שיטות לקביעת מבנה ומנגנונים של זיהוי יון מתכת וחמצון פעילות של כריכת מתכת Oligopeptides
7 בספטמבר 2019
בניידות המסה-הספקטרומטר ההמוני וטכניקות הדוגמנות המולקולריות ניתן לאפיין את ביצועי המתכת הסלקטיבית של הפפטידים העשויים מתכת-כריכה ומתיונין-הנחושת המטאוקובטין. פיתוח מחלקות חדשות של פפטידים מתכת הכלפת יסייע להוביל לtherapeutics עבור מחלות הקשורות באיזון מתכת ביון.
ספקטרומטריית מסה ניידות יון, או IM-MS, לזהות את היונים מוצרים שונים מן התגובה תלויי pH redox ו מחייב מתיל של פפטידים. עם המודל המולקולרי של המבנה שליו שלהם, מתאם מתכת ניתן לקבוע. IM-MS יכול לפתור כל אחד מיוני המוצר ולזהות את ההרכב המולקולרי שלהם על ידי מדידת זמני המסה לטעינה וההגעה שלהם ולהתייחסות לסטואיכומטריה, מצב הפרוטונציה והמבנה הקונפורמי שלהם.
פיתוח סוגים של פפטידים כלאט מתכת יעזור להוביל טיפולית למחלות הקשורות חוסר איזון יון מתכת, כגון מנקס ומחלת וילסון, סרטן, ומחלת אלצהיימר. כדי להתחיל, לנקות את צינורות הכניסה ESI נימי מחט ביסודיות עם כ 500 microliters של 0.1 חומצה אצטית קרחונית טוחה, 0.1 אמוניום הידרוקסיד טוחן, ולבסוף, מים deionized. השתמש בתנאי ESI-IM-MS מקוריים כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לאסוף את ספקטרום IM-MS יון שלילי וחיובי של פתרון פולי-DL-אלנין 10 עמודים לדקה למשך 10 דקות כל אחד.
פיפטה 200.0 microliters של 0.125 מילימולר חלופה מתנובקטין, או פתרון אמב, לתוך בקבוקון 1.7 מיליליטר. מדללים עם 500 מיקרוליטרים של מים deionized ומערבבים את הפתרון ביסודיות. התאם את ה- pH של המדגם ל- 3.0 על-ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של תוסף חומצה אצטית טוחנת 1.0.
הוסף 200.0 מיקרוליטר של יון מתכת 0.125 מילימולר לדגימה המותאמת ל- pH. לאחר מכן, להוסיף מים deionized להניב נפח סופי של 1.00 מיליליטר של המדגם. מערבבים היטב, ומאפשרים לדגימה לצייד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
באמצעות מזרק אף קהה, לקחת 500 microliters של המדגם ולאסוף את הספקטרום יון שלילי וחיובי ESI-IM-MS במשך חמש דקות כל אחד. השתמש ב-500 המיקרוליטרים הנותרים של המדגם כדי לתעד את ה- pH הסופי שלו באמצעות אלקטרודה מכוילת של מיקרו-pH. חזור על שלבים אלה, למעט כדי להתאים את ה- pH ל- pH ארבע, חמש, שש, שבע, שמונה, תשע או 10, על-ידי הוספת כמויות חדשות של חומצה אצטית או פתרונות אמוניום הידרוקסיד.
אסוף את הספקטרום השלילי והחיובי ESI-IM-MS של הפתרונות המתקבלים למשך 10 דקות כל אחד. מתוך ספקטרום IM-MS, לזהות אילו מינים טעונים של מתנובטין חלופי נמצאים על ידי התאמתם לדפוסי האיזוטופ המסה לטעינה התיאורטיים שלהם. לשם כך, פתח את MassLynx ולחץ על כרומטוגרמה כדי לפתוח את חלון הכרומטוגרמה.
עבור לתפריט קובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS. חלץ את ספקטרום הודעות מיידיות-MS על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני, גרירה לאורך הכרומטוגרמה ושחרור. חלון הספקטרום ייפתח, המציג את ספקטרום IM-MS.
בחלון הספקטרום, לחץ על כלים ומודל איזוטופ. בחלון הדוגמנות של איזוטופ, הזן את הנוסחה המולקולרית של זן ה- amb, בדוק את התיבה הצג היונים טעונים והזן את מצב המטען. לחץ על אישור. חזור על תהליך זה כדי לזהות את כל המינים בספקטרום IM-MS, ולתקליט את טווח האיזוטופים שלהם מסה לטעינה.
