אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

שיטות המבוססות על מיקרוסקופיה של כוח אטומי מאפשרות לאפיין תהליכים ביומולקולריים בסולם הננו ברזולוציה כימית או מבנית מורפולוגית, ולבסוף לפתוח חלון קדמי חדש של התבוננות בביולוגיה. שיטות מולקולה אחת מאפשרות בדיקה של מערכות הטרוגניות מאוד, תכונה שרלוונטית במיוחד להבנת צבירת חלבונים. על ידי שילוב מולקולות בודדות עם גישות גב, אנו יכולים להשיג מידע בסיסי על התנהגות של חלבונים, הקשרים שלהם עם מחלה אנושית ועיצוב התערבויות פרמקולוגיות אשר יכול להצליח.

יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת בהצלחה כדי ללמוד את המאפיינים הכימיים והמבניים של ביו-חומרים לאספקת תרופות, יישומים ומטרות ביוטכנולוגיות אחרות. ייתכן שבתחילה יהיה מאתגר להגדיר את הפרמטרים הנכונים של AFM לרזולוציה גבוהה וקל להגדיר את ה-AFM תוך מדידת אגרגטים של פיבריל. 30 דקות לפני הדמיית AFM, להפעיל את מערכת AFM ולחץ על להגדיר ולחשו.

בחלון שינוי החללית, לחץ ליד כדי להכין שלב מיקוד Z. כבה את מתג קרן AFM אם הוא דולוק ופתח את מנעולי dovetail. נתק את הראש מהמערכת ובחלון שינוי החללית, לחץ על הבא.

הר את ה-AFM על מחזיק הגשוש. חבר את הראש למערכת ונעל את מנעולי dovetail. הפעל את מתג קרן הלייזר AFM ובחלון שינוי הבדיקה, לחץ על הבא.

בחלון המוקפץ, לחץ על לא אם סוג cantilever לא השתנה ולהתאים את ידיות יישור אופטי כדי למצוא את cantilever. התאם את המוקד ל- cantilever ולחץ על הבא. בחלון המוקפץ, לחץ על כן אם המוקד הוא על cantilever.

השתמש ידיות קרן לייזר זיהוי למקם את קרן הלייזר בסוף cantilever. השתמש בידיות קרן הלייזר שהוסטו כדי למקסם את האות הכולל שנמדד על ידי דיודת התמונה של ארבעת הרבעים לפחות ליותר מ וולט אחד. בחלון שינוי החללית, לחץ על הבא וסגור.

לאחר המתנה של 15 דקות עבור cantilever להגיע ליציבות תרמית, להסתגל מחדש את המיקום של קרן לייזר הוסטה על דיודה צילום רגיש המיקום במידת הצורך. לחץ על סריקת NCM, בחר את משרעת הרצויה של תנודות, לחץ על שלב השימוש ולחץ על אוטומטי. כוונן את cantilever קרוב למקסימום של תהודה חופשית הראשונה של תנודות כ 300 קילוהרץ עבור cantilever עם קבוע האביב של 40 ניוטון למטר.

מניחים את הדגימה על מחזיק הדגימה. לחץ על אזור הסריקה והגדר את הרזולוציה בין 256 על 256 ל- 1024 על 1024 פיקסלים ולאחר מכן הגדר את גודל הסריקה ואת מספר הפיקסל. הגדר את קצב הסריקה ל- 0.3 להרץ אחד עבור אזור סריקה של אחד עד חמישה על חמישה מיקרומטר בריבוע.

מקד את התצוגה האופטית על המדגם ולחץ על הגישה כדי להתקרב למשטח הדגימה. לאחר מכן, לחץ להרים 100 מיקרומטר כדי להעלות את קצה AFM 100 מיקרומטר מעל פני השטח של המדגם ולחץ להרחיב על התמונה האופטית של המדגם. לחץ על סרגל שלב המוקד כדי למקד את התצוגה על פני השטח של המדגם ולהשתמש בחצים כדי לנוע באזור המדגם של עניין.

לחץ על גישה כדי לעסוק במשטח ולחץ על סריקת קו כדי לבדוק אם הקצה עוקב היטב אחר פני השטח. כוונן את נקודת הסט לפי הצורך. לאחר מכן לחץ על סריקה כדי להתחיל בהדמיית פני השטח לדוגמה, תוך שמירה על משטר קבוע של שינוי פאזה שלא יעלה על דלתא 20 במהלך ההדמיה כדי למנוע כוח הדמיה גדול ולשמור על עקביות בין דגימות עצמאיות.

עבור הדמיית ננו-ספקטרוסקופיה של IR, 30 עד 60 דקות לפני הניתוח, הפעל את מערכת ה- AFM IR ואת לייזר ה- IR. פתח את התוכנה המובנית כדי לשלוט במכשיר ולחץ על קובץ וחדש כדי לפתוח קובץ ננו-IR חדש. לחץ על אתחל כדי להפעיל את מערכת AFM IR ולפתוח את מכסה המכשיר.

הר גשוש מצופה זהב סיליקון עם רדיוס נומינלי של 30 ננומטר וקבוע קפיץ של 0.2 ניוטון למטר על מערכת AFM IR כדי למדוד את המדגם במצב מגע. לחץ על טען במקטע בדיקה AFM ולאחר מכן. השתמש בהתמקדות על חיצי בדיקה כדי למקד את המצלמה על cantilever ולהשתמש בקצה כדי לחצות את הכוונת כדי למקם את הכוונת בסוף cantilever.

