Name: ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 s
Description: למד שיטה לטיהור, קיפול מחדש ואפיון ננו-חלקיקי חלבון המתאספים עצמית (SAPNs) לפיתוח חיסונים. הטכניקה מציגה אנטיגנים טרימריים בקונפורמציה טבעית וניתנת להתאמה לייצור בקנה מידה גדול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי הסכם שיתופי (W81XWH-11-2-0174) בין קרן הנרי מ. ג'קסון לקידום הרפואה הצבאית, Inc., ומשרד ההגנה של ארה ב. הנוגדן נגד HIV-1 gp41 mAb 167-D הרביעי התקבל מ ד ר סוזן זוללה-פזנר דרך התוכנית הכימית של מערכת האיידס NIH.

<ol><li>Karch, C. P., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+technologies%3A+From+whole+organisms+to+rationally+designed+protein+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies.</a> Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).</li>
<li>Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Immunologic+Properties+of+Soluble+Versus+Particulate+Antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens.</a> Frontiers in Immunology. 9, 598(2018).</li>
<li>Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+basis+for+enhanced+immunity+of+nanoparticle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).</li>
<li>Yeates, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+Principles+for+Designing+Highly+Symmetric+Self-Assembling+Protein+Nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).</li>
<li>Marcandalli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Potent+Neutralizing+Antibody+Responses+by+a+Designed+Protein+Nanoparticle+Vaccine+for+Respiratory+Syncytial+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.</a> Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).</li>
<li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decorating+Self-Assembled+Peptide+Cages+with+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins.</a> ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).</li>
<li>Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembling+Protein+Nanoparticles%3A+implications+for+HIV-1+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).</li>
<li>Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+design+of+peptides+that+self-assemble+into+regular+polyhedral+nanoparticles%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles).</a> Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).</li>
<li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+displaying+HIV-1+Env+V1V2+loop+in+a+native-like+trimeric+conformation+as+vaccine+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen.</a> Nanomedicine. , (2018).</li>
<li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+P.+falciparum+specific+coiled-coil+domain+to+construct+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+to+prevent+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-adjuvanted+nanoparticle+based+vaccine+against+infectious+bronchitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus.</a> PLoS One. 13 (9), e0203771(2018).</li>
<li>Wahome, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation-specific+display+of+4E10+and+2F5+epitopes+on+self-assembling+protein+nanoparticles+as+a+potential+HIV+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology+%26+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine.</a> Chemical Biology & Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).</li>
<li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+a+novel+immunogenic+nanoparticle+platform+for+Toxoplasma+peptide+vaccine+in+HLA+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice.</a> Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).</li>
<li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonadjuvanted+polypeptide+nanoparticle+vaccine+confers+long-lasting+protection+against+rodent+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria.</a> Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).</li>
<li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibody+and+CD8%2B+T-cell+responses+to+the+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+protein+induced+by+a+nanoparticle+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine.</a> PLoS One. 7 (10), e48304(2012).</li>
<li>Seth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+targeting+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+delivered+in+three+Army+Liposome+Formulation+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants.</a> Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).</li>
<li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+nanoparticles+with+built-in+flagellin+domains+increases+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+falciparum+based+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine.</a> Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).</li>
<li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+nanovaccine+confers+robust+immunity+against+Toxoplasma%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma.</a> NPJ Vaccines. 2, 24(2017).</li>
<li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+self-adjuvanted+protein+nanoparticles+provides+protection+against+lethal+influenza+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge.</a> Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).</li>
<li>Haynes, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-correlates+analysis+of+an+HIV-1+vaccine+efficacy+trial%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial.</a> New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).</li>
<li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).</li>
<li>O' Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+gp120+V1V2+loop%3A+structure%2C+function+and+importance+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development.</a> Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).</li>
<li>Babapoor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Vaccine+Using+Nanoparticle+Platform+to+Present+Immunogenic+M2e+against+Avian+Influenza+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection.</a> Influenza Research and Treatment. 2011, 126794(2011).</li>
<li>Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+self-assembling+protein+nanoparticle+architectures+for+applications+in+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design.</a> Royal Society Open Science. 4 (4), 161092(2017).</li>
<li>Indelicato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+Governing+the+Self-Assembly+of+Coiled-Coil+Protein+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles.</a> Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).</li>
<li>Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+assemblies+and+their+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Nanoscale assemblies and their biomedical applications.</a> Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740(2013).</li>
<li>Rey, F. A., Lok, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+Features+of+Enveloped+Viruses+and+Implications+for+Immunogen+Design+for+Next-Generation+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines.</a> Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).</li>
<li>Bacterial Endotoxins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22United+States+Pharmacopeia+%28USP%29%22">United States Pharmacopeia (USP)</a>. , Ch. 85 (2011).</li>
<li>Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals. , Food and Drug Adminstration. Maryland. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/media/76255/download">https://www.fda.gov/media/76255/download</a> (1993).</li>
</ol>

ההשקפות המבובעות הן אלה של המחברים, ואין לפרש אותן כדי לייצג את מעמדם של צבא ארה ב או של משרד הביטחון. פיטר Burkhard יש עניין בחברה בשם אלפא-O פפטידים AG ו יש פטנטים על הטכנולוגיה. למחברים האחרים אין השתייכות או מעורבות פיננסית עם כל חברה עם עניין פיננסי על הנושא המוצג בעיתון זה.

