ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית, או SAPNs, יכולים לשמש לפיתוח חיסונים נגד מחלות זיהומיות שונות. שיטה זו שאנו מתארים כאן יכולה לשמש לטיהור, לתיקון מחדש ולאפיון של SAPNs המכילים צרור שישה סלילים. חלקיק זה יכול להציג אנטיגנים טריקריים קונפורמציה דמוית יליד.

עם שינויים קלים, ניתן ליישם שיטה זו על מבנים חדשניים אחרים של חיסון SAPN. יתר על כן, זה יכול להיות מועבר בקלות לייצור בקנה מידה גדול עבור ניסויים קליניים. עבור תזה של E.coli שנקטפו המבטאים את SAPN צרור שישה סליל, להשתמש בבדיקה עם תפוקת sonication של 150 וואט עם ארבע שניות של sonication ושש שניות של מנוחה, כדי sonicate כדורי חיידקים לשימוש חוזר ב 40 מיליליטר של חיץ imidazole חינם על הקרח במשך חמש דקות.

צנטריפוגה lysate הסלולר כדי ליצור על טבעי ברור ולהעביר את העל-טבעי לבקבוק סטרילי 150 מיליליטר. לאחר מכן, להביא את המדגם עד נפח סופי של 100 מיליליטר עם חיץ טרי imidazole חינם. כדי לבודד את החלבון המעניין, פתח את תוכנת FPLC ולחץ על האפשרות שיטה חדשה.

בתפריט הגדרות שיטה, פתח את התפריט הנפתח מיקום עמודה ובחר C1 יציאה 3. בתפריט הנפתח 'מוצג לפי טכניקה', בחרו 'אהדה'. בתפריט הנפתח סוג עמודה, בחר אחרים, HisTrap HP וחמישה מיליליטר.

אמצעי האחסון של העמודות והתיבות לחץ יוגדרו באופן אוטומטי לערכים המתאימים. לחץ על מיתאר שיטה וגרור את הלחצנים שיווי משקל ויישום לדוגמה, שלושה לחצנים לשטיפת עמודות ולחצן אלוטיון מהתפריט המוקפץ ספריית שלבים לצד החץ לפני סגירת התפריט ספריית שלבים. לחץ על שיווי משקל והגדר את הערכים המפורטים בטבלה למאגר התחלתי B, 4%מאגר סופי B, 4%ואמצעי אחסון של עמודות, חמישה.

לחץ על יישום לדוגמה. בתיבה טעינה לדוגמה, לחץ על לחצן הפתק עבור הזרק דוגמה בעמודה עם משאבה לדוגמה, ואשר שהתיבה לצד השתמש בקצב זרימה מהגדרות פעולת השירות מסומנת בתיבה הזרקה לדוגמה עם משאבת מערכת. שנה את ערך תיבת אמצעי האחסון ל- 100 מיליליטר ואת ערכת איסוף השברים שיש להפוך לזמינה.

לחץ על התיבה השתמש בגודל שבר מהגדרות פעולת שירות ושנה את גודל השבר לארבעה מיליליטר. לחץ על לחצן שטיפת העמודות הראשון, הגדר את הערכים המפורטים בטבלה למאגר התחלתי B, 4%Final Buffer B, 4%ונפח עמודה, 10. לחץ על התיבה הפוך ערכת אוסף שברים לזמינה ולחץ על הסר את הלחצן השתמש בגודל שבר מהגדרות פעולת השירות.

שנה את גודל השבר לארבעה מיליליטר ולחץ על לחצן שטיפת העמודות השני. הגדר את הערכים בטבלה למאגר התחלתי B, 0%מאגר סופי B, 0%ואמצעי אחסון של עמודות, חמישה. לחץ על התיבה הפוך ערכת אוסף שברים לזמינה ולחץ על הסר את הלחצן השתמש בגודל שבר מהגדרות פעולת השירות.

שנה את גודל השבר לארבעה מיליליטר ולחץ על לחצן שטיפת העמודות השלישי. הגדר את הערכים בטבלה למאגר התחלתי B, 0%מאגר סופי B, 0%ואמצעי אחסון של עמודות, 10. לחץ על לחצן הפוך ערכת אוסף שברים לזמינה ולחץ על התיבה השתמש בגודל שבר מהגדרות פעולת השירות.

לאחר מכן, שנה את גודל השבר לארבעה מיליליטר. לחץ על לחצן אלוטיון ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על המידע בטבלה. בתפריט הנפתח, לחץ על מחק שלב וגרור את לחצן מעבר צבע Isocratic אל הטבלה פעמיים, כך שיהיו שני ערכים.

הגדר את הערך עבור הערך הראשון למאגר התחלתי B, 30%מאגר סופי B, 30%ואמצעי אחסון של עמודות, 10. הגדר את הערך עבור הערך השני למאגר התחלתי B, 100%מאגר סופי B, 100%ואמצעי אחסון של עמודות, 10. לחץ על לחצן הפוך ערכת אוסף שברים לזמינה ולחץ על התיבה השתמש בגודל שבר מהגדרות פעולת השירות.

לאחר מכן, לחץ על שמירה בשם ותן שם לטיהור הקובץ. מניחים את המשאבה צינורות של FPLC לתוך חיץ לשטוף ללא imidazole, ואת המשאבה B צינורות לתוך חיץ imidazole 500 מילימולאר. מניחים את צינורות משאבת הדגימה לדגימה של 100 מיליליטר והפעילו את תוכנית הטיהור.

