אימונוגלובולין G N-גליקן ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית במיוחד

אימונוגלובולין G (IgG) N-גליקן מאופיין באמצעות כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופילית. בנוסף, המבנה של IgG N-גליקן מופרד בבירור. המוצג כאן הוא מבוא לשיטה ניסיונית זו, כך שניתן להשתמש בה באופן נרחב בהגדרות מחקר.

כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים הוקמה טכנולוגיה לניתוח מדויק של IgG n-glycan בשל הרגישות שלה נראה ויש לו את היכולת לספק מידע ספציפי של גליצן שיטה זו היא קלה לשימוש ויש לו מספר שונים עלות נמוכה יחסית של במרווחים, רבייה גבוהה היכולת isomers גליצן. המדידות של חלבון בפלזמה יכול להיות אטרקטיבי. ברפואה.

קשור גם עם IgG בבסיס גליקוז כזה ביולוגי המכיל את האוכלוסייה. אתה יודע של מצב טמא משמש לבדיקת IgG בגליקנים. למעשה, זה יכול לבדוק n-גלייקנים של חלבון.

זה נחוץ בחלבון חוצה גבולות של שני מצבים טהורים ניתן להחיל על חלבון תהליך הניסוי OR הוא פשוט יחסית בעוד התהליך הניסיוני צריך להיות סטנדרטי. תהליך הניסוי מקצה לקצה אורך שלושה ימים, ויש לשנן את הצעדים הניסיוניים כדי לשלוט במיומנויות הניסוי. כדי להכין את הדגימות, להפשיר את דגימת הפלזמה הקפואה.

ואז, צנטריפוגה ב 80 פעמים G במשך 10 דקות. השאירו את צלחת החלבון G מונוליטית בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. מעבירים 100 מיקרומטרים של דגימה לכל באר של צלחת האיסוף של שני מיליליטר.

הוסף מים טהורים במיוחד כדגימה אחת לבקרה. לדלל את הדגימות עם X PBS אחד על ידי אחד עד שבעה נפח לפי יחס נפח. נקה צלחת מסנן פוליפרופילן הידרופילית 0.45 מיקרון עם 200 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד.

חזור על הניקוי פעמיים נוספות. מעבירים את הדגימות המדוללים לתוך לוחית המסנן, ומסננים את הדגימות לתוך הצלחת הקולקטיבית באמצעות משאבת ואקום בלחץ של 266.6 עד 399.9 פסקל. כדי להכין את החלבון G צלחות מונוליטיות, תחילה להשליך את מאגר האחסון.

נקה את הלוחות המונוליתיים עם שני מיליליטר של מים טהורים במיוחד, שני מיליליטר של X PBS אחד, מיליליטר אחד של חומצה פורמית טוחנת 0.17, שני מיליליטר של 10 X PBS, ושני מיליליטר של X PBS אחד ברצף. הסר את הנוזל הבא באמצעות משאבת ואקום. בעזרת צינור רב-ערוצי, מעבירים את הדגימות המסוננים לצלחת המונוליטית G של החלבון לצורך כריכה וניקוי של IgG.

לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של X PBS אחד כדי לנקות את הלוחות מונוליטיים. הסר את ה- PBS באמצעות משאבת ואקום, וחזור על הניקוי פעמיים נוספות. Illute IgG עם מיליליטר אחד של חומצה פורמית טוחנת 0.17, ולסנן את הדגימות לתוך צלחת האיסוף על ידי משאבת ואקום.

לאחר מכן, מוסיפים 170 מיקרוליטרים של אמוניום ביקרבונט טוחן אחד לתוך צלחת האיסוף. זהה את ריכוז IgG באמצעות ספקטרופטומטר ספיגה באורך הגל האופטימלי של 280 ננומטר. מניחים את IgG המופק בתנור להתייבש ב 60 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות.

לקבוע את הכמות שיש לראות על פי הריכוז שלה כמתואר בכתב היד, ולשמר אותו מינוס 80 מעלות צלזיוס. אסוף את ה- IgG המיובש ואחסן כימיקלים כולל 1.33% SDS, ארבעה אחוזים IgePal ו- 5% PBS בטמפרטורת החדר. הכן אנזים אינדוליקוזה F על ידי דילול 250 יחידות של אנזים עם 250 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד.

כדי להפוך את IgG, להוסיף 30 microliters של 1.33% SDS ומערבבים על ידי מערבולת. מעבירים את הדגימה לתנור של 65 מעלות למשך 10 דקות. לאחר מכן, להסיר אותו מהתנור, ולתת לו להתקרר במשך 15 דקות.

הוסיפו 10 מיקרוליטרים של ארבעה אחוזים של IgePal לאותה דגימה, והצבו אותה על חממה רועדת במשך חמש דקות. הוסף 20 מיקרוליטרים של חמישה X PBS ו 30 עד 35 microliters של 0.1 נתרן הידרוקסיד טוחן לווסת את ה- pH ל 8.0, ומערבבים על ידי מערבולת. מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של אנזים אנדוליקוסידאז F, ומערבבים על ידי מערבולת.