ננוטכנולוגיה מספקת יתרונות ופתרונות רבים עבור פיתוח חיסונים ביחידת המשנה. ננו חיסונים יכולים שוב ושוב להציג אנטיגנים כמו חלקיקים למערכת החיסונית מארח הגדלת החיסוני26. אמנם ישנם סוגים רבים ושונים של ננו חיסונים, אנו מאמינים כי אלה מורכב של החלבון דה נובו מעוצב נראה הגישה החזקה ביותר עבור פיתוח חיסונים1. הם יכולים להיות מהונדסים ללא כל רצף הומולוגיה לחלבונים המארחים ולהציג את האנטיגן של עניין קרוב מקורי כמו היווצרות תוך מתן עלות ייצור נמוכה ותשואות מוצר גבוה. דוגמה מעולה לגישה זו היא טכנולוגיית SAPN, אשר הגשתי חיסונים נגד מחלות זיהומיות מרובות7. מטפל בקשיים בפיתוח החיסון HIV-1, יש לנו מהונדסים ייחודי shb-sapn ליבה כדי להציג ביעילות את אנטיגן V1V2 בצורה מקורית trimeric קונפורמציה9. מטרות חיסון רבות, במיוחד עבור מחלות ויראליות, קיימות כטרימרס27. תופעה זו מציינת כי העיצוב שלנו SAPN יש השלכות רחבות להתפתחות של חיסונים תת-יחידתי.
בשיטה זו, אנו מדגימים כיצד לייצר SHB-סאפאן במערכת ביטוי E. coli . הביעו תשואה גבוהה של חלבון (כ -6 מ"ג/100 מ ל של התרבות). החלבון הכיל 10 histidines והיה מטוהר בקלות באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת מתוך קיבוע עם Ni2 + טור. האורך הזה של התגית שלו נמצא האופטימלי לתשואה החלבון הגבוהה ביותר. חלבון מטוהר הכיל את האורך המלא של החלבון מעוצב כפי שצוין על ידי הנוכחות של מסוף N-טרמינל ו C מסוף חוזר. אנו מנוצלים טכניקות מקובלות נרחב ואופטימיזציה אותם לביטוי, ייצור, ואפיון של הליבה SHB-SAPN. חוסר הייצור של חלבון באורך מלא במהלך הפיתוח של SAPN המכיל אפירופה חלבון חדש יכול להצביע על בעיית ביטוי של הגן בתא המארח. אם זה קורה, הגנים ומערכת הביטויים חייבים להיות מחדש ולהתאים לפרוטוקול המתואר. השינוי של sonication זמן או אינטנסיביות עשוי גם להגביר את הריכוז של חלבון באורך מלא החזוי.
החלקיקים המקופלים היו בטווח הגודל הצפוי (20 עד 100 ננומטר)8,24,25 כפי שנקבע על-ידי ניתוח DLS ו-ננו-חלקיק. תוצאות אלה אושרו עוד יותר באמצעות TEM. אם קיימות בעיות בשלב זה, היא בדרך כלל נובעת מבעיה בחוזק החומציות או היונית של המאגר המתקפל מחדש. כאשר חלקיקים גדולים מזוהים בטכניקות שינוי גודל החלקיקים, הוא מציין צבירה, אשר ניתן להימנע על ידי הגדלת ה-pH של מאגר מתקפל מחדש. אם החלקיקים אינם מזוהים על ידי DLS, לאמת את ריכוז החלבון ולבדוק את ה-pH של המאגר. ריכוז החלבון הסופי עבור DLS צריך להיות לפחות 100 μg/mL. אם הריכוז הוא לא הבעיה, זה מעיד על שפע של חלקיקים קטנים, בנוי לחלוטין, אשר ריכוז ניתן לצמצם על ידי הפחתת ה-pH. לחילופין, ריכוז נתרן כלוריד יכול להיות מותאם לטווח האופטימלי כדי למזער את הנוכחות של חלקיקים עם גודל לא רצוי.
בסופו של דבר, באמצעות צעד שטיפת איזופנול במהלך טיהור היינו מסוגלים להפחית LPS מזהם מן המארח E. coli כדי 0.01 האיחוד האירופי/ΜG של sapn שהוא מתחת מינהל המזון והתרופות (FDA) של 5 האיחוד האירופי/ק ג של משקל הגוף עבור מוצרי ההזרקה 28. רמה זו ניתן לצמצם עוד יותר באמצעות עמודת החליפין אניון המכונה גם עמודה Q. אם רמות גבוהות של אנדוטוקסין עדיין קיימות, בדוק את כל החומרים ששימשו להכנת המאגר. זכור להשתמש רק כלי זכוכית depyrogenated ו אנדוטוקסין חינם פלסטלינה בשיטה זו.
תוצאות אלה מצביעות על כך שפיתחנו בהצלחה שיטה כדי לייצר את הליבה SHB-SAPN שניתן להשתמש בו עבור לימודי חיסונים פרה-קליניים. שיטה זו עם שינויים קלים בלבד, אם בכלל, ניתן להחיל על טיהור של SHB-סאפאן כאשר אנטיגן של עניין נוסף. שימוש בשיטה זו כנקודת התחלה אחד השינויים העיקריים הוא בשלב הימנעות. חלבונים שונים בריכוזים שונים של ריכוזי שונות שיש לקבוע ניסויים. ההבדל העיקרי השני עשוי להיות ההרכב של המאגר מתקפל מחדש. אופטימיזציה ידרוש בדיקות התנאים pH שונים, כמו גם החוזקות יונית.
בהתחשב בעבודה בעתיד, יש צורך רק בשני שינויים קלים כדי לאפשר יישום אנושי של SHB-SAPN. הראשון הוא כי וקטור הביטוי צריך להיות שונה לסמן התנגדות kanamycin בעקבות אלרגיה אמפיצילין בבני אדם29. הדרישה העיקרית השנייה של ייצור החלבון לשימוש אנושי היא לייצר את SHB-SAPN בתקשורת ללא מוצרים בעלי חיים. מחקר בקנה מידה קטן כבר הצביע על תשואה סבירה של חלבון במדיה המבוססת על צמחים. העבודה המוצגת כאן הוא מדרגי בקלות עבור ייצור GMP האולטימטיבי כפי שהוצג עם מועמד חיסון נגד מלריה, FMP01416. זה בקנה מידה גדול FMP014-sapn הייצור כללה הן את החליפין אניון ואת שלבי חילופי הקטיון כדי להפחית lps ו Ni2 + תוכן מהמוצר הסופי. זה חיידקי מבוטא SAPN כבר בקנה מידה של שלב הקרובה 1/2a ניסוי קליני.

