תפוקה גבוהה בשיטת באתרו להערכת הפטציט הגרעיני בעכברים

שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור פרופיל של תוכן DNA גרעיני hepatocyte ממקטעי רקמה דו-מימדית לחקר התפתחות הכבד, התחדשות ומחלות כרוניות. גישה אוטומטית זו של תפוקה גבוהה יכולה להיות מיושמת על כל חלקי רקמת הכבד הדו-מימדית, ומספקת קריאה פנימית מכוילת של תכסיס גרעיני לכל גרעיני ההפטוציט המעגליים הפשוטים. שינויים בתכסיס הגרעיני hepatocyte קשורים הזדקנות, מחלת כבד כרונית, וסרטן.

טכניקה זו מספקת אמצעי פשוט פרופיל תכסיס גרעיני בדגימות כבד קבועות או cryopreserved. בשיטות פרופיל תכסיס situ יש פוטנציאל ניכר כמו מחקר וכלים קליניים למעקב אחר התקדמות מחלת הכבד כפי שהם אינם דורשים desegregation רקמות או גישה לחומר טרי. לאחר קצירת דגימת רקמת הכבד המורין, להטמיע את אוניית הכבד לתוך טמפרטורת חיתוך אופטימלית בינוני מלא cryomold ומיד למקם את התבנית על קרח יבש כדי להבטיח הקפאה מהירה.

כדי להשיג פרוסות של דגימת אונות הכבד הקפואה, חלקו את הדגימה בעובי של שישה מיקרומטר, והניחו מגלשה מצופה פוליאמיד מסומנת מעל כל דגימה למשך חמש שניות כדי לאפשר לכל דגימה להידבק לשקופית. כאשר כל הפרוסות נאספו, לאפשר את הדגימות כדי לצייד במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני immunolabeling. בסוף שיווי המשקל, לתקן את חלקי הרקמה במכסה המנוע אדים עם מיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

בסוף קיבעון, לשטוף את השקופיות עם שלוש שלוש דקות שוטף PBS עם תסיסה עדינה. לאחר הכביסה האחרונה, ייבשו את האזור סביב כל קטע רקמה ולהשתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול סביב כל דגימה. כדי לחלחל את הדגימות, לטפל בחלקים עם 0.5% לא יוני פעילי שטח PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות במשך שלוש דקות ב PBS פעמיים עם תסיסה עדינה כפי שהוכח לפני חסימת כריכה לא ספציפית עם פתרון מסונן של 1%bovine סרום אלבומן, 5% סרום סוס, ו 0.2% לא יוני פעילי שטח ב- PBS לפחות שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הדגירה את השקופיות עם נוגדן HHF4-אלפא מדולל במאגר חסימה לילה בארבע מעלות צלזיוס בתא תכהום לח מוגן מפני אור. למחרת בבוקר, לשטוף את המגלשות ארבע פעמים PBS עם תסיסה עדינה לפני הדגירה עם פלואורסצנטיות מתאימה נדנוגדן משני Hoechst מדולל בסרום מסונן 1% bovine albumen ו 0.2% לא יוני פעילי שטח ב PBS במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתא כתמים לח מוגן מפני אור.

בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות ארבע פעמים כפי שהודגם, ואחריו שתי שלוש דקות שוטף במים מזוקקים כפולים עם תסיסה עדינה. לאחר הכביסה האחרונה, הר את הדגימות עם שתי טיפות של פלואורסצנטיות הרכבה בינונית על כיסוי ולהחיל לחץ עדין לפי הצורך כדי לחסל את כל הבועות. לאחר מכן, בדוק את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי כדי להבטיח קיבעון טוב immunolabeling.

לרכישת תמונות פלואורסצנטיות, הגדר את הפרמטרים בפלטפורמת הדמיית תוכן גבוהה כדי לרכוש תמונות פלואורסצנטיות באמצעות העירור המתאים עבור הפלואורופורים המשמשים. לאחר מכן לסרוק דגימות כדי להשיג תמונות מספיקות כדי לקבל כיסוי מלא של סעיף הרקמה. בסוף הסריקה, להתאים את הפרמטרים פילוח גרעיני של התוכנה כדי להבטיח כי הגרעינים מופרדים באופן אופטימלי ולשנות את עוצמת הסף כדי להבטיח gating אופטימלי של hepatocytes חיובי HNF4-אלפא ותאים שליליים HNF4-אלפא שאינם פרנצ'ימליים.

