Name: שיטות לקביעת מבנה ומנגנונים של זיהוי יון מתכת וחמצון פעילות של כריכת מתכת Oligopeptides (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: חקור שיטות IM-MS ומודלים מולקולריים לניתוח קליטת מתכות בפפטידים כמו מתנובקטין. טכניקות אלו מאפשרות פיתוח תרופות למחלות הקשורות לאיזון יוני מתכת כגון אלצהיימר וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת 1764436, תמיכה בכלי NSF (MRI-0821247), קרן וולש (T-0014), ומשאבי מיחשוב מהמחלקה לאנרגיה (TX-W-20090427-0004-50) ו-L3 תקשורת . אנו מודים לקבוצת בוואר של אוניברסיטת קליפורניה-סנטה ברברה על שיתוף התוכנית סיגמא ו Ayobami Ilesanmi להפגין את הטכניקה בווידאו.

1. הכנת ריאגנטים
<ol><li>התרבות מתיונין trichosporium OB3b, לבודד את Cu (I)-mb חינם-OB3b18,22,23, להקפיא לקפוא את המדגם ואת החנות ב-80 ° צ' עד השימוש.</li>
	<li>לסנתז את הפפטידים amb (&gt; 98% טוהר עבור amb1, amb2, amb4; &gt; 70% טוהר עבור amb7), להקפיא את הדגימות, ולאחסן אותם ב-80 ° c עד השימוש.</li>
	<li>רכישה &gt; 98% טוהר מנגן (II) כלוריד, קובלט (II) כלוריד, nickle (II) כלוריד, נחושת (ii) כלוריד, נחושת (II) חנקתי, כסף (I) חנקתי, אבץ (II) כלוריד, ברזל (III) כלוריד ועופרת (II) כלוריד.</li>
	<li>לרכוש את הפולימרים פולי-DL-אלטין המשמשים ככייל עבור מדידת מקטעים ההתנגשות התנגשות של מינים amb ו-כיתה של כיתה או הידרוקסיד אמוניום גבוה יותר, חומצה אצטית קרחוני, ו acetonitrile.</li>
</ol>2. הכנת פתרון מניות
<ol><li>
פתרון מניות פפטיד
	<ol>
<li>שוקלים במדויק, באמצעות לפחות שלוש דמויות משמעותיות, המסה של 10.0 – 20.0 mg של mb-OB3b או amb בבקבוקון פלסטיק 1.7 mL. הערה: מסה שקלה צריך להניב או 12.5 mM או 1.25 mM, בהתאם מסיסות של פפטיד, כאשר 1.00 mL של המים (DI) הוסיף.</li>
		<li>באמצעות pipet, להוסיף 1.00 mL של מים מוכי (&gt; 28.6 MΩ ס"מ) למדגם פפטיד שוקלת להניב או 12.5 mM או 1.25 mM פתרון. המקום כובע מאובטח ולערבב ביסודיות עם לפחות 20 inversions.</li>
		<li>באמצעות מיקרופיפט לוותר 50.0 μL הפחת מדגימת פפטיד לתוך המסומנת באופן אינדיבידואלי 1.5 mL מבחנות ולאחסן אותם ב-80 ° צ' עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מניות מתכת-פתרונות
	<ol>
<li>שוקלים במדויק, באמצעות לפחות שלוש דמויות משמעותיות, המסה של 10.0 – 30.0 mg של מתכת כלוריד או כסף חנקתי בבקבוקון 1.7 mL. הערה: מסה שקלה צריך להניב 125 mM כאשר 1.00 mL של מים DI מתווסף.</li>
		<li>הוסף את 1.00 mL של מים DI לדגימת מתכת שוקלת ב 1.7 mL בקבוקון כדי להניב את הפתרון 125 mM. המקום כובע מאובטח ולערבב ביסודיות עם לפחות 20 inversions.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הידרוקסיד אמוניום פתרונות מניות: להכין 1.0 M חומצה אצטית פתרון על ידי דילול 57 μl של 99.5% חומצה אצטית פתרון עם מים די לנפח הסופי של 1.00 mL. הכנת 1.0 M הידרוקסיד אמוניום הידרוקסידי על ידי דילול 90 μL של 21% אמוניום הידרוקסידי הפתרון עם מים די לנפח הסופי של 1.00 mL. לעשות שתי מדלל רצופים של כל פתרון על ידי נקיטת 100 μL של 1.0 M פתרונות להכין 0.10 M ו 0.010 חומצת חומץ M ו-אמוניום הידרוקסידי פתרונות.</li>
	<li>
פולי-dl-alanine פתרון המניה: להכין את פולי-dl-alanine (PA) על ידי שקילה 1.0 מ"ג של הרשות והמסת ב 1.0 mL של מים DI לתת 1,000 ppm. מערבבים ביסודיות. באמצעות מיקרופיפט, לוותר על 50.0 μL ali, ולמקם כל אחד לתוך בקבוקון 1.7 mL ולאחסן ב-80 ° c.</li>
</ol>3. ריסוס אלקטרומטריה-מוביטריית יונים
<ol><li>נקה את אבובים בכניסה ESI ואת נימי המחט ביסודיות עם כ 500 μL של 0.1 M חומצה אצטית קרחוני, 0.1 M אמוניום הידרוקסיד, ולבסוף די מים.</li>
	<li>הפשרת 50.0 μl סדרת מחלקים של הפתרון של מניות 1,000 ppm הרשות הפלסטינית ולדלל אותו עם 450 μl של מים DI כדי לתת לדפי הבית הפלסטינית 100. Pipet 100.0 μL של פתרון זה ולדלל אותו ל 1.00 mL עם 500 μL של מים DI ו500 μL של acetonitrile לתת 10 לדפי הרשות הפלסטינית פתרון.</li>