בעוד פיתוח החיסון המסורתי התמקד פתוגנים מופעל או החליש, המיקוד של חיסונים מודרניים השתנה לכיוון החיסונים המשניים1. גישה זו יכולה להוביל לתגובה ממוקדת יותר, פוטנציאל יעיל יותר מועמדים חיסונים. עם זאת, אחד החסרונות העיקריים הוא כי חיסונים תת יחידות אינם חלקיקים כמו אורגניזמים שלמים אשר יכול לגרום חיסוני מופחת2. ננו-חלקיק כמו מערכת התצוגה אנטיגן חוזרים יכול להיות היתרונות של הן הגישה ממוקד החיסון הן כמו גם את האופי החלקיקי של האורגניזם כולו1,3.
בין הסוגים הקיימים של ננו חיסונים, הרכבות חלבון מעוצב באופן רציונלי לאפשר את העיצוב והפיתוח של מועמדים חיסונים שיכולים להציג עותקים מרובים של האנטיגן פוטנציאלי בצורה מקורית של1,4 ,5,6. דוגמה אחת של הרכבות חלבון אלה הם חלקיקי חלבון הרכבה עצמית (סאפאנס)7. הסימות מבוססים על הסליל המתפתל בתחומים והם מבוטאים באופן מסורתי ב- es, coli קולי8. Sapn מועמדים חיסונים פותחו עבור מגוון רחב של מחלות כגון מלריה, סארס, שפעת, טוקסופלזמוזיס, ו-HIV-19,10,11,12,13 , מיכל בן 14 , מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , 19. העיצוב של כל מועמד sapn הוא ספציפי לפתוגן של עניין, עם זאת, הייצור, טיהור, וטכניקות קיפול מחדש הם בדרך כלל החלים באופן כללי.
אחד האינטרסים הנוכחיים שלנו הוא חיסון אפקטיבי-1 לאיידס. בשנת RV144 – הניסוי הקליני היחיד בשלב III של חיסון HIV-1 שהפגין יעילות צנועה – הסיכון הקטן לזיהום היה מתואם עם נוגדנים igg לולאה V1V2 של חלבון המעטפה20,21. הצגת הtrimeric הטבעית של אזור זה נחשבת לחשובה לאימונוגלוגניות המגנה22. כדי להציג את הלולאה V1V2 בצורה הקרובה ביותר ליצירת מקורי כמו האפשרי, פיתחנו הוכחה של עיקרון המועמד SAPN החיסון כי הכיל את ה-HIV-1 המעטפה שלאחר היתוך שישה הסליל (SHB) להציג את הלולאה V1V2 לתוך החיבור הנכון9 . מועמד זה זוהה על ידי נוגדנים מונובטיים ידוע לחלבון מעטפות HIV-1. עכברים החיסונים עם V1V2-SHB-SAPN העלה V1V2 נוגדנים ספציפיים, כי, החשוב ביותר, כרוך gp70 V1V2, הקונפוראיות הנכונה9. הליבה SHB-SAPN יכול להיות פונקציות אחרות מעבר לתפקיד כנשא עבור הלולאה HIV-1 V1V2. כאן נתאר מתודולוגיה מפורטת לביטוי, טיהור, קיפול מחדש ואימות של ליבת SHB-SAPN. בחירת הרצף, עיצוב ננו-חלקיק, שיבוט מולקולרי, וטרנספורמציה של E. coli תוארו בעבר9.