לכימות גרעיני, הגדר את האזור הגרעיני במיקרומטרים מרובעים המבוססים על הכתמת הויכסט, עוצמת Hoechst הגרעינית העיקרית, גורם התארכות גרעינית, מדד העגול הגרעיני הממוצע, מעמד HNF4-אלפא, וקואורדינטות X, Y הגרעיניות המבוססות על מרכז הכובד. כדי לבצע ניתוח תכסיס גרעיני hepatocyte, תחילה להוריד ולהתקין את תוכנית ניתוח כימות תכסיס. ב- MATLAB, נווט אל הכרטיסיה אפליקציה של רצועת הכלים ולחץ על התקן יישום.

פתח את התוכנית התקנת יישומים של ML של יישום Ploidy. תופיע הודעה שתאשר את ההתקנה המוצלחת. בכל קובץ ניתוח נתונים, כלול גיליון בשם Cell Measures, המכיל את כל הנתונים הדרושים לניתוח התחבולות שנקבע בעמודות כמצוין.

עבור כל מצב ניסיוני, ספק ערכת נתונים לבקרה שתשמש לחישוב הבקרה הפנימית עבור כיול תכסיס גרעיני של 2 עד 4 N. עבור שכפולים ביולוגיים, אחסן כל גיליון אלקטרוני בתיקיה משלו, ו מתן שם לתיקדומות התיקיה באופן הדרגתי. לאחר מכן, הפעל את היישום Ploidy.

ממשק המשתמש הגרפי הגרפי של יישום Ploidy יופיע. לחץ על לחצן נתיב לפקד נתונים כדי לנווט לתיקיה שבה שוכנים שכפולי נתוני הפקד. נתיב נתונים זה יופיע לאחר מכן בממשק.

בקידומת תיקיה, הקלד את השם שיש לתת לקבצי הפלט. לחץ על לחצן נתיב לנתונים אחרים ונווט אל התיקיה שבה שוכנים שכפולי הנתונים ההשוואתיים. נתיב נתונים זה יופיע לאחר מכן בממשק.

לאחר מכן לחץ על הפעל. לאחר השלמת הניתוח, שורת המצב תקרא ניתוח הושלם. לאחר immunolabeling, חשוב לבדוק את כל השקופיות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי קונבנציונלי כדי לאשר כי קיבעון באיכות טובה וכתמים הושגה.

מריחה או טשטוש של צבע Hoechst יכול להצביע על קיבעון לקוי או השפלה מדגם לפני הקיבעון. הפרדה גרעינית ופרמטרי סף HNF4-alpha יש לייעל בזהירות לפני ניתוח תמונה אוטומטי כדי לשקף באופן נרחב את התבנית החזותית של immunostaining שנצפה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. לאחר ניתוח תמונה, הנתונים צריכים לשקף את המספרים ההולכים וגדלים של תאים שאינם על-טבעיים ואת הקטנים, אך משמעותיים, ירידה במספרי הגרעינים החיוביים HNF4-alpha בתוך הכבד עם פגיעה DDC.

בכבדי בקרה בריאים, כ-63% מהגרעין החיובי HNF4-alpha מפגינים מורפומטריה מעגלית פשוטה. השוואה של התכסיס הגרעיני היחסי בין קבוצות שליטה וDDC מטופלים צריך לשקף אובדן משמעותי של 2C ו 4C hepatocyte גרעינים עם פציעה יחד עם מספר גדל של תאים יותר מ 8C. ניתן לחקור את המידע המיקום היחסי עבור כל קבוצת משנה של תכסיסים על-ידי אחזור המיקום הדו-מימדי של קבוצות משנה מסוימות של hepatocyte בתוכנה לניתוח תמונות תוכן גבוהה.

Immunolabeling עם נוגדנים נוספים, כגון Ki-67, ניתן לבצע כדי להעריך שכפול תאים ונתונים מורפומטריה גרעינית hepatocyte ניתן לחקור עוד יותר כדי להחמיא ניתוח תכסיס. פרופיל התכסיסים הרחב שנוצר בשיטה זו מתאר את תוכן הדנ"א המינימלי עבור כל גרעיני ההפטוציטים המעגליים, אך אינו מפלה בין תאים מונונוקאריים לבין hepatocytes binuclear. השיטה עשויה להיות מותאמת לחשבון עבור פרמטרים כגון היקף התא, כדי להקל על זיהוי תאים binuclear ולספק קריאה נוספת של תכסיס הסלולר.