתם [1 מ"ג/mL]. ודא כי הריכוז הסופי של הפלסמיד הוא ∼ 1 μg/μL. להוסיף את הכתם על ריכוז של לא יותר מ 3%, כמו המטרה היחידה שלה היא צבע את הפתרון ולהמחיש הזרקת חדרית.</li>
	<li>לאחר הכנת, לערבב את הפתרון פלמיד על ידי ליטוף למעלה ולמטה כמה פעמים או על ידי הקשה אצבע. אחסן בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש. הערה: עבור שיתוף אלקטרופורציה של שני פלמידים לתוך אותו תא, להבטיח את הריכוז של כל מרכז בודד בשימוש בתערובת הוא לפחות 0.8 ng/μL עם יחס טוחנת של 1:1 להשיג 80% – 90% שיתוף היעילות.</li>
</ol>2. ההכנות להזרקה ולהליך אלקטרופורציה
<ol><li>הכן את נימי הזכוכית (קוטר חיצוני 1 מ"מ, קוטר פנימי 0.58 מ"מ) הכרחי להזרקה במנגנון מושך המחט.</li>
	<li>על מנת להזריק את הכמות הנכונה של פלסמיד (ראה לעיל), משוך את הנימים בטמפרטורה של 68.5 ° c עם שני משקולות אור ושני משקלים כבדים (ראו טבלת חומרים למפרטים). הערה: במקרה של שימוש בפולר שונה, כיול הקפילר כדי לספק את הנפח המתאים של ערבוב האלקטרופורציה.</li>
	<li>להגדיר באופן ידני את התקן ההזרקה ללחץ הזרקה של 200 hPa (על ידי הפעלת כפתור Pi) ולחץ מתמיד של 0 hPa. הגדר באופן ידני את זמן ההזרקה למצב ידני ושלוט בלחץ עם דוושה ברגל.</li>
	<li>הגדר את התקן אלקטרופורציה "במצב LV" עם חמישה פולסים ב 54-57 V (25 ms כל אחד עם מרווחי 1). חבר את האלקטרודות להתקן.</li>
	<li>הכינו מיכל דגים אחד עם מי דגים נקיים, שם הדגים יתעוררו מהרדמה לאחר הליך האלקטרופורציה. מאוורר את המים על ידי שמירה על אבן האוויר המצורפת למשאבת האוויר למשך תקופת ההחלמה כולה עד שהדג מתעורר במלואו.</li>
	<li>קח ספוג מטבח רגיל ולעשות חתך האורך בספוג להחזיק דגים לתוך במהלך ההזרקה והליך אלקטרופורציה (לראות את הפרסום הקודם3). הערה: ספוג מטבח צריך לשטוף או להחליף באופן קבוע כדי להסיר כימיקלים רעילים פוטנציאליים.</li>
	<li>מניחים כמות קטנה של ג'ל אולטרא סאונד רב תכליתי במיוחד ליד התקנת הזריקה ואלקטרופורציה. הערה: הדבר יבטיח מוליכות חשמלית נאותה, וכתוצאה מכך, הפצת תאים אלקטרופורמים בכל הטלנצלון כולו.</li>
</ol>3. דג הרדמה מדגים
<ol><li>לפני ההרדמה, להכין פתרון מניות של הרדמה עם 0.2% MS222 במים מזוקקים ולהתאים את ה-pH כדי 7 עם מאגר Tris-HCl. לדלל את המניה 1:10 (כלומר, כדי 0.02% MS222) באמצעות מי דגים.</li>
	<li>הכפיש את הדג על-ידי שמירה על הפתרון העובד הזה עד לתנועת הגוף והזימים (בדרך כלל למספר דקות).</li>
</ol>4. פלמיד הזרקת פתרון
<ol><li>למלא את נימי זכוכית מוכן עם 10 μL של פתרון פלבאמצע באמצעות טיפים microloader. הימנע היווצרות בועות אוויר בתוך נימי.</li>
	<li>הקש על תפריט/שנה נימי בהתקן ההזרקה. להוסיף ולאבטח את המחט לתוך מחזיק המחט.</li>
	<li>תחת stereomicroscope עם הגדלה של 3.2 x או 4x, לחתוך רק את קצה הנימים באמצעות מלקחיים בקצה עדין. החלף את מכשיר ההזרקה ממצב נימי למצב הכנסה , לאחר מכן להחיל לחץ עם דוושת הרגל כדי להבטיח את הפתרון הפלמיד פועל בקלות מתוך המחט ללא הפרעה.</li>
	<li>להעביר את הדג ממיכל הגידול אל המיכל (פלסטיק תיבת) עם פתרון הרדמה. חכו כמה דקות עד שהתנועה. של הזימים תהיה משנית</li>
	<li>מניחים דגים לתוך הספוג שלפני הציפוי, כאשר הצד השני פונה כלפי מעלה. בצע את כל שלבי ההזרקה הבאים תחת stereomicroscope כדי להבטיח את הדיוק של השגרה.</li>
	<li>באמצעות ניתוח מיקרו-סכין מפלדת אל-חלד עם 40 mm חיתוך קצה ו 0.5 מ"מ עובי, ליצור חור קטן בגולגולת הדג בצד האחורי של הטלנצאלון (איור 1B), ממש ליד הגבול עם tectum אופטי. הערה: שלב זה צריך להתבצע בזהירות, שכן החור צריך להיות מאוד קטן ושטחי, חודר אך ורק את הגולגולת, כדי למנוע נזק מוחי.</li>
	<li>להטות את הדג לפי הצורך וכוון את קצה נימי הזכוכית לעבר הגולגולת בזווית הנכונה כדי להקל על חדירת הקצה הנימי דרך החור.</li>
	<li>הכנס את קצה הנימים דרך החור בגולגולת בזהירות עד שהוא מגיע החדר telencephalic (ראה איור 1B). זה ידרוש חדירה דרך שכבת התא ependymal. להיות זהירים במיוחד לא להכניס את נימי עמוק מדי כדי למנוע מגע עם רקמת המוח. לשמור על נימי בדיוק בין האונות, נשאר בתוך החדר רק לאחר פירסינג השכבה ependymal. הערה: . זה צעד מאוד עדין דיוק של הליך זה משופר באמצעות קווי פיגמנטציה מוטציה כגון חצוף24, המאפשר הדמיה טובה יותר של מיקום נימי זכוכית במהלך ההזרקה.</li>
	<li>עם עצה נימי בתוך החדר, להזריק את הפתרון פלבאמצע על ידי הפעלת לחץ עם דוושת הרגל על 10 s, אשר מתאים כ 1 μL של פתרון פלמיד. הערה: אם שינוי מחטים המחט, נימים או מזרק, המערכת צריך להיות מכויל כדי לספק תמיד 1 μL של פתרון פלבאמצע. ניתן לבצע כיול על-ידי מדידת קוטר ה-droplet הפלגיאני הנפלט לתוך שמן מינרלי (למשל, שמן פרפין) ולאחר מכן חישוב הנפח של ה-droplet. לאחר 10 s של הזרקה, צריך להיות ~ 1 μL של נוזל פלמיד מגורש לתוך שמן מינרלי.</li>
	<li>לאשר הצלחה של השלב הקודם על ידי התבוננות התפשטות של נוזל בכל החדר.</li>
</ol>5. אלקטרופורציה
<ol><li>הסר את הדג מתוך הגדרת הזריקה תוך שהוא עדיין מחזיק אותו בספוג.</li>
	<li>לטבול את הצד הפנימי של קצה האלקטרודות ג'ל אולטרסאונד.</li>
	<li>מכסים את הדג טלנצאלון עם כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד.</li>
	<li>מקמו את ראש הדג בין האלקטרודות, ממקמים את האלקטרודה החיובית בצדו הגחוני של ראש הדג ואת האלקטרודה השלילית שבצד השני (איור 1C), תוך שהיא עדיין מחזיקה את גוף הדג בספוג. זה מגדיר את הכיוון של הזרימה הנוכחית של הצורך electroporate ependymoglia ממוקם באזור subventricular.</li>
	<li>לחץ על האלקטרודות בעדינות ובדיוק נגד הטלנצאלון (איור 1C). . הזרם עם דוושת הרגל החזיקו את האלקטרודות במקום עד לסיום כל חמשת הפולסים.</li>
</ol>6. שחזור דגים
<ol><li>בואו הדג להתאושש במיכל מוכן בעבר, גז ברציפות עד שהוא מתעורר. ג'ל לידוקאין יכול להיות מיושם על הגולגולת כדי להקל על כל כאבים שפותחו.</li>
</ol>