	<li>לאסוף את השלילי וחיובי יון IM-MS ספקטרום של 10 ppm הרשות הפלסטינית עבור 10 דקות כל שימוש יליד ESI-IM-MS התנאים כמתואר בסעיף הדיון.</li>
	<li>ההפשרה 50.0 μl סדרת מחלקים של 12.5 מ"מ או 1.25 mm amb פתרון המניה ולעשות מדלל רצופים עם מים די לתת ריכוז סופי של 0.125 mM amb. מערבבים ביסודיות כל דילול.</li>
	<li>Pipet 100.0 μL של 125 mM מלאי הפתרון של מתכת יון, מקום בבקבוקון 1.7 mL ולדלל כדי 1.00 mL עם די מים כדי לתת ב12.5 מטאל mM יון. חזור עם עוד שתי מדלל רצופות כדי לתת הסופי 0.125 mM מטאל ריכוז יון. מערבבים ביסודיות כל דילול.</li>
	<li>Pipet 200.0 μL של 0.125 mM amb לתוך מבחנה 1.7 mL, לדלל עם 500 μL של מים DI, ולערבב את הפתרון ביסודיות.</li>
	<li>להתאים את ה-pH של המדגם כדי 3.0 על ידי הוספת 50 μL של 1.0 M חומצה אצטית תמיסה.</li>
	<li>הוסף 200.0 μL של יון מתכת 0.125 מ"מ למדגם המותאם ל-pH. הוסף מים DI כדי להניב נפח סופי של 1.00 mL של המדגם, לערבב ביסודיות, ולאפשר את המדגם כדי להאביק 10 דקות ב RT.</li>
	<li>באמצעות מזרק אף קהה לקחת 500 μL של המדגם לאסוף את יון שלילי וחיובי ES-IM-MS ספקטרום עבור 5 דקות כל אחד. השתמש בשאר 500 μL של המדגם כדי להקליט את ה-pH הסופי באמצעות אלקטרודה מיקרו pH מכויל.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.6 – 3.9, תוך שינוי שלב 3.7 להתאים את ה-pH כדי 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, או 10.0 על ידי הוספת כרכים חדשים של 0.010 M, 0.10 M, או 1.0 M חומצה אצטית או הידרוקסידי פתרונות.</li>
	<li>לאסוף את יון שלילי וחיובי ESI-IM-MS ספקטרום של 10 דפי הרשות הפלסטינית עבור 10 דקות כל אחד.</li>
</ol>4. הכנת הטטור מתכת לדיגום של דגימות amb
<ol><li>בצע את השלבים המתוארים בשלבים 3.1 – 3.5.</li>
	<li>Pipet 200.0 μL של 0.125 mM amb לתוך מבחנה 1.7 mL, לדלל עם 500.0 μL של מים DI ולערבב את הפתרון ביסודיות.</li>
	<li>להתאים את ה-pH של המדגם ל-pH = 9.0 על ידי הוספת 80 μL של 0.010 M אמוניום הידרוקסיד הפתרון.</li>
	<li>הוסף 28 μL של 0.125 mM הפתרון מתכת להעניק 0.14 מקבילות טוחנת של יון מתכת, להוסיף מים DI כדי להפוך את הנפח הסופי של המדגם 1.00 mL, לערבב ביסודיות, ולאפשר את המדגם כדי equi, עבור 10 דקות ב RT.</li>
	<li>באמצעות מזרק אף קהה לקחת 500 μL של המדגם לאסוף את יון שלילי וחיובי ESI-IM-MS ספקטרום עבור 5 דקות כל אחד. השתמש בשאר 500 μL של המדגם כדי להקליט את ה-pH הסופי באמצעות אלקטרודה מיקרו pH מכויל.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.2 – 4.5, תוך שינוי שלב 4.3 כדי להוסיף נפח מתאים של פתרון מתכת 0.125 mM כדי לתת את שני 0.28, 0.42, 0.56, 0.70, 0.84, 0.98, 1.12, 1.26, או 1.40 מקבילות טוחנת.</li>
	<li>לאסוף את השלילי וחיובי יון IM-MS ספקטרום של 10 ppm הרשות הפלסטינית עבור 10 דקות כל אחד.</li>
</ol>5. ניתוח מידע בנוגע לנתוני ה-ESI-MS
<ol><li>מ-IM-MS ספקטרה לזהות אילו מינים טעונה של ambs נוכחים על ידי התאמת אותם דפוסי האיזוטופ שלהם m/z התיאורטי.<ol>
<li>פתח MassLynx ולחץ על כרומטוגרמה לפתוח את החלון chromatogram.</li>
		<li>עבור אל תפריט הקובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS.</li>
		<li>חלץ את הספקטרום IM-MS על ידי לחיצה ימנית וגרירה על פני chromatogram ושחרור. חלון הספקטרום ייפתח ויציג את ספקטרום ה-IM-MS.</li>
		<li>בחלון הספקטרום, לחץ על כלים ומודל איזוטופ. בחלון מידול האיזוטופ, הזן את הנוסחה המולקולרית של מיני amb, בדוק את תיבת היון של הצג והזן את מצב הטעינה. לחץ על אישור.</li>
		<li>חזור על הפעולה כדי לזהות את כל המינים בספקטרום IM-MS ולהקליט את טווח האיזוטופ של m/z שלהם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור כל מיני מינים, יש להפריד בין מיני מקרי m/z לבין הפצות הזמן ההגעה שלהם (ATD) תוך שימוש בדפוסי האיזוטופ שלהם כדי לזהות אותם.<ol>
