הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

שיטה זו מסייעת להתגבר על מגבלות בחקר ההתפתחות ההמוטופיטית האנושית על ידי מתן פלטפורמת במבחנה פשוטה ומתוחה המבוססת על תכנות מחדש של תאים ישירים. הדגמה חזותית של שיטה זו תספק הדרכה אידיאלית בצעדים בסיסיים כדי ליצור תאים hemogenic אנושי כלומר במהלך ייצור lentiviral, ההעתקה fibroblast ותרבות התא. על ידי המרת פיברובלסטים בעור למבשרי המוגנית, אנו מקווים ליצור תאי גזע ומאגניים ספציפיים למטופל במספרים מספיקים להשתלת תאי גזע.

התחל על ידי גידול תאי HEK293T בצלחת רקמות 100 מילימטר מטופל עם 10 מיליליטר של DMEM מלא ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עד confluency. ביום שלפני ההטמנה, לאחר שאיפה של המדיום, לשטוף את המנה בזהירות עם חמישה מיליליטר של PBS ולנתק את התאים עם 1.5 מיליליטר של פתרון דיסוציאציה. לאחר הדגירה במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להשבית את הפתרון עם שלושה מיליליטר של DMEM מלא ולהעביר את ההשעיה התא צינור חרוט 15 מיליליטר.

לשטוף את המנה עם 5 מיליליטר של DMEM מלא כדי להסיר את כל התאים המצורפים הנותרים ולמשוך את הכביסה עם פתרון התא. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, לשאוף את supernatant ולתלות את גלולה בשישה מיליליטר של DMEM מלא. לאחר מכן, לפצל את ההשעיה באופן שווה בין שישה 100 מילימטר רקמת רקמות טופלו מנות בנפח סופי של 10 מיליליטר של DMEM מלא לכל מנה.

למחרת, להוסיף 10 מיקרוגרם המסה הכוללת של שלוש פלסמידים העברה יחד לצינור חרוט חדש 15 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 10 מיקרוגרם של הדור השני של וקטור אריזה psPAX2 קידוד איסור פרסום, pol, tat וגנים rev ואחריו תוספת של חמישה מיקרוגרם של pMD2. וקטור מעטפת G קידוד הגן VSV-G לצינור.

לבסוף, להוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי ל 500 microliters. בשני צינורות חרוטיים חדשים של 15 מיליליטר, הוסיפו 10 מיקרוגרם של פלסמיד FUW-M2rtTA, 10 מיקרוגרם של וקטור האריזה, וחמישה מיקרוגרם של וקטור המעטפה לכל צינור. לאחר מכן, להוסיף מים עד נפח סופי של 500 microliters לכל צינור.

לאחר מכן, להוסיף 62.5 microliters של שני כלוריד סידן טוחן לכל אחד משלושת הצינורות ולהשתמש בקר פיפטה מצויד פיפט פסטר לשחרר בועות לתוך כל תערובת. בזמן שהבועות נוצרות, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של תמיסת מלח במאגר BES נגד פיפית פסטר ועל התערובת. הדגירה את הצינורות בטמפרטורת החדר לפחות 15 דקות עד תערובות להיראות מעונן מעט.

במהלך הדגירה, בזהירות להחליף את supernatant של תרבות התא HEK293T עם 10 מיליליטר של DMEM מלא ללא אנטיביוטיקה. להפיץ את קומפלקסים DNA dropwise על מנות בודדות HEK293T תאים תרבות דגירה במשך 24 שעות. למחרת, להחליף את supernatants עם ארבעה מיליליטר של DMEM מלא לכל תרבות ולהחזיר את הכלים 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני תא תרבות החממה לילה.

למחרת בבוקר, לאסוף את supernatants לתוך צינור אחד 50 מיליליטר לכל מנה ולהוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום טרי לכל מנה. לאחר שמונה שעות נוספות של תרבות, בריכת supernatant בכל מנה עם על טבעי שנקטפו בעבר ולהוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום טרי. מחזירים את הכלים לאנקובטור תרבות התאים בן לילה ואוסף את העל-טבעיים בפעם האחרונה.

כאשר כל הנגיף נאסף, לסנן כל lentiviral על טבעי באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר חלבון נמוך מחייב לתוך צינורות בודדים ולהוסיף מקסימום של 15 מיליליטר של על טבעי מסונן ליחידות סינון צנטריפוגלי בודדות עבור צנטריפוגה. השלך את הזרימה. lentivirus צמיג המכיל נוזל יישאר ביחידת הסינון.

כאשר כל על-טבעי lentiviral כבר מסונן aliquot 50 כדי 200 microliters של lentiviruses מרוכז לאחסון קר. לפני תחילת הליך התכנות מחדש, קוד צלחת שש גם רקמה מטופלת עם 500 microliters של 0.1% ג'לטין ל הבאר דגירה את הצלחת במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, שאפו את תוסף הג'לטין הנותר.