<ol><li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+Series+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li>
<li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon%3A+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li>
<li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li>
<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li>
<li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li>
<li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li>
<li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li>
<li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li>
<li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li>
<li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmetal+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li>
<li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li>
<li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586(2014).</li>
<li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle%3A+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li>
<li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+%28HSV-1%29+and+electroporation%3A+methods+and+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li>
<li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells%3A+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li>
<li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li>
<li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li>
<li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015(2018).</li>
<li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarbosa%2C+JS+%22In+vivo+single+cell+analysis+reveals+distinct+behavior+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+homeostasis+and+regeneration+in+the+adult+brain%22">In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain</a>. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).</li>
<li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li>
<li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li>
<li>Chapouton, P., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChapouton%2C+P+%22Neurogenesis.+Chapter+IV+in+The+Zebrafish%3A+Cellular+and+Developmental+Biology%2C+Part+A+Developmental+Biology%22">Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology</a>. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).</li>
<li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול אלקטרופורציה זו הוא שיטה אמינה בvivo לתיוג תאים בודדים ependymoglial. הפרוטוקול עשוי להזדקק לעיבוד נוסף כדי לתייג סוגי תאים אחרים כגון נוירונים או oligodendrocytes הפוך. כדי להשיג תוויות מוצלחות, ניתן להשתמש בפלמידים המכילים היזמים שונים. עוף בטא אקטין מיזם, eF1alpha, cmv ו מקדם אוביקוויב השתמשו בעבר כדי לכונן את הביטוי של טרנסגנים שונים ependymoglia ואת צאצהם23. עם זאת, קינטיקה שונה של ביטוי טרנזגנטי נצפתה אשר יש לקחת לתוך החשבון. לדוגמה, ביטוי טרנזגנטי מונחה של מקדם המקדם של CMV הוא מהי...