סובבו את הידיות השולטות במיקום לייזר הגילוי כדי למקם את הלייזר בקצה הקנטילוור. סובב את ידיות הלייזר כדי לזהות ולהגדיל את הסכום הנמדד על-ידי דיודת התמונה של ארבעת הרבעים לערך הגדול משלושה וולט. סובב את ידית ההטיה כדי להתאים את הסטת ה-cantilever למינוס וולט אחד ולחץ על הבא.

ואז לסגור את הכיסוי של המכשיר. השתמש בהתמקדות בחצי בדיקה כדי למקד את המצלמה על המדגם ואת הקצה חצים על הכוונת כדי לנוע באזור העניין של המדגם. לחץ על הבא ועסוק.

בחלון המיקרוסקופ, בחר גובה עבור מורפולוגיה, משרעת 2 עבור ספיגת IR ותדירות PLL כדי למפות את הקצה כדי לדגום תהודה מגע. במקטע סריקת AFM, הגדר את הפרמטרים כפי שהוכח עבור דימות AFM ולחץ על סריקה כדי להשיג מפת מורפולוגיה. לאחר סיום מיפוי המורפולוגיה, בחלון המיקרוסקופ, לחץ על מפת הגובה כדי למקם את הגשוש בראש צבירה אחת.

במקטע ננו IR, לחץ על הפעל IR כדי להאיר את הדגימה באמצעות לייזר IR. כדי למקד את לייזר אינפרא אדום על cantilever, לחץ על לייעל ולהזן 1655 ס"מ עבור wavenumber. לחץ על הוספה וסריקה כדי לקבוע את מיקום הלייזר של IR ולחץ על עדכן וסדר כדי ליישר את מיקומו עם cantilever.

במקטע הכללי, הזן מספר גל שעבורו צפויה ספיגה גבוהה בשדה היחסי והשבית את אפשרות מסנן מעבר הרצועה. לחץ על הפעל IR ולאחר מכן בדוק את קריאת המונה ואת ה- FFT של התגובה cantilever. בחלון FFT, הזז את הסמן הירוק כדי לקרוא את תדירות תהודה של cantilever.

ערך אופייני של FFT של תהודה של cantilevers הוא סביב 200 קילוהרץ. הזן את ערך תדירות תהודה שנוצר במקטע הכללי בשדה מרכז התדרים ולהשתמש בחלון תדר של 50 קילוהרץ. לחץ על חלון כוונון פעימת לייזר כדי לבחור את מצב תהודה משופרת ולהגדיר קצב דופק של 222 קילוהרץ, טווח כוונון של 50 קילוהרץ ומחזור חובה לייזר של 5%לחץ לרכוש כדי לטאטא את קצב הדופק של הלייזר.

השתמש בסמן כדי לכוון את פעימת הלייזר לתדר התגובה המכנית של ההתפשטות התרמית של המדגם סופג את אור IR. לאחר מכן בחר לולאה נעולה שלב כדי לפקח על תהודה איש הקשר בין המדגם לבין הקצה ולחץ על אפס. עבור תכונות כימיות אחרות בסולם הננו, עקוב אחר תהודה מגע במהלך רכישת ספקטרום כדי להבטיח כי ספקטרום המדגם אינו מושפע התחממות יתר וריכוך.

בחר באפשרות אפשר לעקוב אחר הדוגמה כדי לתת טיפ לתהודה ליצירת קשר ובחר רווח אינטגרלי של 0.5 ו רווח פרופורציונלי של 10 ולאחר מכן לחץ על אישור. בחלון האופטימיזציה, לחץ על אורך הגל וסריקה כדי לאתר את לייזר IR לפחות שלושה גלים המתאימים רצועות ספיגה גדולות של המדגם עבור מספר גל אחד לפחות עבור כל שבב של הלייזר. לחץ על כלים, כיול רקע IR וחדש, והגדר את מספר הגלים בין 1200 ל- 1800 ס"מ. הגדר את הרקע לממוצע לאחד, מחזור העבודה של 5% ומהירות הסריקה ל- 100 ס"מ בריבוע.

לחץ על רכוש כדי למדוד את רקע הלייזר של IR לנורמליזציה של הספקטרום הננו-סולם שנמדד, שמור את הקובץ וסגור את החלון. בהגדרות ספקטרום IR, בחר רזולוציית ספקטרום IR בין ס"מ אחד לארבעה סנטימטרים ומספר ממוצעים חיים של 64 פעמים לפחות. לאחר מכן לחץ על לרכוש כדי למדוד ספקטרום IR מקומי בקנה מידה ננו בטווח החלבון.

כדי להשיג מפה כימית שנפתרה בקנה מידה ננו, בחר 1655 ס"מ והדמיית IR ולחץ על סריקה בחלון סריקת AFM. לאחר השלמת המיפוי, שמור את המידות. לאחר מכן השתמש בתוכנה המובנית לעיבוד תמונה AFM כדי לנתח את המפות הנרכשות של מורפולוגיה, תהודה מגע וכימיה וספקטרום מקומי בקנה מידה ננו.

זהו צעד קריטי כדי להשיג פתרון מונומרי טהור מאוד כמו נוכחות של מינים מצטברים עלול לגרום לשחזור לקוי של קינטיקה ולהציג חפצים במדידות שלך. גורם בסיסי לחקר מוצלח של דגימות ביולוגיות שיש להן הטרוגניות גבוהה הוא המיקום הנכון של מצעים מוצקים. תצהיר תרסיס microfluidic ניתן לנצל במקום ידני אחד על מנת לשמר את ארכיטקטורת מדגם הטרוגניות.

שיטות אלה סוללות את הדרך לפענוח המבנה הכימי והמאפיינים של ביומולקולות בודדות והאינטראקציות שלהן בסביבה פיזיולוגית ונוזאלית מקומית.