צלחת פיברובלסטים עוריים אנושיים בצפיפות של 1.5 פעמים עשר לתאים החמישיים לכל צלחת בשני מיליליטר של DMEM שלם לבא ודגירה בן לילה. למחרת בבוקר, להחליף את המדיום בכל באר עם שני מיליליטר של DMEM שלם בתוספת שמונה מיקרוגרם לכל פוליברן מיליליטר ולהוסיף תערובת אחת לאחד של הבריכה המיוצר גורם שעתוק lentiviruses ו M2rtTA בצינור microcentrifuge חדש. לאחר מכן, לשנות את fibroblast עם נפח אופטימלי של תערובת lentiviral, בין 10 ל 100 microliters לבא.

לאחר 16 שעות של דגירה, להחליף את supernatants עם DMEM מלא ולהחזיר את התאים אינקובטור תרבות התא במשך שש עד שמונה שעות. לאחר ההתאוששות, להחליף את supernatants עם שני מיליליטר של DMEM מלא בתוספת פוליברין ולבצע התברציה שנייה כפי שהוכח רק. בסוף דגירה ההמרה השנייה, להחליף את supernatants עם DMEM שלם בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין ולהחזיר את הצלחת אינקובטור תרבות התא במשך 48 שעות.

בסוף הדגירה, לפצל כל באר ביחס של אחד עד שניים ולהצטייד בשני מיליליטר לגם של מדיום hematopoietic בתוספת דוקסיציקלין בג'לטין חדש מצופה שישה צלחת היטב. כדי להשיג מספר מספיק של תאים לניתוח רצף immunoprecipitation כרומטין, צלחת שלוש פעמים 10 כדי fibroblasts החמישי בג'לטין מצופה שש צלחת היטב דגירה לילה. בסוף הדגירה, להתמר תאים פעמיים ביומיים רצופים עם 10 עד 20 microliters של lentivirus המכיל את הגורמים הבודדים של עניין או מאגר של שלושת הגורמים בתוספת FUW-M2rtTA ביחס אחד לאחד.

16 שעות לאחר ההתמרה השנייה, להסיר את הווירוס המכיל על טבעי דגירה התאים DMEM מלא במשך 24 שעות. בסוף האינקובציה, מחדש את התוכן של כל באר לתוך ג'לטין בודד מצופה 100 מילימטר רקמת רקמות טופלו מנות עם DMEM מלא לנפח סופי של 10 מיליליטר של מדיום לכל מנה, ולהחזיר את התאים אינקובטור תרבות התא. לאחר שישה ימים, החלף את העל-טבעי ב- DMEM מלא בתוספת דוקסיציקלין.

החזירו את התרבויות לאנקובטור ליומיים נוספים. כפי שמדגימים חלקות ציטומטריה מייצגות אלה, כ-17% מהתאים שעברו תכנות מחדש מבטאים הן CD49f והן CD9 לאחר 25 ימי תיכנות מחדש. רוב התאים החיוביים הכפולים מבטאים CD143 ואוכלוסייה קטנה מבטאת CD34, מה שמרמז על אינדוקציה דינמית של גורל ההמוגני.

סמנים אלה אינם מופעלים M2rtTA מתמרים פיברובלסטים עוריים אנושיים מתורבתים במשך 25 ימים. דימות Immunofluorescence מאשר את הביטוי של CD9 ו- CD143 בתאים חסידים ועגולים הנבדלים מורפולוגית מ fibroblasts, אשר שליליים עבור סמנים אלה. הדמיה בהירה מתבצעת כדי לדמיין את קונפליונציית התא, מורפולוגיה, היווצרות המושבה לאורך כל תהליך התכנות מחדש.

ניתוח רצף RNA חד-תאי של תאים מתוכנתים מחדש חושף עלייה צעד-צעד בביטוי CD49f, CD9 ו- CD143 מיום 2 עד 25. לאחר רצף immunoprecipitation כרומטין, פרופילי דפדפן הגנום מראה GATA2 מחייב לאזורים רגולטוריים גנומיים של ITGA6 ו- ACE כאשר fibroblasts הם cotransduced עם שלושת הגורמים או GATA2 בנפרד. נפח החלקיקים האנטי-ויראליים שנוספו לתרבות צריך להיות מותאם במיוחד לתכנות מחדש מוצלח מבלי להתפשר על הכדאיות של התאים.

פלטפורמה זו יכולה להיות יחד עם עיכוב תרופתי וטכנולוגיות סינון בקנה מידה גנום, כגון CRISPR-Cas9, כדי להגדיר רגולטורים חדשניים של hematopoiesis מוחלט אנושי. גישה זו של תכנות מחדש ישיר תאפשר לחוקרים לחקור שאלות חדשות בתחום המטופויז ההתפתחותי האנושי ולפענח מנגנונים שבבסיס המפרט של תאי גזע ההמוטופיטיים האנושיים. חשוב לבצע אוספים ותנופים אנטי ויראליים במכסה המנוע לזרימה למינארית המוקדש לעבודה lentiviral ולהשליך פסולת מזוהמת ויראלית לתוך מיכל מתאים.