<li>ב-MassLynx לחץ על Driftscope כדי לפתוח את התוכנית. בתוך DriftScope לחץ על קובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS.</li>
		<li>השתמש בעכבר ולחץ לחיצה שמאלה כדי להתקרב על תבנית איזוטופ m/z של המינים amb.</li>
		<li>השתמש בכלי בחירה ובלחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את תבנית האיזוטופ. לחץ על לחצן ' קבל בחירה נוכחית '.</li>
		<li>כדי להפריד כל מיני מקרי m/z להשתמש בכלי בחירה ולחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את הזמן atd מיושר עם תבנית איזוטופ של מינים amb. לחץ על לחצן ' קבל בחירה נוכחית '.</li>
		<li>כדי לייצא את ה-ATD, עבור לקובץ | ייצוא ל-MassLynx, לאחר מכן בחר שמור זמן הסחף ושמור קובץ בתיקיה המתאימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע את הסנטאיד של ATD ולשלב את האזור תחת עקומת ATD כמדד של אוכלוסיית המינים.<ol>
<li>בחלון Chromatogram של MassLynx פתח את הקובץ המיוצא שנשמר. לחץ על התהליך | שילוב מהתפריט. בדוק את התיבה שילוב שיא של ApexTrack ולחץ על אישור.</li>
		<li>הקלט את המרכז האזורי ATD (tA) ואת האזור המשולב כפי שמוצג בחלון chromatogram . חזור על כל קבצי הנתונים שנשמרו amb והרשות הפלסטינית-MS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש ATD משולב עבור כל המינים מחולץ amb של יונים חיוביים או שליליים בכל נקודת טיטור לנרמל לקנה מידה יחסי באחוזים.<ol>
<li>הזן את הזהויות של מינים amb ו-ATD המשולב שלהם בכל pH לתוך גיליון אלקטרוני.</li>
		<li>עבור כל pH, השתמש בסכום ה-ATDs המשולבים כדי לנרמל את ה-ATDS של האדם לקנה מידה באחוזים.</li>
		<li>מתווה את אחוזי הכוונות של כל מיני מינים לעומת pH בגרף כדי להראות כיצד אוכלוסיית כל מינים משתנה כפונקציה של pH.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. התנגשות בין סעיפים
<ol><li>באמצעות גיליון אלקטרוני, המירו את ccss (Ω) של הרשות הפלסטינית25,26 ו-27 יונים חיוביים שנמדדו ב-הוא מאגר גז28 לתיקון סמ ק (Ωc) באמצעות משוואה 1 להלן, כאשר: z = ion חיוב; ה c = מטען אלקטרוני (1.602 × 10-19 ג); מ ' נ 2 = מסה של N2 גז (Da); ו- mיון = מיסת יונים. בן 29
</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60102/60102equ01.jpg">
<ol start="2"><li>להמיר את זמני ההגעה הממוצעת (tA) של הרשות הפלסטינית מיני נמלים ומינים amb לתוך זמני הסחף (tD) באמצעות משוואה 2 להלן, כאשר: c = מקדם העיכוב של מחזור החובה המשופר (1.41), ו-m/z הוא מסה-to-התשלום של יון פפטיד.</li>
</ol><img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60102/60102equ02.jpg">
<ol start="3"><li>העלילה הרשות הפלסטינית מכייל ' tD Vs. Ωcשלהם. לאחר מכן, תוך שימוש בהתאמת רגרסיה לפחות של משוואה 3 המוצגת להלן, קבע את ערכי a ' ו-B, כאשר: a ' הוא תיקון הטמפרטורה, הלחץ ופרמטרי השדה החשמליים; ו-B מפצה על ההשפעה לא לינארית של מכשיר ה-IM.</li>
</ol><img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60102/60102equ03.jpg">
<ol start="4"><li>באמצעות אלה ' ו B ערכיהערך של הסנטאיד t מתוך atd של ambs לקבוע Ωc שלהם באמצעות משוואה 3 ואת Ω שלהם באמצעות משוואה 1. שיטה זו מספקת ccss עבור מינים פפטיד עם שגיאות מוחלטות משוער של כ 2%25,26,27.</li>
</ol>7. שיטות חישוביות
<ol><li>השתמש ברמה הB3LYP/LanL2DZ של התיאוריה, הכוללת את הפונקציונליות היברידית של becke 3-הפרמטר30 ואת בסיס דנינג להגדיר31 ו אלקטרון פוטנציאל ליבה32,33,34 כדי לאתר הגיאומטריה האופטימיזציה עבור כל הסוגים האפשריים של coordinations של m/z amb מינים שנצפו35. הערה: לקבלת פרטים אודות אופן הבנייה והשליחה של חישובים, עיין בשימוש ב-GaussView בקובץ משלים.</li>
	<li>השוו את האנרגיה החופשית החזויה של כל אחד מהמגבונס ולחישוב CCSs התיאורטי שלהם באמצעות שיטת לנארד-ג'ונס (אל-ג'יי) מתוכנית סיגמא36.</li>
	<li>מהמגבנות הנמוכות ביותר של אנרגיה חופשית קובעות באיזה קונלשעבר מוצגים ה-אל. סי. אם. סי. אם. סי. סי.</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