<table><tbody><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>BioRad</td><td>1610732</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>BioRad</td><td>1610710</td><td>25 מ"ל</td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>פישר</td><td>BP26181</td><td>4 ליטר</td></tr><tr><td>2x Laemmli מאגר דגימה</td><td>BioRad</td><td>1610737</td><td>30 מ"ל</td></tr><tr><td>40ul קובט חבילה של 100 עם פקקים</td><td>Malvern Panalytical</td><td>ZEN0040</td><td>100 חבילה</td></tr><tr><td>4&ndash; 20% ג'ל חלבון טרומי Mini-PROTEAN TGX, 10 בארות, 30 ומיקרו; l</td><td>BioRad</td><td>4561093</td><td>10 חבילות</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>Anti-6X נוגדן התג שלו [HIS. H8]</td><td>AbCam</td><td>ab18184</td><td>100 מ"ג</td></tr><tr><td>אנטי-HIV-1 gp41 חד-שבטי (167-D IV)</td> <td>מאגר ריאגנטים לאיידס</td><td>11681</td><td>100 מ"ג</td></tr><tr><td>מצע BCIP/NBT, תמיסה</td><td>Southern Biotech</td><td>0302-01 &nbsp;</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>קורנינג&nbsp; מערכות מסנן/אחסון ואקום חד פעמי</td><td>פישר</td><td>09-761-108</td><td>מגוון גדלים</td></tr><tr><td>רשת פורמבר/פחמן 400, נחושת כ. גודל חור רשת: 42& מיקרו; מ</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>01754-F</td><td>25 חבילות</td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp; 5 מ"ל HisTrap HP עמודות ארוזות מראש GE</td><td>HealthCare</td><td>45-000-325</td><td>5 חבילות</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td></td><td>פישר BP229-4</td><td>4</td></tr><tr><td>ליטר עיזים נגד עכבר IgG H& L (פוספטאז אלקליין)</td> <td>ABCam</td><td>ab97020</td><td>1 מ"ג</td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>פישר</td><td>O3196-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>חלב יבש מיידי ללא שומן</td><td>איכות ביולוגית</td><td>A614-1003</td><td>10 חבילות</td></tr><tr><td>Kinetic-QCL קינטי כורמוגני LAL מבחן</td><td>לונזה ווקרסוויל</td><td>50650U</td><td>192 ערכת בדיקה</td></tr><tr><td>LAL ריאגנט כיתה צלחות מרובות בארות</td><td>לונזה ווקרסוויל</td><td>25-340</td><td>1 צלחת</td></tr><tr><td>Magic Media E. coli ביטוי בינוני</td><td>ThermoFisher</td><td>K6803</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>MilliporeSigma Millex מזרק סטרילי 0.22 מ"מ מסננים</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td>250 חבילות</td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי IgG Fc-AP</td><td>Southern Biotech</td><td>9040-04 &nbsp;</td><td>1.0 מ"ל</td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3) מוכשר כימית E. coli</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>C601003 20 בקבוקונים</td></tr><tr><td>דיוק פלוס חלבון לא מוכתם תקני חלבון, רקומביננט מתויג Strep,</td> <td>BioRad</td><td>1610363</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>קלטות דיאליזה Slide-A-Lyzer, 10K MWCO, 12 מ"ל</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td>8 חבילות</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>BP358-212</td><td>2.5 ק"ג</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונוביסיק</td><td>פישר</td><td>BP329-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>טריס בסיס</td><td>פישר</td><td>BP152-1</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>טריס-(2-קרבוקסיאתיל) פוספין הידרוכלוריד</td><td>ביוסינת' אינטרנשיונל</td><td>C-1818</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>אורניל אצטט, ריאגנט, שירותי</td><td>מיקוסקופיה אלקטרונית</td> AC <td>541-09-3</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>פישר</td><td>BP169-500</td><td>2.5 ק"ג</td></tr><tr><td>נייר סינון איכותי</td><td>Whatman סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>WHA10010155 חבילה של 500</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>&nbsp; ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChromLab תוכנה ver 4</td><td>BioRad</td><td>12009390</td><td>תוכנה</td></tr><tr><td>עידן 2 ספקטרופוטומטר Microplate</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2</td><td>קורא צלחות</td></tr><tr><td>Fiberlite F14-14 x 50cy רוטור זווית קבועה</td><td>ThermoFisher</td><td>096-145075</td><td>רוטור</td></tr><tr><td>ג'ל Doc EZ ג'ל מערכת תיעוד</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>ג'ל Imager עבור ג'לים ללא כתמים</td></tr><tr><td>JEOL TEM</td><td>JEOL</td><td>1400</td><td>שידור אלקטרונים מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra אנכי אלקטרופורזה תא עבור מיני ג'לים טרומיים</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td>להפעלת ג'לים</td></tr><tr><td>NanoDrop אחד מיקרונפח UV-Vis ספקטרופוטומטר</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>לריכוז חלבון</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern חלקיק אנליטי</td><td></td><td> גודל</td></tr><tr><td>NanoSight NTA תוכנה NTA</td> Malvern גודל <td>חלקיקים</td><td>אנליטי</td><td></td></tr><tr><td>ניו ברונסוויק Innova 44/44R</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0000</td><td>אינקובטור / שייקר</td></tr><tr><td>NGC Quest 10 מערכת כרומטוגרפיה</td><td>BioRad</td><td>7880001</td><td>FPLC כדי לסייע בטיהור חלבונים</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow זוהר מערכת ניקוי פריקת</td><td>טד פלה, INC</td><td>91000S</td><td>לניקוי רשתות</td></tr><tr><td>ספק כוח אוניברסלי</td><td>PowerPac BioRad</td><td>1645070</td><td>להפעלת ג'לים</td></tr><tr><td>Rocker Shaker</td><td>Daigger</td><td>EF5536A</td><td>For Western</td></tr><tr><td>Sonifer 450</td><td>Branson</td><td>הידוע גם בשם 096-145075&nbsp;</td><td>סוניקטור</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Superspeed צנטריפוגה</td><td>ThermoFisher</td><td>75-006-580</td><td>צנטריפוגה</td></tr><tr><td>טרנס-כתם טורבו מיני ניטרוצלולוזה חבילות העברת</td><td>BioRad</td><td>1704158</td><td>עבור מערכת</td></tr><tr><td>העברת טורבו טרנס-כתם</td> מערבית <td>BioRad</td><td>1704150</td><td>עבור</td></tr><tr><td>מערבולת-ג'יני 2</td><td>דייגר</td><td>EF3030A</td><td>מערבולת</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>Panalytical Particle Size</td></tr><tr><td>תוכנה Zetasizer</td><td>Malvern Panalytical Panalytical</td><td></td><td>Particle Sizing</td></tr></tbody></table>

ייצור של e. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים trimeric אפירופה מצגת

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

הרכבת עצמית חלקיקים חלבון (סאפאן) פונקציה כמו אנטיגן חוזרים מציג ניתן להשתמש כדי לפתח מגוון רחב של חיסונים עבור מחלות זיהומיות שונות. במאמר זה אנו מדגימים שיטה לייצר ליבה SAPN המכיל צרור שישה סליל (SHB) הרכבה כי הוא מסוגל להציג אנטיגנים trimeric conformation יווצרות. אנו מתארים את הביטוי של SHB-SAPN במערכת E. coli , כמו גם את הצורך לטיהור החלבון שלבים. . כדי להפחית את שרידי הלייפוסכפה החיידקי כאינדיקציה לזהות החלבון והטוהר, החלבון הגיב עם נוגדנים חד-שבטיים ידועים בניתוחי כתמי אבן מערביים. לאחר קיפול מחדש, גודל החלקיקים נפל בטווח הצפוי (20 עד 100 ננומטר), אשר אושר על ידי פיזור אור דינמי, ניתוח מעקב ננו-חלקיק, ומיקרוסקופ אלקטרון שידור. המתודולוגיה המתוארת כאן היא אופטימיזציה עבור SHB-SAPN, עם זאת, עם שינויים קלים בלבד זה יכול להיות מוחל על מבנים SAPN אחרים. שיטה זו גם ניתן להעברה בקלות לייצור בקנה מידה גדול עבור ייצור GMP עבור חיסונים אנושיים.