לאחר מכן, דגירה במשך 18 עד 20 שעות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. למחרת, מניחים את gylcans שוחרר בתנור ב 60 מעלות צלזיוס להתייבש במשך שעתיים וחצי עד שלוש שעות. שמור את הגליקנים לשחרר במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מדידה נוספת.

הכן את שני אמינו בנזימיד תיוג reagent עם 24.5 microliters של DMSO, 10.5 microliters של חומצה אצטית, 0.7 מיליגרם של שני אמינו בנזימיד, ושישה מיליגרם של נתרן ציאנובורוהידריד. לאחר מכן, בחדר חשוך, תייג את הגליקנים על ידי הוספת 35 מיקרוליטרים של שני אמינו בנזימיד תיוג reagent. מעבירים את הגלקאנים המסווים לתנוד לחמש דקות, ואז מעבירים אותו לתנור לשלוש שעות ב-65 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, להעביר אותו לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. IgG n-גליקאז, אנו לתייג אותו עם על מנת להיות מזוהה על ידי גילוי פלואורסצנטי של מצב טמא. יש להצטייד בצלחת מסנן GHP של 0.2 מיקרון עם 200 מיקרוליטרים של 70% אתנול, 200 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד ו-200 מיקרוליטרים של 96% אצטו ניטריל בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, להסיר את הפסולת באמצעות משאבת ואקום. כדי לטהר את שני אמינו בנזימיד שכותרתו גליקנים, להוסיף 700 microliters של 100% אצטוניטריל לדגימה, ולהעביר אותו אינקובטור רועד במשך חמש דקות. צנטריפוגה ב 134 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

מעבירים את העל-טבעי לצלחת מסנן GHP של 0.2 מיקרון למשך שתי דקות, ומסירים את הסינון באמצעות הוואקום. לשטוף את שני אמינו בנזימיד שכותרתו גליקן עם 200 microliters של 96% אצטוניטריל בארבע מעלות צלזיוס, ולהסיר את הסינון באמצעות משאבת ואקום חמש עד שש פעמים. Illute שני אמינו בנזימיד שכותרתו גליצן עם 100 microliters של מים טהורים במיוחד שלוש פעמים.

מעבירים את שני אמינו בנזימיד שכותרתו גליצן לתנור להתייבש ב 60 מעלות צלזיוס במשך שלוש וחצי שעות. שמור את n-glycans שכותרתו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מדידה נוספת. ראשית, פתח את התוכנה כדי לשלוט בשלבים הניידים.

לשטוף מכשירי UPLC עם 50% ממס B ו 50% ממס C בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף עם 25% ממס A ו 75% ממס B בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר לדקה במשך 20 דקות. לאחר מכן, להוסיף קצב זרימה של 0.4 מיליליטר לדקה.

ממיסים את ה-n-glycans המסומנים ב-25 מיקרוליטרים של תערובת של 100% אצטוניטריל ומים טהורים במיוחד ביחס נפח של שניים לאחד. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 134 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולהשתמש בצינור יבש לטעון 10 microliters של supernatent לתוך מכשירי UPLC. הפרד את ה-n-glycans המסומנים בקצב זרימה של 0.4 מיליליטר לדקה עם שיפוע ליניארי של 75%-62% אצטוניטריל למשך 25 דקות.

לאחר מכן, לבצע ניתוח המנוהל על ידי דקסטרן כיול סולם גליקופפטיד עמוד על UPLC ב 60 מעלות צלזיוס. זהה פלואורסצנטיות n-glycan ב X צל"ש אורכי גל פליטה של 330 ננומטר ו 420 ננומטר, בהתאמה. כפי שמוצג בנתון זה, IgG n-glycans נותחו לתוך 24 פסגות IgG גליצן ראשוניות המבוססות על מיקום שיא וזמן שמירה.

המבנים n-glycan זמינים ב 24 סוגים באמצעות גילוי ספקטרומטריית מסה. כדי לתחת את החוזרות והיציבות של השיטה, המדגם הסטנדרטי נבדק במקביל שש פעמים. פסגות הגליקן עם פרופורציות קטנות יחסית הראו שגיאות מדידה גבוהות של יותר מ -10% מקדם הווריאציה.

ביצירה וחשוב להרכיב מבנה IgG n-glycan, במיוחד להקמת מסוף לכן, במקום 3.3 IgG n-glycase נמצא הוא קריטי זה החשיבות של IgG. גליקנים מ ידועים להיות שונים. עם ההתפתחויות פרוטוטומיה גליקן, בשילוב גליקנים כדי לחקור מידע זה כך שזה יכול לשמש כפוטנציאל לאבחון של היום.

לאחר פיתוח טכניקה זו, הוא מספק דרך חדשה לחקור את