כאשר יש צורך לשטוף isopropanol 60%, להשהות את התוכנית, להעביר את המשאבה צינורות מן לשטוף imidazole חינם לתוך לשטוף 60%isopropanol, ולהפעיל מחדש את התוכנית. בסוף לשטוף, להשהות את התוכנית שוב, להחזיר את המשאבה צינורות A למאגר לשטוף imidazole חינם, ולהפעיל מחדש את תוכנית הטיהור. כדי להעריך את טוהר החלבון המטוהר, יש לשלב תחילה את שברי הזרימה דרך, לשטוף אחד, לשטוף שניים ולשטוף שלושה שלבים, בצינורות חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר.

לאחר מכן, יש לערבב 15 מיקרוליטרים מכל צינור מדגם עם 15 מיקרוליטרים של חיץ לאמלי 2X בצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים של 0.5 מיליליטר ולנתק את הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בסוף הדגירה, הקימו מנגנון ריצה ג'ל עם שלושה ג'לים פוליאקרילמידים נטולי כתמים של ארבעה עד 20% במאגר ריצה של Tris-Glycine SDS-PAGE. טען שמונה מיקרוליטרים של סמן משקל מולקולרי ל הבאר הראשונה של כל ג'ל ו -30 מיקרוליטרים של דגימה denatured ל בארות האחרות.

הפעל את הג'לים ב 200 וולט עד חזית הצבע פוגע בחלק התחתון של הג'ל בקצרה לשטוף את הג'לים עם מים deionized לפני הדמיה מיידית עם מערכת הדמיה ללא כתמים. לאחר מכן, זהה את השברים המכילים רצועות חלבון בגודל הנכון ובריכה שברים אלה. לחבילת שישה סלילים SAPN refolding, להוסיף 10 עד 20 מיליליטר של חלבון מאגר ל 10 קילודלטון משקל מולקולרי לחתוך קלטת דיאליזה.

דיאליזה את הקלטת בשמונה אוריאה טוחה, טריס 20 מילימול, 5% גליצרול, וחמישה מילימולרים TCEP בטמפרטורת החדר לילה. למחרת בבוקר, להקטין את ריכוז אוריאה במאגר הדיאליזה צעד אחר צעד על ידי שתי טוחנות כל שעתיים כדי לדיאליזה איטית את אוריאה את המדגם. כאשר ריכוז אוריאה מגיע לשתי טוחנות, להעביר את מנגנון הדיאליזה לארבע מעלות צלזיוס ולהדיאליז את המדגם לתוך 120 מילימולר אוריאה, טריס 20 מילימולר, ו 5% גליצרול לילה כדי לסיים את refolding.

למחרת בבוקר, להסיר את החלבון refolded מן הקלטת ולסנן את SAPN צרור שישה סליל באמצעות מסנן מזרק פלואוריד פוליווינילידין 0.22 מיקרומטר. כדי למדוד את גודל החלקיק הממוצע של SAPN צרור שישה סלילים, להוסיף 45 microliters של שישה סליל צרור SAPN כדי cuvette חד פעמי למקם את cuvette במכונת DLS. לאחר מכן, צרו קובץ מדידה חדש והפעילו הליך פעולה סטנדרטי כתוב מראש לחלבון ב-120 מילימולרים אוריאה, טריס 20 מילימולאר וחוצץ גליצרול של 5% ב-25 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, התחל את המדידה. הגודל הממוצע של Z, ה- PDI ותוצאות ההפצה יחושבו עבור כל הפעלה. המכונה תקרא את הדגימה חמש פעמים.

חבילת שישה סלילים זו, שהורכבה במלואה, בנויה על רצפי חלבונים שצפויים להתקפל לחלקיק המכיל 60 עותקים של המונומר. סה"כ ליזאט התא שימש לטיהור מונומרים SAPN צרור שישה סלילים על ידי FPLC באמצעות עמודת ניקל, המוכיח כי החלבון אלוט הן 150 ו 500 מילימולרים imidazole. הכרומטוגרמה מציגה גם שתי פסגות אחרות בנפח כולל של 185 ו-210 מיליליטר המתאים לשטיפת האיזופרופנול ולשטיפה נטולת האימידזול בהתאמה.

השברים ואת הטוהר של חלבון רקומביננטי יכול להיות מזוהה על ידי ג'לים SDS-PAGE הדרגתי עם חלבון העניין ממוקם בעיקר שבר 68 עד 79. ניתוח כתם מערבי עם נוגדנים נגד שלו ואנטי 167D4 הצביע על כך שהשברים המפולגים אכן היו החלבון המעניין. הכתמים גם הדגימו את נוכחותם של מולטימרים SAPN צרור שישה סלילים.

הדגימות שהכילו את מונומרים החלבון של עניין היו מקופלים לתוך SAPN צרור שישה סלילים שהורכבה במלואו על ידי דיאליזה והפצה גודל חלקיקים נקבע על ידי DLS וניתוח מעקב חלקיקים. הדמיה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור חשף נוצר היטב בודדים שישה סליל צרור חלקיקי SAPN עם התפלגות גודל המתקבל שתי טכניקות גודל חלקיקים. השלב החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא תיפול מחדש של חבילת ששת המסוקים SAPN.

ה- pH הנכון והעוצמה היונית של מאגר ההתפלה הם חיוניים. באמצעות לשטוף isopropanol במהלך טיהור, הצלחנו להפחית LPS מזהם לרמה נמוכה מאוד. עם זאת, ניתן להפחית את LPS עוד יותר באמצעות עמודת חילופי אניון לפי הצורך.

טכנולוגיה זו יכולה להיות מותאמת בקלות ליישום אנושי. SAPN מבוטא בקטריאלי כבר קנה המידה לניסוי קליני בשלב הקרוב 1/2a מלריה.