בכדי לבחון התחדשות מוחית. לאחר פציעה בפצע דקירה בהשוואה ליונקים, על הסולם האבולוציוני, מינים מפותחים פחות כגון דג זברה בדרך כלל להציג שיעורי גבוה יותר של נוירוגנזה ואזורים נרחבים של מגורים מבוגרים תא גזע עצבי, המוביל לדור קבוע של נוירונים חדשים ברחבי רוב אזורי המוח בחיים הבוגרים. תכונה זו מופיעה בתיאום עם קיבולת משובי גבוהה באופן משמעותי של דג דג זברה בהשוואה ליונקים1, כמו דג זברה יש פוטנציאל מדהים ליצור ביעילות נוירונים חדשים ברוב מודלים של פגיעה במוח למדו2, . שלוש,ארבע,חמש,שש,שבע, שמונה כאן מחקר הדגים הזינצאלון נלמד, שכן הוא אזור מוחי עם נוירוגנזה בולטת בבגרות. אזורים אלה של נוירוגנזה למבוגרים הם הומוולוגי לאזורים נוירוגניים במוח היונקים הבוגרים9,10,11.
שופע באזורים נוירוגניים ב-דג זברה telencephalon נוכחים בשל קיומו של הרדיאלי glia כמו תאים או תאים ependymoglia. Ependymoglial תאים לפעול כתושב תאי גזע עצביים למבוגרים ואחראים על הדור של נוירונים חדשים במוח שלמים ומתחדשות3,5. ניסויים מעקב השושלת הראו כי ependymoglia חדרית להגיב לפציעה, לאחר מכן מתרבים וליצור חדש neuroblasts נמשך להגר לאתר הנגע5. בשל טבעו הטבעי של הדגים הזינצאלון, תאים ependymoglial קו המשטח החדרית ולבנות את הקיר החדרית הגייתי. הקיר הבין-חדרית נוצר על ידי שכבת תא ependymal (איור 1A). וחשוב מכך, דג זברה ependymoglia לגלם את המאפיינים של שני היונקים הרדיאליים והתאים ependymal. תהליכים רדיאליים ארוכים הם תכונה טיפוסית של תאים הרדיאלי של גליה, ואילו הרחבות סלולר וצמתים הדוקים (כמו גם המיקומים החדרית שלהם) הם תכונות טיפוסיות של ependymal תאים12,13,14. לכן, תאים אלה נחשבים לתאים ependymoglial.
כדי לעקוב אחר התנהגות vivo של תאים בודדים ependymoglial במהלך התחדשות, הם צריכים להיות מתויג באופן אמין. שיטות שונות של vivo תא תיוג עבור מיקרוסקופ פלורסנט תוארו בעבר, כגון כתבים אנדוגני או צבע ליפופילית15. שיטות אלה, בניגוד לאלקטרופורציה, עשויות לדרוש פרקי זמן ארוכים יותר ולעתים קרובות אינן מציעות אפשרות של תיוג תאים בודד או מעקב קבוע לטווח ארוך. אלקטרופורציה, עם זאת (מלבד תוויות תא יחיד), מציעה את האפשרות של החדרת DNA חדש לתא המארח. יתר על כן, לעומת שיטות אחרות של העברת DNA לתוך התאים, אלקטרופורציה הוכח להיות אחת השיטות היעילות ביותר16,17,18,19.
מוצג כאן הוא פרוטוקול אלקטרופורציה כי כבר מעודן לצורך תיוג תאים ependymoglial בודדים בתוך המבוגר הדגים telencephalon. פרוטוקול זה מאפשר תיוג של תאים ependymoglial יחיד כדי לעקוב אחריהם לאורך תקופה ארוכת טווח20 או לטפל מסלולים ספציפיים באופן אוטונומי התא21,22.