עבור כל מין אמב, הפרד בין כל מינים מקריים של מסה לטעינה וחלץ את הפצות זמן ההגעה שלהם, או ATDs, באמצעות דפוסי האיזוטופים ההמוניים שלהם כדי לזהות אותם. פתח את DriftScope ולחץ על קובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS. השתמש בעכבר ולחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי כדי להגדיל את תבנית האיזוטופים ההמונית-לטעינה של זן ה- amb.
השתמש בכלי הבחירה ובלחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את תבנית האיזוטופ. לחץ על לחצן קבל את הבחירה הנוכחית. כדי להפריד בין כל מינים מקריים של מסה לטעינה, השתמש בכלי הבחירה ובלחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את זמן ATD המיושר עם תבנית האיזוטופ של זן ה- amb.
לחץ על לחצן קבל את הבחירה הנוכחית. כדי לייצא את ATD, עבור אל קובץ, יצא ל- MassLynx. לאחר מכן בחרו 'שמור על זמן דריפט' ושמור את הקובץ בתיקיה המתאימה.
בחלון הכרומטוגרמה של MassLynx, פתח את הקובץ המיוצא שנשמר. לחץ על תהליך, שלב מהתפריט, בדוק את התיבה שילוב שיא של ApexTrack ולחץ על אישור. רשום את המרכז ואת האזור המשולב של ATD. לאחר חזרה על תהליך זה עבור כל קבצי הנתונים Amb ו- poly-DL-alanine IM-MS שנשמרו, השתמש ב- ATD המשולב עבור כל מיני ה- Amb שחולצו של היונים החיוביים או השליליים בכל נקודת טיגרציה כדי לנרמל לקנה מידה יחסי של אחוזים.
לשם כך, הזן את זהותם של המינים amb ואת ATD המשולב שלהם בכל pH לתוך גיליון אלקטרוני. עבור כל pH, השתמש בסכום ה- ATDs המשולבים כדי לנרמל את ה- ATD של המינים הבודדים לקנה מידה של אחוזים. התווה את אחוזי ההתעצמות של כל מין אמב לעומת pH כדי להראות כיצד האוכלוסייה של כל מין משתנה כפונקציה של pH.
באמצעות גיליון אלקטרוני, המר את חתך ההתנגשות של היונים השליליים והחיוביים של פולי-DL-אלנין הנמדדים בגז חיץ הליום לצלב ההתנגשות מתוקן. לאחר מכן, להמיר את זמני ההגעה הממוצעים של מכיילים פולי-DL-אלנין ו amb מינים לתוך זמני סחף. חבר את זמני ההיסחפות של מכוולי הפולי-DL-אלנין לעומת חתך ההתנגשות שלהם.
לאחר מכן, באמצעות התאמה של רגרסיה בריבועים לפחות, קבע את הערכים A prime ו- B, כאשר A prime הוא התיקון עבור פרמטרי הטמפרטורה, הלחץ והחשמל שדה, ו- B מפצה על ההשפעה הלא ליניארית של התקן ההודעות המיידיות. באמצעות ערכים אלה A prime ו- B עם ערך זמני סחף centroid, לקבוע חתך התנגשות מתוקן שלהם ואת חתך ההתנגשות שלהם. שיטה זו מספקת חתך התנגשות עבור מיני פפטיד עם שגיאות מוחלטות משוער של כ 2%באמצעות גאוסיאן עם GaussView, ואת B3LYP LanL2DZ רמת התיאוריה, לאתר קונפורמרים אופטימיזציה גיאומטריה עבור כל סוגי התיאום האפשריים של מינים amb מסה לטעינה שנצפו.
רמת התיאוריה B3LYP LanL2DZ מורכבת מהפונקציונליות ההיברידית ההיקפית של בק שלוש, סט הבסיס של דאנינג ופוטנציאל ליבת האלקטרונים. לחלץ את הניתוחים תרמוכימיים של כל אחד קונפורמים אופטימיזציה מקובץ פלט Gaussian ולחשב חתך ההתנגשות התיאורטית שלהם באמצעות שיטת Lennard-Jones בקנה מידה יון מתוכנית סיגמא. מתוך קונפורמי האנרגיה החופשית הנמוכים ביותר, קבע איזה קונפורמר מציג את חתך רוחב ההתנגשות לנארד-ג'ונס שמסכים עם חתך ההתנגשות הנמדד IM-MS.