שלבים קריטיים: שימור התנהגות בשלב הפתרון לבדיקה דרך ESI-IM-MS יש להשתמש בהגדרות האינסטרומנטליות המקוריות שמאגור את הפפטידים הסטויכמטריה, לטעון את המצב ואת המבנה הקונפורמי. עבור תנאים מקומיים, התנאים במקור ESI כגון מתח חרוט, טמפרטורות, וזרמי הגז צריך להיות ממוטב. כמו כן, את הלחצים ואת המתח במקור, מלכודת, התנועה היון, והעברת גלי נסיעה (במיוחד הטיה מלכודת DC השולט מתח הזרקה בתא IM) יש לבדוק את ההשפעות שלהם על הפצות המדינה החיוב וניידות היון.
להלן תנאי ההפעלה הטיפוסיים ששימשו ב...

נחושת ויוני אבץ חיוניים עבור אורגניזמים חיים חיוניים לתהליכים כולל הגנה חמצונית, צמיחה רקמות, נשימה, כולסטרול, מטבוליזם הגלוקוז, ו הגנום קורא1. כדי להפוך את הפונקציות הללו לזמינות, קבוצות כמו ה-thiolate של cys, סרטיאזול שלהשניים,3, (לעתים רחוקות יותר) תיויואתר של מתיונין, ו carboxylate אוחר של גלו ו-Asp לשלב באופן סלקטיבי מתכות כקופרים לתוך האתרים הפעילים של . מטלואנזימים הדמיון של קבוצות תיאום אלה מעלה שאלה מרתקת לגבי האופן שבו הליזלים והאחרים משלבים בצורה סלקטיבית את ה-Cu (I/II) או Zn (II) כדי להבטיח את התפקוד הנכון.
קשירה סלקטיבית מושגת לעתים קרובות על ידי רכישת פפטידים סחר, אשר שליטה Zn (II) או Cu (I/II) ריכוזי יון4. Cu (I/II) הוא תגובתי ביותר וגורם נזק חמצוני או כריכת האדוולקית לאנזימים, כך הריכוז החופשי שלה מוסדר בחוזקה על ידי מלווים נחושת ו-נחושת הוויסות חלבונים התחבורה אותו בבטחה למיקומים שונים בתא בחוזקה לשלוט הומאוסטזיס שלו5,6. שיבוש של מטבוליזם נחושת או הומאוסטזיס מעורב ישירות ב menkes ומחלת וילסון7 , כמו גם סרטן7 והפרעות עצביות, כגון פריון8 ומחלת אלצהיימר9.
מחלת וילסון קשורה לרמות נחושת מוגברת בעיניים, בכבד וחלקים של המוח, שם התגובות החמצון של Cu (I/II) מייצרת מינים חמצן תגובתי, גורם התנוונות וניוון נוירולוגי. טיפולי הכלרות הקיימים הם החומצות האמינו הקטנות מפאסיאנאמין וטריאטילנסאטולה. לחילופין, הmethanotrophic-פפטידים ברכישת נחושת מתיונין (mb)10,11 התערוכה פוטנציאל תרפויטי בגלל הזיקה הגבוהה שלהם עבור Cu (I)12. כאשר מתיונין (mb-OB3b) מתוך מתיונין trichosporium OB3b למדו במודל בעל חיים של מחלת וילסון, נחושת הוסר ביעילות מן הכבד מופרש באמצעות מרה13. בניסויים חוץ גופית אישר כי mb-OB3b יכול לאכול את הנחושת מתוך מטתיוגה נחושת הכלול ציטוסול הכבד13. אבלציה לייזר בשילוב עם המסת פלזמה המסה טכניקות הדמיה יש חקרו את ההתפלגות המרחבית של נחושת בסרטן המחלה של וילסון דגימות14,15,16 והראו כי mb-OB3b מסיר את הנחושת עם תקופות טיפול קצרות של 8 ימים בלבד.17.
The mb-OB3b יהיה גם לאגד עם יוני מתכת אחרים, כולל Ag (אני), Au (III), Pb (ii), Mn (ii), Co (ii), Fe (ii), Ni (ii), ו zn (ii)18,19. התחרות עבור האתר הפיסיולוגי Cu (I) מוצג על ידי Ag (I) כי זה יכול לתפוס את Cu (I) מתוך מתחם mb-OB3b, עם שני Ag (I) ו Ni (II) גם מראה מחייב בלתי הפיך Mb אשר לא ניתן לעקורים על ידי Cu (I)19. לאחרונה, סדרה של מתיונין אלטרנטיבית (amb) oligopeptides עם המוטיב 2cys מוטיב מחייב נחקרו20,21, ושלהם zn (ii) ו Cu (i/II) מאפייני איגוד מאופיין. רצפי חומצות האמינו העיקריים שלהם הם דומים, והם כולם מכילים את 2His-2Cys מוטיב, Pro ו acetylated N-טרמינוס. הם שונים בעיקר מ-mb-OB3b בגלל מוטיב 2Cys מחליף את שני אתרים כריכת oxazolone oxazolone של mb-OB3b.
Electrospray אינון בשילוב עם ניידות-המוני-המסה ספקטרומטריה (ESI-IM-MS) מספק טכניקה אינסטרומנטלית רבת עוצמה לקביעת תכונות מתכת מחייב של פפטידים כי זה מודד את המסה שלהם לטעון (m/z) והתנגשות חתך (סמ ק) תוך שימור צורת המסה, הטעינה והקונפורמציה משלב הפתרון. ה- m/z ו-סי. סי. אי מתייחסים לפפטידים סטויכמטריה, פרוטונציה המדינה והצורה הקונפורמציה. סטויכמטריה נקבע כי הזהות והמספר של כל אחד מהרכיבים המצויים במין מזוהים במפורש. המטען הכללי של קומפלקס פפטיד מתייחס למצב הפרוטונציה של האתרים חומצי ובסיסיים ואת מצב החמצון של יון מתכת (s). ה-סי. פי. סי מספק מידע של הצורה הקונפורטית של קומפלקס הפפטיד, מכיוון שהוא מודד את גודל הסיבוב הממוצע המתייחס למבנה השלישוני של הקומפלקס. מצב החיוב הכולל של הקומפלקס הוא גם פונקציה של pH ומשפיע על הזיקה של המתכת של פפטיד האיגוד משום האתרים בסיסיים או חומצי כגון carboxyl, שלו, Cys ו Tyr הם גם אתרי הקשירה הפוטנציאליים של יון מתכת. עבור הניתוחים, את הפפטיד ואת יון מתכת מוכנים פתרונות מימית עם pH מותאם על ידי מדלל חומצה אצטית מימית או אמוניום הידרוקסיד. זה מאפשר את התלות pH ואת הסלקטיביות יון מתכת להיקבע עבור פפטיד. יתר על כן, m/z ו-סמ ק נקבעים על ידי ESI-IM-MS ניתן להשתמש עם מידול B3LYP/LanL2DZ מולקולרי כדי לגלות את סוג של תיאום מתכת יון ומבנה שלישוני של הקומפלקס. התוצאות המוצגות במאמר זה לחשוף כיצד ESI-IM-MS יכול לאפיין את ביצועי הכלגדירוג סלקטיבית של סט של פפטידים amb ולהשוות אותם לתוך הנחושת-מחייב פפטיד mb-OB3b.