<table><tbody><tr><td><חזק>מגיב / חומר< / חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מהיר</td><td>ירוק סיגמא-אולדריץ'</td><td>F7258-25G</td><td>לצביעת תמיסת פלסמיד</td></tr><tr><td>MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>MS222 יש לאחסן ב- RT (עד שבועיים) ולהגן מפני</td></tr><tr><td>אור ג'ל אולטרסאונד</td><td>SignaGel, מעבדות פרקר בע"מ.</td><td>15-60</td><td>אלקטרודה ג'ל</td></tr> <tr><td><חזק>ציוד</משאבת ></td><td></td><td></td><td></td>אוויר חזקה</tr> <tr><td></td><td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td><td></td><td>ניתן לקנות בחנויות לחיות מחמד</td></tr><tr><td>BTX פינצטה אלקטרודות</td><td>פלטינה פינצטה, BTX הרווארד מכשיר</td><td>45-0486</td><td>קוטר 1 מ"מ</td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורציה</td><td>BTX ECM830 גל מרובע, BTX הרווארד מכשיר</td><td>45-0662</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר הזרקה</td><td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td><td>5252000013</td><td></td></tr><tr><td>קיר סטנדרטי זכוכית נימית</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0766</td><td>מספר דגם: G100-4</td></tr><tr><td>קצות מיקרו-מטען</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-סכין</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td> <td>ג'ויסטיקNarishige Japan</td><td>MN - מחזיק מחט 151</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FemtoJet 4i, מחזיק מחט Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>מגיע יחד עם מכשיר ההזרקה</td></tr><tr><td>מכשיר משיכת מחט</td><td>Narishige יפן</td><td>מספר דגם: PC-10</td><td>ה-PC-10 הופסק על ידי Narishige בשנת 2017 והוחלף על ידי צלחות PC-100</td></tr><tr><td>Petri</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>633161</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת אלקטרופורציה לvivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