תהליך זה מזהה את המבנה שליו ואת סוג הקואורדינציה עבור הקונפורמים שנצפו בניסוי. מידול מולקולרי דורש השוואה של האנרגיה החופשית וחתכים התנגשות של קונפורמרים עם אתרי כלאט מתכת שונים, קשרים cis וטרנס פפטיד, גשרי מלח, מימן מליטה, ואינטראקציות pi-cation. מחקר IM-MS של מתנובטין חלופי אחד הראה כי הוא chelated הן נחושת ואבץ ions באופן תלוי pH, אבל באמצעות מנגנוני תגובה שונים ואתרי תיאום.
כריכת אבץ (II) נצפתה ב- pH של יותר משש, בעיקר יצירת קומפלקס טעון שלילי אחד, המציין אבץ (II) היה tetrahedrally מתואם על ידי שני imidazoles ושני thiolates. כריכת נחושת (II) לוותה על ידי thiols להרכיב גשר disulfide. ב- pH של יותר משישה, קומפלקס נחושת טעון שלילי יחיד (II) נוצר, המציין imidazole ושני חנקן בין deprotonated היו תיאום נחושת(II)עם זאת, מתחת pH שש, הוספת נחושת(II) גם יצרה את קומפלקס נחושת טעון חיובי יחיד(I),כמו גם יחיד טעון חיובי נחושת (II) קומפלקס מעל pH שש.
מחקרים IM-MS של amb 2 ו amb ארבעה גם מראים כי תגובות נחושת נתן מוצרים שונים במספרים של גשרים דיסולפידים inter-או intramolecular, מספר נחושת(I)או נחושת(II)ions, ומספר אתרי deprotonation, אשר השתנה כפונקציה של pH. התוצאה IM-MS עם מידול מולקולרי הראה כי מתנובוקטין חלופי יכול לתאם עד שלושה נחושת (I) ions באמצעות thiolate, imidazoles, וקבוצות קרבוקסילאט. יש לבחור בקפידה את ההגדרות האינסטרומנטליות של IM-MS כדי לשמר את הסטויצ'יומטריה של הפפטידים, את הפצות ההאשמות ואת המבנים הקונפורמיים, כמתואר בטקסט.
שילוב של טווח רחב יותר של גודל שישפיע על תיאום מתכת כגון טירוזין בחומצה אספרטית יאפשר הבנה טובה יותר של הקשר בין מבנה לתפקוד. IM-MS עם מודלים מולקולריים הפכו לטכניקות חלופיות להאצת קריסטלוגרפיה וספקטרוסקופיה של NMR לקביעת המבנים הקונפורמיים של חלבונים, DNA, שומנים, ואת המתחמים שלהם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה משתמש בספקטרומטריית מסה של ניידות יונים (IM-MS) ומיפוי מולקולרי כדי לנתח את יכולות הכליטציה של מתכות של פפטידים מתוכננים, כולל מתנובקטין. הממצאים שואפים לתרום לפיתוח תרופות למחלות הקשורות לחוסר איזון של יוני מתכת.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ספקטרומטריית מסה
רקע
- חוסר איזון של יוני מתכת קשור למחלות שונות.
- ניתן לתכנן פפטידים שייקשרו באופן סלקטיבי ליוני מתכת.
- IM-MS יכולה לאפיין את ההרכב המולקולרי של הפפטידים הללו.
- הבנת הקישור למתכת יכולה להוביל להתקדמויות טיפוליות.
מטרת המחקר
- לאפיין את הביצועים של פפטידים הקושרים מתכות.
- לחקור את הפוטנציאל של הפפטידים הללו בטיפול במחלות הקשורות ליוני מתכת.
- להשתמש ב-IM-MS לניתוח מפורט של אינטראקציות פפטידים.
שיטות בהן נעשה שימוש
- ספקטרומטריית מסה של ניידות יונים (IM-MS) לזיהוי יוני תוצר.
- מיפוי מולקולרי לקביעת מבני הפפטידים.
- ניתוח של תגובות חיזור ותגובות קישור מתיל תלויות pH.
- איסוף ספקטרום IM-MS בתנאים טבעיים.
תוצאות עיקריות
- IM-MS מפענחת ביעילות יוני תוצר ומזהה את הרכבם.