התאספו במלואו SHB-SAPN המוצג כאן הוא בנוי על רצפי חלבון (איור 1A) כי הם ניבאו לקפל לתוך חלקיק המכיל 60 עותקים של המונומר (איור 1a). איור 2 מספק חלוקה לרמות של השיטה לייצור, טיהור וזיהוי של הליבה shb-sapn. E. coli מתוך מלאי גליצרול שהכיל וקטור ביטוי Ppep-T עם רצף גנים של הליבה shb-sapn המושרה ב BL21 (DE3) E. coli. התאים החיידקיים גדלו בהצלחה והיו תחת הרפתקאות והפחתת תנאים.
סה כ תא ליפוסט היה שימש כדי לטהר shb-סאקpn ונומרים על ידי fplc באמצעות Ni2 + עמודה (איור 3a). ה-FPLC chromatograph ממחיש כי החלבון משתמט הן ב-150 mM ו 500 מילימטר מהסרפידול (איור 3A). כרומוטוגרמה מראה גם שתי פסגות אחרות ב 185 mL ו 210 mL הנפח הכולל המתאים לשטוף את האיזופנול ואת שטיפת הסראזול, בהתאמה. השברים וטוהר החלבון הרקומביננטי זוהו על ידי SDS מעבר הצבע-ג'לים עמוד (איור 3B). חלבון הריבית ממוקם בעיקר בשברים 68 \ u201279 (278 \ u2012300 mL נפח כולל). שברים אלה שולבו עבור ניתוחים נוספים. כתם מערבי עם נוגדן אנטי שלו (N-מסוף) ו 167-D-IV נוגדן (C-טרמינוס) ציין כי שברים במאגר היו אכן חלבון הריבית (איור 4A, B). הכלים אלה הפגינו גם נוכחות של shb-sapn מלוטיימרים. שטיפות מוקדם יותר שברים להתחמק נטו להכיל ריכוז גבוה יותר של חלבון multimerized ולכן נשלל.
הדגימות שהכילו מונמרים חלבון של עניין היו מקופלים ל SHB-SAPN התאספו במלואו על ידי דיאליזה. התפלגות גודל החלקיקים נקבע על ידי DLS וניתוח מעקב ננו-חלקיק (איור 5a, B). DLS מזוהה חלקיקים עם קוטר Z ממוצע הידרודינמי של 67 ננומטר בעוד מערכת נ. ת. ע נמדד בגודל ממוצע של 81 ננומטר. ההבדלים גודל קל היו בשל טכניקות שינוי החלקיקים, אולם הגודל משני הניתוחים היו בטווח הצפוי של 20 \ u2012100 nm8,24,25. SHB-סאפאן היו דמיינו על ידי TEM ואת התמונות הראו חלקיקים בודדים בנוי היטב עם התפלגות גודל שהתקבלו שתי טכניקות שינוי החלקיקים (איור 5C).
במהלך הטיהור של החלבון, העמודה נשטפה עם איזופנול כדי להקטין את זיהום LPS במוצר הסופי SHB-SAPN. כדי לוודא אם רמת האנדוטוקסין הייתה מקובלת על החיסון, ריכוז LPS בדגימות SHB-SAPN מטוהרים עם או בלי הצעד האיזופנול של שטיפת האלכוהול נקבע על ידי שיטת לל קינטית. התוצאות הראו כי השטיפה האיזופנול הצטמצמה את רמות האנדוטוקסין מ&gt; 0.25 האיחוד האירופי/μg כדי 0.010 האיחוד האירופי/μg של SHB-SAPN חלבון (שולחן 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg"> איור 1: רצף החלבון SHB-SAPN ומבנה. (א) ברצף חומצת האמינו של מונמר SHB-sapn. (ב) מודל המחשב של המבנה של הליבה shb-sapn התאספו במלואו המורכב של 60 monomers חלבון. ערכת צבע עבור רצפי חומצות אמינו: אפור = הצבי; ירוק = פנטמר; כחול כהה = דה נובו תוכנן trimer; כחול בהיר = צרור שישה סליל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg"> איור 2: תרשים זרימה של ה פרוטוקול לייצור SHB-SAPN. ערכת צבעים: שחור = ביטוי של מונומר חלבון ב E. coli; אפור כהה = טיהור מונומר; אפור בינוני = מזהה מונומר; אפור בהיר = קיפול מחדש ואפיון; לבן = התאספו במלואו מוצר SHB-SAPN. בשלבים המסומנים באפור כהה ובינוני, החלבון הוא תחת הרפתקאות והפחתת תנאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg"> איור 3: טיהור חלבון של SHB-המונמרים. (A) chromatograph מתוך טיהור fplc. הקו הירוק מעל כרומאטוגרם מציין את שלבי הטיהור. הקו הכחול ב chromatogram מייצג את הצפיפות האופטית של השברים ב 280 ננומטר גל. הקו השחור מראה איזה אחוז של מאגר B (8 M אוריאה, 20 מ"מ Tris, 50 mM נתרן פוספט מונוbasic, 5 מ"מ TCEP, 500 מ"מ הסרפידול, pH 8.5) ששימש בכל שלב של הטיהור. (ב) sds-דפי העמוד של שברים ממאגר מן הליפוסט (L), זרימה דרך (FT), שטיפת הראשון (W1), שטיפת אלכוהול איזופנול (W2), שטיפת שלישי (W3), ושברים בודדים מתוך הסרפירון 150 מ"מ (E150) ו 500 מילימטר (E500) שלבים של טיהור. סמנים מולקולריים בנתיב הראשון (M) מזהים להקות בין 10 ל-250 kDa. חלבון היעד מצוין על-ידי חץ שחור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg"> איור 4: זיהוי החלבון באבן החשופה המערבית. כל המסלולים עמוסים 100 ng של חלבון. (א) תוצאות של כתם מערבי עם הצבי האנטי-6x. (ב) תוצאות של אבן חשופה מערבית עם נוגדן 167-D-IV HIV-1. הנתיבים מסומנים כ-M = סמן משקל מולקולרי; 1 = ליפוסט; 2 = לזרום; 3 = השטיפה הראשונה; 4 = שטיפת איזופנול (כביסה שנייה); 5 = כביסה שלישית; 6 = שברים אמצעי אחסון במאגר 56 \ u201261 (הראשון בשיא הראש), 7 = פלגים נפח במאגר 62 \ u201267 (בין שתי הפסגות), 8 = שברי נפח במאגר 68 \ u201278 (השיא השני הימנעות). חלבון היעד עם גודל הלהקה צפוי של 18.07 kDa כמו monomeric SHB-SAPN להקה מצוין על ידי חץ שחור. פסים נוספים בנתיבים 7 ו 8 הם dimers טרימרס, ו שעוני של SHB-SAPN (החץ האדום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg"> איור 5: אפיון ה-SHB-SAPN המקופל. (א). התפלגות גודל החלקיקים כפי שנקבע על ידי DLS. (ב) גודל החלקיקים כפי שנקבע על ידי ננו-חלקיק מעקב (מערכת). (ג) ויזואליזציה של חלקיקי SHB-sapn על ידי TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>דוגמה</td>
			<td>אנדוטוקסין (האיחוד האירופי/mL)</td>
			<td>אנדוטוקסין (האיחוד האירופי/μg של חלבון)</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN עם שטיפת אלכוהול איזופרופיל</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAPN ללא שטיפת אלכוהול איזופרופיל</td>
			<td>&gt; 50</td>
			<td>&gt; 0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>בקרה שלילית</td>
			<td>להלן רמת זיהוי</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1: רמות אנדוטוקסין של SHB-סאפאנס מחדש. רמות אנדוטוקסין בדגימות SHB-SAPN מטוהרים עם או בלי שטיפת איזופנול הציג הן כיחידות אנדוטוקסין/mL ויחידות אנדוטוקסין/μg של חלבון SHB-SAPN.