אלקטרופורציה היא שיטת המשך החצייה שבה שדה חשמלי מוחל על תאים כדי ליצור נקבוביות זמניות בקרום התא ולהגדיל את החדירות שלה, ובכך לאפשר למולקולות שונות להיות מוצגים לתא. במאמר זה, אלקטרופורציה משמש כדי להחדיר פלמידים כדי ependymoglial תאים, אשר קו האזור החדרית של המבוגר ביותר הדגים telencephalon. חלק של תאים אלה מראה מאפייני תא גזע ומייצר נוירונים חדשים במוח דג זברה; לכן, לימוד התנהגותם חיוני כדי לקבוע את תפקידם בנוירוגנזה והתחדשות. הקדמה של פלסטלינה באמצעות אלקטרופורציה מאפשרת תיוג לטווח ארוך ומעקב אחר תא ependymoglial יחיד. יתר על כן, פלמידים כגון היצורים recombinase או Cas9 יכולים להיות מועברים לתאים בודדים ependymoglial, אשר מאפשר שילוב גנים או לערוך גנים ומספק הזדמנות ייחודית להעריך את פונקציית הגן האוטונומית של התא בשליטה, טבעי סביבה. בסופו של דבר, פרוטוקול האלקטרופורציה המפורט, שלב-אחר-שלב משמש להשגת הקדמה מוצלחת של פלמידים למספר רב של תאים ependymoglial בודדים.

שיטת האלקטרופורציה המתוארת מאפשרת אספקת דנ א פלמיד לתוך ependymoglial תאים, אשר נמצאים באופן שטחי ביותר בתוך הטלודג הזינצאלון ומתחת לשכבת התא הependymal (איור 1A).
אם תוצאת האלקטרופורציה חיובית, הנקראת ependymoglial תאים בודדים (תאים אדומים באיור 2a, b) ניתן לצפות בין תאים ependymoglial אחרים (לבן באיור 2a, b). בהתאם ליעילות של תהליך האלקטרופורציה, ייתכן שתווית גבוה...

מוצג כאן הוא שיטת אלקטרופורציה עבור משלוח ה-DNA של הפלזמה ותיוג תא ependymoglial במבוגר בלדג טלנצאלון. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה ויעילה כדי להמחיש ולעקוב אחר תאים ependymoglial בודדים ופותחת אפשרויות חדשות להחיל אלקטרופורציה על מגוון רחב של מניפולציות גנטיות.

שיטת אלקטרופורציה לVivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

פרוטוקול זה מאפשר תיוג של תאים ependymoglial בודדים בטלנצפלון דג הזברה כדי לאפשר ניטור ארוך טווח שלהם, כמו גם מניפולציה של מסלולים ספציפיים באופן תא אוטונומי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת תיוג תא יחיד בצורה מהירה ויעילה, כמו גם עריכת גנים ומניפולציה מסלול איתות באופן תא אוטונומי. שיטה זו מאפשרת חקירה של שאלות בסיסיות של ביולוגיה של התא, למשל, על דללנציה של תאים, תחזוקה של הומלוסטזיס אפיתל, ואת הסימטריה של חלוקת התא.התחל באמצעות מנגנון מושך מחט להכין נימי זכוכית. השתמש בטיפים microloader כדי למלא נימי זכוכית מוכן עם עשרה microliters של פתרון פלסמיד. לאחר מכן לחץ על תפריט לשנות נימי"על מכשיר ההזרקה כדי לאפשר את המחט להיות טעון לתוך מחזיק המחט.לאחר מכן החלף את התקן ההזרקה משינוי נימי למצב הזרקה. לאחר מכן, באמצעות סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה פי ארבעה, ומדפים Finden, לחתוך רק את קצה נימי. לאחר מכן להחיל לחץ על דוושת כף הרגל כדי לאשר כי פתרונות פלסמיד פועל בקלות מתוך המחט ללא הפרעה.כאשר המחט מוכנה, להעביר דג זברה ממיכל הבעלים למיכל של פתרון הרדמה. ולחכות כמה דקות עד שתנועת הזימים תירגע. לחץ על צד הגב דגים הרגעה עד ספוג רטוב מראש מתחת סטריאומיקרוסקופ, ולהשתמש נירוסטה לנתח microknife עם 40 מילימטר חיתוך קצה ועובי 0.5 מילימטר כדי ליצור בזהירות חור קטן בגולגולת הדג בצד האחורי של t