<table><tbody><tr><td>אצטוניטריל HPLC בדרגת</td><td>פישר סיינטיפיק (www.Fishersci.com)</td><td>A998SK-4</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום הידרוקסיד (בדרגת קורט מתכת)</td><td>פישר סיינטיפיק (www.Fishersci.com)</td><td>A512-P500</td><td></td></tr><tr><td>קובלט (II) כלוריד הקסהידרט 99.99%</td> <td>סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)</td><td>255599-5G</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) כלוריד 99.999%</td> <td>סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)</td><td>203149-10G</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) חנקת הידרט 99.99%</td> <td>סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)</td><td>229636-5G</td><td></td></tr><tr><td>תוכנן amb1,2,3,4,5,6,7 פפטידים</td> מתוכננים <td>Neo BioLab (neobiolab.com)</td><td></td> <td>סונתזו על ידי</td></tr><tr><td>פפטידים שתוכננו לפי סדר AMB5B,C,D,E,F פפטידים</td> שתוכננו <td>פפמיקקו (www.pepmic.com)</td><td></td> <td>עוצבו סונתזו בהזמנה</td></tr><tr><td>Driftscope 2.1 תוכנת</td><td>ווטרס (www.waters.com)</td><td></td> <td>תוכנית ניתוח תוכנה</td></tr><tr><td>mb-OB3b מיובש בהקפאה, מטוהר ונטול Cu(I)</td> מתורבת ומבודד במעבדתו של ד"ר דונגוון צ'וי (המחלקה לביולוגיה, טקסס A&<td></td><td></td><td> M-Commerce)</td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית (בדרגת אופטימה)</td><td>פישר סיינטיפיק (www.Fishersci.com)</td><td>A465-250</td><td></td></tr><tr><td>ברזל (III) כלוריד נטול מים 98%+</td><td>אלפא Aesar (www.alfa.com)</td><td>12357-09</td><td></td></tr><tr><td>עופרת (II) חנקת ACS בדרגת</td><td>אוונטור (www.avantormaterials.com)</td><td>128545-50G</td><td></td></tr><tr><td>מנגן (II) כלוריד טטרהידרט 99.99%</td> <td>סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)</td><td>203734-5G</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx 4.1</td><td>Waters (www.waters.com)</td><td></td><td>תוכנה ניתוח תוכנה</td></tr><tr><td>ניקל כלוריד הקסהידראט 99.99%</td> <td>סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)</td><td>203866-5G</td><td></td></tr><tr><td>פולי-DL-אלנין</td><td>סיגמא-אולדריץ' (www.sigmaaldrich.com)</td><td>P9003-25MG</td><td></td></tr><tr><td>כסף חנקתי 99.9%+</td><td>אלפא אייזר (www.alfa.com)</td><td>11414-06</td><td></td></tr><tr><td>Waters Synapt G1 HDMS</td><td>Waters (www.waters.com)</td><td></td><td>quadrupole - ניידות יונים- ספקטרומטר מסה של זמן טיסה</td></tr><tr><td>אבץ כלוריד נטול מים</td><td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td><td>A16281</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות לקביעת מבנה ומנגנונים של זיהוי יון מתכת וחמצון פעילות של כריכת מתכת oligopeptides

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Electrospray אינון (ESI) יכול להעביר פפטיד מימית בשלב מורכב או פפטיד לשלב הגז תוך שימור מסה שלה, המטען הכולל, מתכת-מחייב אינטראקציות, וצורה הקונפורמציה. מצמד ESI עם ניידות-המסה (IM-MS) מספק טכניקה אינסטרומנטלית המאפשרת מדידה בו של מסת המסה של פפטיד (m/z) וחתך התנגשות (סמ ק) המתייחסים לסטואיצ'ימטריה שלה, פרוטונציה state, ובצורה מעשית. המטען הכולל של קומפלקס פפטיד נשלט על-ידי הפרוטונציה של 1) באתרים החומציים והבסיסיים של הפפטיד ו -2) מצב החמצון של יון המתכת (s). לכן, מצב החיוב הכולל של קומפלקס הוא פונקציה של ה-pH של הפתרון המשפיע על הזיקה של מתכת פפטידים מחייב האהדה. עבור הניתוחים של ESI-IM-MS, פפטיד ופתרונות יוני מתכת מוכנים מתוך פתרונות מימית בלבד, עם pH מותאם עם לדלל חומצה אצטית מימית או אמוניום הידרוקסיד. זה מאפשר תלות pH וסלקטיביות יון מתכת להיקבע עבור פפטיד ספציפי. יתר על כן, m/z ו-סמ ק של מתחם פפטיד יכול לשמש עם מידול B3LYP/LanL2DZ מולקולרי כדי להבחין באתרי הכריכה של תיאום מתכת יון ומבנה שלישוני של הקומפלקס. התוצאות מציגות כיצד ESI-IM-MS יכול לאפיין את הביצועים הסלגטיים סלקטיבי של קבוצה של פפטידים מתיונין חלופיים ולהשוות אותם לתוך מתיונין הנחושת-פפטיד מתיאנקובטין.