שיטה מפורטת מסופקת כאן ומתארת את הטיהור, הקיפול והאפיון של חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית (סאפאנס) לשימוש בפיתוח החיסונים.

ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית, או SAPNs, יכולים לשמש לפיתוח חיסונים נגד מחלות זיהומיות שונות. שיטה זו שאנו מתארים כאן יכולה לשמש לטיהור, לתיקון מחדש ולאפיון של SAPNs המכילים צרור שישה סלילים. חלקיק זה יכול להציג אנטיגנים טריקריים קונפורמציה דמוית יליד.עם שינויים קלים, ניתן ליישם שיטה זו על מבנים חדשניים אחרים של חיסון SAPN. יתר על כן, זה יכול להיות מועבר בקלות לייצור בקנה מידה גדול עבור ניסויים קליניים. עבור תזה של E.coli שנקטפו המבטאים את SAPN צרור שישה סליל, להשתמש בבדיקה עם תפוקת sonication של 150 וואט עם ארבע שניות של sonication ושש שניות של מנוחה, כדי sonicate כדורי חיידקים לשימוש חוזר ב 40 מיליליטר של חיץ imidazole חינם על הקרח במשך חמש דקות.צנטריפוגה lysate הסלולר כדי ליצור על טבעי ברור ולהעביר את העל-טבעי לבקבוק סטרילי 150 מיליליטר. לאחר מכן, להביא את המדגם עד נפח סופי של 100 מיליליטר עם חיץ טרי imidazole חינם. כדי לבודד את החלבון המעניין, פתח את תוכנת FPLC ולחץ על האפשרות שיטה חדשה.בתפריט הגדרות שיטה, פתח את התפריט הנפתח מיקום עמודה ובחר C1 יציאה 3. בתפריט הנפתח 'מוצג לפי טכניקה', בחרו 'אהדה'. בתפריט הנפתח סוג עמודה, בחר אחרים, HisTrap HP וחמישה מיליליטר.אמצעי האחסון של העמודות והתיבות לחץ יוגדרו באופן אוטומטי לערכים המתאימים. לחץ על מיתאר שיטה וגרור את הלחצנים שיווי משקל ויישום לדוגמה, שלושה לחצנים לשטיפת עמודות ולחצן אלוטיון מהתפריט המוקפץ ספריית שלבים לצד החץ לפני סגירת התפריט ספריית שלבים. לחץ על שיווי משקל והגדר את הערכים המפורטים בטבלה למאגר התחלתי B, 4%מאגר סופי B, 4%ואמצעי אחסון של עמודות, חמישה.לחץ על יישום לדוגמה. בתיבה טעינה לדוגמה, לחץ על לחצן הפתק עבור הזרק דוגמה בעמודה עם משאבה לדוגמה, ואשר שהתיבה לצד השתמש בקצב זרימה מהגדרות פעולת השירות מסומנת בתיבה הזרקה לדוגמה עם משאבת מערכת. שנה את ערך תיבת אמצעי האחסון ל- 100 מיליליטר ואת ערכת איסוף השברים שיש להפוך לזמינה.לחץ על התיבה השתמש בגודל שבר מהגדרות פעולת שירות ושנה את גודל השבר לארבעה מיליליטר. לחץ על לחצן שטיפת העמודות הראשון, הגדר את הערכים המפורטים בטבלה למאגר התחלתי B, 4%Final Buffer B, 4%ונפח עמודה, 10. לחץ על התיבה הפוך ערכת אוסף שברים לזמינה ולחץ על הסר את הלחצן השתמש בגודל שבר מהגדרות פעולת השירות.שנה את גודל השבר לארבעה מיליליטר ולחץ על לחצן שטיפת העמודות השני. הגדר את הערכים בטבלה למאגר התחלתי B, 0%מאגר סופי B, 0%ואמצעי אחסון של עמודות, חמישה. לחץ על התיבה הפוך ערכת אוסף שברים לזמינה ולחץ על הסר את הלחצן השתמש בגודל שבר מהגדרות פעולת השירות.שנה את גודל השבר לארבעה מיליליטר ולחץ על לחצן שטיפת העמודות השלישי. הגדר את הערכים בטבלה למאגר התחלתי B, 0%מאגר סופי B, 0%ואמצעי אחסון של עמודות, 10. לחץ על לחצן הפוך ערכת אוסף שברים לזמינה ולחץ על התיבה השתמש בגודל שבר מהגדרות פעולת השירות.לאחר מכן, שנה את גודל השבר לארבעה מיליליטר. לחץ על לחצן אלוטיון ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על המידע בטבלה. בתפריט הנפתח, לחץ על מחק שלב וגרור את לחצן מעבר צבע Isocratic אל הטבלה פעמיים, כך שיהיו שני ערכים.הגדר את הערך עבור הערך הראשון למאגר התחלתי B, 30%מאגר סופי B, 30%ואמצעי אחסון של עמודות, 10. הגדר את הערך עבור הערך השני למאגר התחלתי B, 100%מאגר סופי B, 100%ואמצעי אחסון של עמודות, 10. לחץ על לחצן הפוך ערכת אוסף שברים לזמינה ולחץ על התיבה השתמש בגודל שבר מהגדרות פעולת השירות.לאחר מכן, לחץ על שמירה בשם ותן שם לטיהור הקובץ. מניחים את המשאבה צינורות של FPLC לתוך חיץ לשטוף ללא imidazole, ואת המשאבה B צינורות לתוך חיץ imidazole 500 מילימולאר. מניחים את צינורות משאבת הדגימה לדגימה של 100 מיליליטר והפעילו את תוכנית הטיהור.