electroporation-method-for-vivo-delivery-plasmid-dna-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

ברזולוציה של זמן ומרחב של מניפולציות גנטיות קובע את הספקטרום של תופעות ביולוגיות כי הם יכולים להפריע. כאן אנו משתמשים ובזמן מרחבית...

מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

אנו מתארים שיטה תנאי מציאה ביטוי של חלבון המטרה במהלך רגנרציה דג הזברה למבוגרים סנפיר. טכניקה זו כוללת מיקרו הזרקה ו electroporating oligonucleotide morpholinos antisense לרקמת סנפיר, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של חלבון בשלבים שונים של התחדשות סנפיר, כולל ריפוי פצעים, יצירת blastema, ואת תוצאה רגנרטיבית.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

סרטון זה מתאר אלקטרופורציה in vivo, שהיא טכניקה להעברת דנ"א לתאים אפנדימוגליים בדגי זברה בוגרים.

ב Vivo אלקטרופורציה: שיטה ספציפית לאתר להעברת דגי זברה

סרטון זה מתאר את הטכניקה של הזרקה תוך שרירית להעברת תרכובות לשרירים הגביים של דג זברה בוגר.

הזרקה תוך שרירית (IM): העברת תרכובת לשריר הגבי של דג זברה בוגר

במאמר זה, אנו מדגימים שיטה למניפולציה של ביטוי גנים בתאי חדריות של telencephalon דג הזברה המבוגר באמצעות oligonucleotides morpholino antisense. אנו מציגים שיטה זו כפרוטוקול יעיל ומהיר שיכול לשמש למחקרים תפקודיים במוח החולייתנים המבוגר.

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

כדי לשפוך אור על המנגנונים התאיים והמולקולריים של נוירוגנזה והתחדשות בוגרים של דג הזברה, פיתחנו פרוטוקול לניתוח פולשני הגורם לפציעות מכניות בטלנצפלון הבוגר של דג הזברה וניטור לאחר מכן של שינויים בחצי הכדור הדקירה על ידי אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתר.

פציעה דקירת פצע של דג הזברה telencephalon מבוגרים: שיטה לחקר המוח של בעלי החוליות Neurogenesis והתחדשות

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

מתוארת שיטת הזרקה תוך-צפקית חדשה (IP) בדגי זברה בוגרים. בעת טיפול בתרכובות רעילות כגון דוקסורוביצין, הליך זה יעיל יותר משתי שיטות ה- IP שדווחו בעבר. הטכניקה תוכננה להיות מאומצת בקלות על ידי חוקרים בעלי ניסיון מוגבל במודל דגי הזברה.

טכניקת הזרקה תוך צפקית בדגי זברה בוגרים הממזערת נזקי גוף ותמותה נלווית

למדו שיטת אלקטרופורציה לסימון תאי אפנדיימוגליה בודדים במוח הטלנצפלון של דג זברה. טכניקה זו מאפשרת מעקב ארוך טווח ומניפולציה של מסלולים תאיים לחקר ביולוגיה תאית ונוירוגנזה.

שיטת אלקטרופורציה לVivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון

גלה סרטונים נוספים