כריכת מתכת של amb1 מחקר IM-MS20 של amb1 (איור 1א) הראו כי שני יוני נחושת ואבץ הקשורים Amb1 באופן תלוי pH (איור 2). עם זאת, נחושת ואבץ מאוגד amb1 דרך מנגנוני תגובה שונים באתרי תיאום שונים. לדוגמה, הוספת Cu (II) ל-amb1 הביא חמצון של amb1 (amb1ox) על ידי היווצרות הגשר קשר דיסולפידי, ו ב-pH של &gt; 6, את [amb1ox-3h + Cu...

בניידות המסה-הספקטרומטר ההמוני וטכניקות הדוגמנות המולקולריות ניתן לאפיין את ביצועי המתכת הסלקטיבית של הפפטידים העשויים מתכת-כריכה ומתיונין-הנחושת המטאוקובטין. פיתוח מחלקות חדשות של פפטידים מתכת הכלפת יסייע להוביל לtherapeutics עבור מחלות הקשורות באיזון מתכת ביון.

שיטות לקביעת מבנה ומנגנונים של זיהוי יון מתכת וחמצון פעילות של כריכת מתכת Oligopeptides

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

ספקטרומטריית מסה ניידות יון, או IM-MS, לזהות את היונים מוצרים שונים מן התגובה תלויי pH redox ו מחייב מתיל של פפטידים. עם המודל המולקולרי של המבנה שליו שלהם, מתאם מתכת ניתן לקבוע. IM-MS יכול לפתור כל אחד מיוני המוצר ולזהות את ההרכב המולקולרי שלהם על ידי מדידת זמני המסה לטעינה וההגעה שלהם ולהתייחסות לסטואיכומטריה, מצב הפרוטונציה והמבנה הקונפורמי שלהם.פיתוח סוגים של פפטידים כלאט מתכת יעזור להוביל טיפולית למחלות הקשורות חוסר איזון יון מתכת, כגון מנקס ומחלת וילסון, סרטן, ומחלת אלצהיימר. כדי להתחיל, לנקות את צינורות הכניסה ESI נימי מחט ביסודיות עם כ 500 microliters של 0.1 חומצה אצטית קרחונית טוחה, 0.1 אמוניום הידרוקסיד טוחן, ולבסוף, מים deionized. השתמש בתנאי ESI-IM-MS מקוריים כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לאסוף את ספקטרום IM-MS יון שלילי וחיובי של פתרון פולי-DL-אלנין 10 עמודים לדקה למשך 10 דקות כל אחד.פיפטה 200.0 microliters של 0.125 מילימולר חלופה מתנובקטין, או פתרון אמב, לתוך בקבוקון 1.7 מיליליטר. מדללים עם 500 מיקרוליטרים של מים deionized ומערבבים את הפתרון ביסודיות. התאם את ה- pH של המדגם ל- 3.0 על-ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של תוסף חומצה אצטית טוחנת 1.0.הוסף 200.0 מיקרוליטר של יון מתכת 0.125 מילימולר לדגימה המותאמת ל- pH. לאחר מכן, להוסיף מים deionized להניב נפח סופי של 1.00 מיליליטר של המדגם. מערבבים היטב, ומאפשרים לדגימה לצייד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.באמצעות מזרק אף קהה, לקחת 500 microliters של המדגם ולאסוף את הספקטרום יון שלילי וחיובי ESI-IM-MS במשך חמש דקות כל אחד. השתמש ב-500 המיקרוליטרים הנותרים של המדגם כדי לתעד את ה- pH הסופי שלו באמצעות אלקטרודה מכוילת של מיקרו-pH. חזור על שלבים אלה, למעט כדי להתאים את ה- pH ל- pH ארבע, חמש, שש, שבע, שמונה, תשע או 10, על-ידי הוספת כמויות חדשות של חומצה אצטית או פתרונות אמוניום הידרוקסיד.אסוף את הספקטרום השלילי והחיובי ESI-IM-MS של הפתרונות המתקבלים למשך 10 דקות כל אחד. מתוך ספקטרום IM-MS, לזהות אילו מינים טעונים של מתנובטין חלופי נמצאים על ידי התאמתם לדפוסי האיזוטופ המסה לטעינה התיאורטיים שלהם. לשם כך, פתח את MassLynx ולחץ על כרומטוגרמה כדי לפתוח את חלון הכרומטוגרמה.עבור לתפריט קובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS. חלץ את ספקטרום הודעות מיידיות-MS על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני, גרירה לאורך הכרומטוגרמה ושחרור. חלון הספקטרום ייפתח, המציג את ספקטרום IM-MS.בחלון הספקטרום, לחץ על כלים ומודל איזוטופ. בחלון הדוגמנות של איזוטופ, הזן את הנוסחה המולקולרית של זן ה- amb, בדוק את התיבה הצג היונים טעונים והזן את מצב המטען. לחץ על אישור. חזור על תהליך זה כדי לזהות את כל המינים בספקטרום IM-MS, ולתקליט את טווח האיזוטופים שלהם מסה לטעינה.עבור כל מין אמב, הפרד בין כל מינים מקריים של מסה לטעינה וחלץ את הפצות זמן ההגעה שלהם, או ATDs, באמצעות דפוסי האיזוטופים ההמוניים שלהם כדי לזהות אותם. פתח את DriftScope ולחץ על קובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS. השתמש בעכבר ולחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי כדי להגדיל את תבנית האיזוטופים ההמונית-לטעינה של זן ה- amb.השתמש בכלי הבחירה ובלחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את תבנית האיזוטופ. לחץ על לחצן קבל את הבחירה הנוכחית. כדי להפריד בין כל מינים מקריים של מסה לטעינה, השתמש בכלי הבחירה ובלחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את זמן ATD המיושר עם תבנית האיזוטופ של זן ה- amb.