כאשר יש צורך לשטוף isopropanol 60%, להשהות את התוכנית, להעביר את המשאבה צינורות מן לשטוף imidazole חינם לתוך לשטוף 60%isopropanol, ולהפעיל מחדש את התוכנית. בסוף לשטוף, להשהות את התוכנית שוב, להחזיר את המשאבה צינורות A למאגר לשטוף imidazole חינם, ולהפעיל מחדש את תוכנית הטיהור. כדי להעריך את טוהר החלבון המטוהר, יש לשלב תחילה את שברי הזרימה דרך, לשטוף אחד, לשטוף שניים ולשטוף שלושה שלבים, בצינורות חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר.לאחר מכן, יש לערבב 15 מיקרוליטרים מכל צינור מדגם עם 15 מיקרוליטרים של חיץ לאמלי 2X בצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים של 0.5 מיליליטר ולנתק את הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בסוף הדגירה, הקימו מנגנון ריצה ג'ל עם שלושה ג'לים פוליאקרילמידים נטולי כתמים של ארבעה עד 20% במאגר ריצה של Tris-Glycine SDS-PAGE. טען שמונה מיקרוליטרים של סמן משקל מולקולרי ל הבאר הראשונה של כל ג'ל ו -30 מיקרוליטרים של דגימה denatured ל בארות האחרות.הפעל את הג'לים ב 200 וולט עד חזית הצבע פוגע בחלק התחתון של הג'ל בקצרה לשטוף את הג'לים עם מים deionized לפני הדמיה מיידית עם מערכת הדמיה ללא כתמים. לאחר מכן, זהה את השברים המכילים רצועות חלבון בגודל הנכון ובריכה שברים אלה. לחבילת שישה סלילים SAPN refolding, להוסיף 10 עד 20 מיליליטר של חלבון מאגר ל 10 קילודלטון משקל מולקולרי לחתוך קלטת דיאליזה.דיאליזה את הקלטת בשמונה אוריאה טוחה, טריס 20 מילימול, 5% גליצרול, וחמישה מילימולרים TCEP בטמפרטורת החדר לילה. למחרת בבוקר, להקטין את ריכוז אוריאה במאגר הדיאליזה צעד אחר צעד על ידי שתי טוחנות כל שעתיים כדי לדיאליזה איטית את אוריאה את המדגם. כאשר ריכוז אוריאה מגיע לשתי טוחנות, להעביר את מנגנון הדיאליזה לארבע מעלות צלזיוס ולהדיאליז את המדגם לתוך 120 מילימולר אוריאה, טריס 20 מילימולר, ו 5% גליצרול לילה כדי לסיים את refolding.למחרת בבוקר, להסיר את החלבון refolded מן הקלטת ולסנן את SAPN צרור שישה סליל באמצעות מסנן מזרק פלואוריד פוליווינילידין 0.22 מיקרומטר. כדי למדוד את גודל החלקיק הממוצע של SAPN צרור שישה סלילים, להוסיף 45 microliters של שישה סליל צרור SAPN כדי cuvette חד פעמי למקם את cuvette במכונת DLS. לאחר מכן, צרו קובץ מדידה חדש והפעילו הליך פעולה סטנדרטי כתוב מראש לחלבון ב-120 מילימולרים אוריאה, טריס 20 מילימולאר וחוצץ גליצרול של 5% ב-25 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, התחל את המדידה. הגודל הממוצע של Z, ה- PDI ותוצאות ההפצה יחושבו עבור כל הפעלה. המכונה תקרא את הדגימה חמש פעמים.חבילת שישה סלילים זו, שהורכבה במלואה, בנויה על רצפי חלבונים שצפויים להתקפל לחלקיק המכיל 60 עותקים של המונומר. סה"כ ליזאט התא שימש לטיהור מונומרים SAPN צרור שישה סלילים על ידי FPLC באמצעות עמודת ניקל, המוכיח כי החלבון אלוט הן 150 ו 500 מילימולרים imidazole. הכרומטוגרמה מציגה גם שתי פסגות אחרות בנפח כולל של 185 ו-210 מיליליטר המתאים לשטיפת האיזופרופנול ולשטיפה נטולת האימידזול בהתאמה.השברים ואת הטוהר של חלבון רקומביננטי יכול להיות מזוהה על ידי ג'לים SDS-PAGE הדרגתי עם חלבון העניין ממוקם בעיקר שבר 68 עד 79. ניתוח כתם מערבי עם נוגדנים נגד שלו ואנטי 167D4 הצביע על כך שהשברים המפולגים אכן היו החלבון המעניין. הכתמים גם הדגימו את נוכחותם של מולטימרים SAPN צרור שישה סלילים.הדגימות שהכילו את מונומרים החלבון של עניין היו מקופלים לתוך SAPN צרור שישה סלילים שהורכבה במלואו על ידי דיאליזה והפצה גודל חלקיקים נקבע על ידי DLS וניתוח מעקב חלקיקים. הדמיה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור חשף נוצר היטב בודדים שישה סליל צרור חלקיקי SAPN עם התפלגות גודל המתקבל שתי טכניקות גודל חלקיקים. השלב החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא תיפול מחדש של חבילת ששת המסוקים SAPN.ה- pH הנכון והעוצמה היונית של מאגר ההתפלה הם חיוניים. באמצעות לשטוף isopropanol במהלך טיהור, הצלחנו להפחית LPS מזהם לרמה נמוכה מאוד. עם זאת, ניתן להפחית את LPS עוד יותר באמצעות עמודת חילופי אניון לפי הצורך.טכנולוגיה זו יכולה להיות מותאמת בקלות ליישום אנושי. SAPN מבוטא בקטריאלי כבר קנה המידה לניסוי קליני בשלב הקרוב 1/2a מלריה.