- מבני הפפטידים מתואמים עם יכולות הכליטציה שלהם.
- הממצאים תומכים בפיתוח פפטידים חדשים הכולטים מתכות.
- יישומים טיפוליים פוטנציאליים למחלות כמו אלצהיימר וסרטן.
מסקנות
- פפטידים הכולטים מתכות מראים הבטחה לשימוש טיפולי.
- IM-MS היא כלי רב ערך לאפיון פפטידים.
- יש צורך במחקר נוסף כדי לחקור יישומים קליניים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) combined with molecular modeling enables biopharma R&D to characterize metal-binding peptide interactions with high structural resolution, supporting target validation for metalloprotein-related diseases. This approach provides quantitative collision cross section (CCS) and mass-to-charge (m/z) data that inform binding stoichiometry, protonation states, and conformational changes, facilitating mechanistic de-risking in early discovery. By linking pH-dependent metal coordination to functional output, IM-MS aids in prioritizing peptide candidates with selective chelating properties for therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Resolves metal-bound peptide species by m/z and CCS to identify stoichiometry and protonation states under varying pH conditions.
- Scientific Value: Distinguishes coordination sites (e.g., imidazole, thiolate, amide) through correlation of IM-MS data with B3LYP/LanL2DZ-modeled conformers.
- Scientific Value: Identifies pH-dependent switching between Cu(I) and Cu(II) complexes, revealing redox-active binding mechanisms relevant to oxidative stress pathways.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Enables normalization of ion arrival time distributions (ATDs) across pH titrations to quantify relative populations of peptide-metal complexes.
- Operational Value: Uses poly-DL-alanine calibrants to correct CCS measurements, ensuring reproducible and comparable data across experimental runs.
- Operational Value: Supports high-confidence peak integration via ApexTrack in MassLynx, improving assay precision for low-abundance species.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links peptide structural motifs (e.g., imidazole, thiolate, carboxylate) to metal-binding capacity, informing structure-function relationships for lead optimization.
- Translational Value: Demonstrates capacity to coordinate up to three Cu(I) ions via thiolate, imidazole, and carboxylate groups, suggesting multivalent buffering potential relevant to neurodegenerative metal homeostasis.
- Translational Value: Differentiates Zn(II) and Cu(II) binding mechanisms (tetrahedral vs. disulfide-bridged), enabling selective targeting in diseases like Wilson’s and Alzheimer’s.
Pipeline & Workflow Integration
IM-MS with molecular modeling fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling data-driven progression to lead identification by providing mechanistic insights into metal-peptide interactions.
- Discovery Biology: Tests how pH influences metal binding affinity and coordination geometry, clarifying structure-activity relationships in metallopeptide design.
- Screening: Delivers quantitative CCS and m/z outputs that allow comparison of metal-binding affinity and specificity across peptide variants.
- Analytics: Provides drift time and ATD measurements that, when calibrated, yield accurate CCS values for comparing experimental and theoretical conformers.
- Translational Research: Connects observed coordination environments (e.g., Zn(II) tetrahedral, Cu(I) thiolate-rich) to disease-relevant metal dysregulation pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for metal-peptide characterization that can be applied across multiple target classes and peptide libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating experimental IM-MS data with theoretical collision cross sections from low-energy conformers.
- Operational Value: Ensures reproducibility through native ESI conditions, pH-controlled sample preparation, and instrument calibration using poly-DL-alanine standards.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying peptides with selective, pH-responsive metal binding, reducing off-target effects in metallotherapeutic design.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated metal coordination sites and redox behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native ESI-IM-MS operation, ion mobility calibration, and spectral interpretation using MassLynx and DriftScope.
- Dependence on high-resolution IM-MS instrumentation capable of resolving ATDs for overlapping m/z species.
- Needs access to molecular modeling software (Gaussian/GaussView) and collision cross section prediction tools (Sigma, ion-scaled Lennard-Jones).
- Must maintain strict pH control during sample preparation to accurately probe metal-binding dependencies.
- Limited to gas-phase stable complexes; may not capture solution-phase dynamics or transient intermediates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
Electrospray-ion Mobility-Mass Spectrometry Analysis
3:02
Analysis of ESI-IM-MS pH Titration Data
6:11
Collision Cross-Sections and Computational Methods
8:30
Results: Reaction Mechanisms and Coordination Sites of the Alternative Methanobactin Complexes
10:00
Conclusion