לחץ על לחצן קבל את הבחירה הנוכחית. כדי לייצא את ATD, עבור אל קובץ, יצא ל- MassLynx. לאחר מכן בחרו 'שמור על זמן דריפט' ושמור את הקובץ בתיקיה המתאימה.בחלון הכרומטוגרמה של MassLynx, פתח את הקובץ המיוצא שנשמר. לחץ על תהליך, שלב מהתפריט, בדוק את התיבה שילוב שיא של ApexTrack ולחץ על אישור. רשום את המרכז ואת האזור המשולב של ATD. לאחר חזרה על תהליך זה עבור כל קבצי הנתונים Amb ו- poly-DL-alanine IM-MS שנשמרו, השתמש ב- ATD המשולב עבור כל מיני ה- Amb שחולצו של היונים החיוביים או השליליים בכל נקודת טיגרציה כדי לנרמל לקנה מידה יחסי של אחוזים.לשם כך, הזן את זהותם של המינים amb ואת ATD המשולב שלהם בכל pH לתוך גיליון אלקטרוני. עבור כל pH, השתמש בסכום ה- ATDs המשולבים כדי לנרמל את ה- ATD של המינים הבודדים לקנה מידה של אחוזים. התווה את אחוזי ההתעצמות של כל מין אמב לעומת pH כדי להראות כיצד האוכלוסייה של כל מין משתנה כפונקציה של pH.באמצעות גיליון אלקטרוני, המר את חתך ההתנגשות של היונים השליליים והחיוביים של פולי-DL-אלנין הנמדדים בגז חיץ הליום לצלב ההתנגשות מתוקן. לאחר מכן, להמיר את זמני ההגעה הממוצעים של מכיילים פולי-DL-אלנין ו amb מינים לתוך זמני סחף. חבר את זמני ההיסחפות של מכוולי הפולי-DL-אלנין לעומת חתך ההתנגשות שלהם.לאחר מכן, באמצעות התאמה של רגרסיה בריבועים לפחות, קבע את הערכים A prime ו- B, כאשר A prime הוא התיקון עבור פרמטרי הטמפרטורה, הלחץ והחשמל שדה, ו- B מפצה על ההשפעה הלא ליניארית של התקן ההודעות המיידיות. באמצעות ערכים אלה A prime ו- B עם ערך זמני סחף centroid, לקבוע חתך התנגשות מתוקן שלהם ואת חתך ההתנגשות שלהם. שיטה זו מספקת חתך התנגשות עבור מיני פפטיד עם שגיאות מוחלטות משוער של כ 2%באמצעות גאוסיאן עם GaussView, ואת B3LYP LanL2DZ רמת התיאוריה, לאתר קונפורמרים אופטימיזציה גיאומטריה עבור כל סוגי התיאום האפשריים של מינים amb מסה לטעינה שנצפו.רמת התיאוריה B3LYP LanL2DZ מורכבת מהפונקציונליות ההיברידית ההיקפית של בק שלוש, סט הבסיס של דאנינג ופוטנציאל ליבת האלקטרונים. לחלץ את הניתוחים תרמוכימיים של כל אחד קונפורמים אופטימיזציה מקובץ פלט Gaussian ולחשב חתך ההתנגשות התיאורטית שלהם באמצעות שיטת Lennard-Jones בקנה מידה יון מתוכנית סיגמא. מתוך קונפורמי האנרגיה החופשית הנמוכים ביותר, קבע איזה קונפורמר מציג את חתך רוחב ההתנגשות לנארד-ג'ונס שמסכים עם חתך ההתנגשות הנמדד IM-MS.תהליך זה מזהה את המבנה שליו ואת סוג הקואורדינציה עבור הקונפורמים שנצפו בניסוי. מידול מולקולרי דורש השוואה של האנרגיה החופשית וחתכים התנגשות של קונפורמרים עם אתרי כלאט מתכת שונים, קשרים cis וטרנס פפטיד, גשרי מלח, מימן מליטה, ואינטראקציות pi-cation. מחקר IM-MS של מתנובטין חלופי אחד הראה כי הוא chelated הן נחושת ואבץ ions באופן תלוי pH, אבל באמצעות מנגנוני תגובה שונים ואתרי תיאום.כריכת אבץ (II) נצפתה ב- pH של יותר משש, בעיקר יצירת קומפלקס טעון שלילי אחד, המציין אבץ (II) היה tetrahedrally מתואם על ידי שני imidazoles ושני thiolates. כריכת נחושת (II) לוותה על ידי thiols להרכיב גשר disulfide. ב- pH של יותר משישה, קומפלקס נחושת טעון שלילי יחיד (II) נוצר, המציין imidazole ושני חנקן בין deprotonated היו תיאום נחושת(II)עם זאת, מתחת pH שש, הוספת נחושת(II) גם יצרה את קומפלקס נחושת טעון חיובי יחיד(I),כמו גם יחיד טעון חיובי נחושת (II) קומפלקס מעל pH שש.מחקרים IM-MS של amb 2 ו amb ארבעה גם מראים כי תגובות נחושת נתן מוצרים שונים במספרים של גשרים דיסולפידים inter-או intramolecular, מספר נחושת(I)או נחושת(II)ions, ומספר אתרי deprotonation, אשר השתנה כפונקציה של pH. התוצאה IM-MS עם מידול מולקולרי הראה כי מתנובוקטין חלופי יכול לתאם עד שלושה נחושת (I) ions באמצעות thiolate, imidazoles, וקבוצות קרבוקסילאט. יש לבחור בקפידה את ההגדרות האינסטרומנטליות של IM-MS כדי לשמר את הסטויצ'יומטריה של הפפטידים, את הפצות ההאשמות ואת המבנים הקונפורמיים, כמתואר בטקסט.שילוב של טווח רחב יותר של גודל שישפיע על תיאום מתכת כגון טירוזין בחומצה אספרטית יאפשר הבנה טובה יותר של הקשר בין מבנה לתפקוד. IM-MS עם מודלים מולקולריים הפכו לטכניקות חלופיות להאצת קריסטלוגרפיה וספקטרוסקופיה של NMR לקביעת המבנים הקונפורמיים של חלבונים, DNA, שומנים, ואת המתחמים שלהם.