production-e-coli-expressed-self-assembling-protein-nanoparticles-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת חיסונים רב-ערכיים נגד שלפוחית הממברנה החיצונית (OMV). תאי יונקים עוברים טרנספורמציה כדי לבטא ולהפריש אנטיגנים נגיפיים המאוחים ל-SpyTag ולתג פוליהיסטידין. אנטיגנים אלה מטוהרים לאחר מכן באמצעות עמודת זיקה של חומצה ניקל-ניטרילוטריאצטית (Ni-NTA). האנטיגן המטוהר מעורבב עם בועיות קרום חיצוניות המבטאות חלבון SpyCatcher (SC) הקשור למשטח. אנטיגנים מרובים נצמדים באופן קוולנטי ל- SpyCatchers באמצעות SpyTags שלהם (ST), ויוצרים OMVs המציגים את האנטיגן, ומשמשים כחיסון רב-ערכי.

יצירת חיסון רב-ערכי נגד שלפוחית הממברנה החיצונית

סרטון זה מדגים את הייצור של חיסונים נגד גידולי ננו-תחליב. מחסני מאגר הנפט היציבים הנושאים פפטידים ואדג'ובנטים סינתטיים מיוצרים על ידי ננו-תחליב באנרגיה נמוכה, מה שמציע הבטחה משמעותית לאימונותרפיה של גידולים.

הכנת חיסון אדג'ובנטי ננו-תחליב

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת מועמד לחיסון mRNA באמצעות ננו-חלקיקים פולימריים. הפולימר הקטיוני מקיים אינטראקציה עם mRNA טעון שלילית, ויוצר פוליפלקסים. היווצרות פוליפלקסים מייצבת את ה-mRNA, מה שהופך אותו למועמד פוטנציאלי לחיסוני mRNA עתידיים ביישומים אימונותרפיים.

ניסוח ננו-חלקיקים טעוני mRNA למטרות חיסון

סרטון זה מציג את הטיהור של ננו-חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית או SAPN המתויגים בהיסטידין באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית של זיקה. שברי SAPN מטוהרים המתקבלים מתאימים לפיתוח חיסונים, וטומנים בחובם הבטחה ליישומים אימונותרפיים פוטנציאליים.

טיהור ננו-חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינתזה חלקיקים דמויי וירוס באמצעות baculovirus או או מערכות ביטוי יונקים, וטיהור ultracentrifugation. גישה להתאמה אישית זה משמשת לזיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון בצורה בטוחה וגמישה.

ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

כאן, המחברים מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל להגדרת אפיטופ אנטיגני ליניארי באמצעות נוגדן חד שבטי מטוהר וסריקת פפטידים באמצעות הכלאה של כתמי נקודות. לאחר מכן ניתן להשתמש באפיטופ שזוהה ביישומים טיפוליים ואבחנתיים.

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

הרחבת קוד גנטי מוחלת על הקדמה של חומצת אמינו לא טבעית הנושאת קבוצה פונקציונלית ביורטוגונלית על חלבון נשא באתר מוגדר. הפונקציה biorthogonal משמש עוד יותר עבור צימוד סלקטיבי האתר של אנטיגן פחמימות כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'וגייט הומוגני.

גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון

כאן, פרוטוקול פשוט מוצג לייצור חלקיקי mRNA המבוססים על פולי (בטא אמינואסטר) פולימרים, קל להתאמה על ידי שינוי mRNA אנקפסולציה. זרימת העבודה לסינתזה של הפולימרים, הננו-חלקיקים והאפיון החיוני שלהם מתוארים גם הם. כמו כן מתווספת הוכחת תפיסה בנוגע לחיסון.

סינתזה ואפיון של חלקיקי פולי (בטא אמינואסטרים) טעונים mRNA למטרות חיסון

פרוטוקול זה מתאר שימוש בערכות ביטוי מסחריות של חלבונים נטולי תאים כדי לייצר חלבוני ממברנה הנתמכים בננו-דיסק שיכולים לשמש כאנטיגנים בחיסונים תת-יחידתיים.

ייצור בקנה מידה ללא תאים ותוספת אדג'ובנטית לחלבון קרום חיצוני עיקרי רקומביננטי מכלמידיה מורידרום לפיתוח חיסונים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הביו-הנדסה של שלפוחיות הממברנה החיצונית כפלטפורמת חיסון "Plug-and-Display", כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.

פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2

כאן, אנו מציגים שיטות מפורטות להכנה והערכה של החיסון לגידול ננו-תחליב בהרכבה עצמית באף במבחנה  ו-in vivo.

הכנה, מאפיינים, רעילות והערכת יעילות של החיסון לגידול ננו-תחליב באף בהרכבה עצמית במבחנה וב-Vivo

למד שיטה לטיהור, קיפול מחדש ואפיון ננו-חלקיקי חלבון המתאספים עצמית (SAPNs) לפיתוח חיסונים. הטכניקה מציגה אנטיגנים טרימריים בקונפורמציה טבעית וניתנת להתאמה לייצור בקנה מידה גדול.

ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

גלה סרטונים נוספים