ion-mobility-mass-spectrometry-techniques-for-determining-structure

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

יון ניידות ספקטרומטריית מסה היא המתעוררים גז שלב טכנולוגיה שמפרידה יונים, המבוסס על ההתנגשות שלהם חתך ומסה. השיטה מספקת מידע תלת מימדי על טופולוגיה את הצורה הכוללת של קומפלקסים חלבונים. כאן, אנו המתאר הליך בסיסי לקביעת מכשיר ואופטימיזציה, כיול פעמים להיסחף, ופרשנות של נתונים.

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

נקבע מבנה תמיסת ה-NMR של פפטיד מודל מטאלוצ'פרון עם Cu (I), ומתואר פרוטוקול מפורט מהכנת דגימה ואיסוף נתונים חד-ממדיים ודו-ממדיים למבנה תלת מימדי.

קביעת מבנה וקואורדינציה של קומפלקסים של פפטיד-מתכת באמצעות תמ"ג 1D ו-2D 1H

Size exclusion chromatography עם פלזמה מצומדת אינדוקטיבית - ספקטרומטריית מסה (ICP-MS) היא כלי רב עוצמה למדידת שינויים בשפע של מטאלופרוטאינים ישירות מדגימות ביולוגיות. כאן אנו מתארים קבוצה של תקני מטאלופרוטאין המשמשים להערכת המסה המולקולרית וכמות המתכת הקשורה לחלבונים לא ידועים.

התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS

פרוטוקול המתואר לסינתזה ידנית של oligo-peptoids ואחריו רצף ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה.

סינתזה וניתוח ספקטרומטר מסה של Oligo-peptoids

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

ספקטרומטר מסה (MS) התפתחה כלי חשוב החקירה של מבנה, הדינמיקה של הרכבות macromolecular. כאן, אנחנו משלבים גישות MS לחקור היווצרות מורכבות חלבון ואיגוד ליגנד.

ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

כאן נציג של פרוטוקול benchtop ותשמרו זיקה מתכת כרומטוגרפיה לטיהור ודה למפת עוקבות polyhistidine מתויג, ברזל heme שאינו מחייב dioxygenase מתאים המעבדה הוראה לתואר ראשון.

Benchtop. מרותק למיטה כרומטוגרפיית זיקה מתכת, שיחזור ותייגת וזמינותו של Polyhistidine Metalloenzyme עבור המעבדה לתואר ראשון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות אשכולות בעלי חמצן מתכת דיסקרטית, polyoxometalates (פופונים), במגבלת המולקולה היחידה באמצעות פלטפורמה אלקטרונית מבוססת nanopore ביולוגי. השיטה מספקת גישה משלימה לכלי כימיה אנליטיים מסורתיים המשמשים בחקר מולקולות אלה.

אפיון פיסי ברזולוציה גבוהה של חלקיקים מתכתיים בודדים

אנו מציגים שיטת כימות קלה של מתכות הציגו דגימות שהוכנו באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת ללא קיבוע. השיטה משתמשת הידרוקסילנול כחול מחוון הצבע מתכת וספקטרוסקופיה UV-Vis כמו הגלאי.

קוונפיקציה של מתכת Leaching ב קיבוע מתכת זיקה כרומטוגרפיה

מאמר זה מתמקד בשימוש בספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית ובקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית כדי לחקור ולכמת את התרמודינמיקה של Cu(II) הקשורה לפפטידים וחלבונים.

כימות אינטראקציות הקשירה בין שאריות Cu(II) ופפטידיות בנוכחות ובהיעדר כרומופורים

מאמר זה מתאר פרוטוקול ניסיוני המשתמש בספקטרומטריית מסות-ניידות אלקטרו-יונים, חישובים קוונטיים אמפיריים למחצה ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות סף הנפתרת על-ידי אנרגיה, כדי למדוד את התרמוכימיה היחסית של הדיסוציאציה של קומפלקסים של מתכות טרנריות קשורות.

מחקרים תרמוכימיים של קומפלקסים טרנריים Ni(II) ו-Zn(II) באמצעות ספקטרומטריית ניידות-מסה של יונים

חקור שיטות IM-MS ומודלים מולקולריים לניתוח קליטת מתכות בפפטידים כמו מתנובקטין. טכניקות אלו מאפשרות פיתוח תרופות למחלות הקשורות לאיזון יוני מתכת כגון אלצהיימר וסרטן.

שיטות לקביעת מבנה ומנגנונים של זיהוי יון מתכת וחמצון פעילות של כריכת מתכת Oligopeptides

גלה סרטונים נוספים