בודד סינפסה אינדיקטורים של גלוטמט שחרור ספיגה בפרוסות המוח חריפה מעכברים נורמלי הנטינגטון

הדמיה ברזולוציה גבוהה של סינפסות בודדות המבטאות חיישן גלוטמט מהיר מאפשרת זיהוי של חוסר התאמה מקומי בין שחרור משדר לקליטה. במקרה של מחלה, שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות סינפסות מתפקדות. לתיקון שפעת אוטומטית, ראשית, מניחים פרוסת מוח מהעכבר המעניין בתא ההקלטה של מיקרוסקופ חד-פוטוני.

להטביע את הפרוסה בנוזל השדרתי מחומצן ומלאכותי ולהשתמש במטרה טבילת מים 20x כדי לאתר את הסטריאטום הגבי. תקן את הפרוסות עם רשת ניילון על נבל פלטינה כדי למזער את תנועת הרקמה, ולעבור למטרה 63x מים טבילה. באמצעות מסנן מעבר גבוה ב 510 ננומטר, לרכוש תמונה של autofluorescent ו גלוטמט חיישן מבנים חיוביים יחד.

באמצעות מסנן מעבר גבוה ב 600 ננומטר, לרכוש תמונה שנייה של מבנים autofluorescent לבד. להגדרת הטווח, השתמשו ביתרונות הממוצעים של 10 הפיקסלים הבהירים ביותר ו-10 הפיקסלים הכהים ביותר כדי לשנות את קנה המידה של התמונות האדומות והצהובות. לאחר מכן, בצע חיסור של התמונה הצהובה פחות אדומה ו שנה את קנה מידה של התמונה המחסה כדי ליצור קובץ TIFF סטנדרטי של 8 סיביות להדמיה נוחה של בטון העניין.

כדי לבצע חיפוש אחר בוטונים מגיבים, אתה צריך מיקרופיגט זכוכית מתאים לגירוי חשמלי. השתמש מושך micropipette לייצר פיפטים גירוי נימי זכוכית borosilicate עם קטרים קצה פנימי של כמיקרומטר אחד. כדי לבדוק אם יש שחרור תלוי בפעולה של גלוטמט מקבוצה של בוטונים מועמדים, בחר הגדלה של פי 63 ומסנן פליטת ננומטר 510.

טען את התמונה המופחתת כדי לאפשר מיקום של אלקטרודה גירוי זכוכית ליד דליות פלואורסצנטי, הימנעות הקרבה של אקסונים נוספים. באיזו שונות הקשורה להקצאה או הקצאה מקסימלית בתוך חלק עמוק יותר של הפרוסה. מניחים את אלקטרודה גירוי ליד bouton של עניין לכבות את האור, כמו ההקלטות חייב להתבצע בחושך מוחלט.

לאחר מכן, הפעל את מערכת יישומי האמבטיה הרב-ערוצית, כאשר ערוץ אחד מספק את פתרון האמבטיה הסטנדרטי ואת הערוצים האחרים המספקים את החוסמים הדרושים של ערוצי היונים, המשגרים או קולטני הממברנה, כולל tetrototoxin כדי לחסום את הדור הפוטנציאלי של הפעולה. לשלוט על הזרימה באתר ההקלטה ולהדליק את ממריץ כדי לספק פולסים זרם depolarizing של 2 עד 10 microamps כדי פיפטה גירוי. השחרור מופעל כעת על ידי זרם סידן ישיר דרך תעלות מגודרות מתח.

כדי לדמיין את שחרור הגלוטמט בסיווג, באמצעות המיקרוסקופ X, כונני Y, מקם את בוטון החיישן החיובי של חיישן הגלוטמט שנבדק קרוב למרכז שדה התצוגה. לאחר עצירת הרכישה, לחץ על התמונה עם לחצן העכבר השמאלי כדי לקבוע את מיקום X, Y של מרכז בטון מנוחה. הקואורדינטות X, Y של סמן קבוצה יוצגו.

באמצעות נתוני הכיול, לחשב את הקואורדינטות של האתר שבו קרן הלייזר צריך להישלח לגירוש של פלואורסצנטיות חיישן גלוטמט באמצעות הנוסחאות כפי שצוין. כדי ליצור רצף של נקודה אחת בתוכנת בקרת הלייזר, בחר נקודה בתיבה הוסף לרצף בדף הרצף של תוכנת בקרת הלייזר והגדר את הריצות ואת השהיית הריצה לאפס, ואת הרצף לפעול ב- TLL. לאחר מכן, לחץ על התחל רצף.

בתוכנת בקרת המצלמה, בחר את פרמטרי ההדמיה המתאימים ובחר הפעלה חיצונית עבור מצב הגורם המפעיל. לחץ על קח אות בתוכנת בקרת המצלמה. לאחר מכן, ליזום את פרוטוקול הניסוי שנקבע עבור מכשיר ההדק, וליישם את ניסוי פרוטוקול הניסוי עם ציר הזמן המתאים, כך המצלמה תרכוש 400 מסגרות עם תדר 2.48 קילוהרץ במהלך ניסוי אחד, עם תדר הרץ 0.1 או חזרה נמוכה יותר.

כדי לזהות סינפסות פתולוגיות, הפעל את שגרות הגובה וחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות, הממוצע וסטיית התקן עבור אזור העניין הנבחר במנוחה. קבע וצור את האזור שנכבש על-ידי פיקסלים בעוצמת פלואורסצנטיות במנוחה גדולה מה הממוצע בתוספת שלוש סטיות תקן, וקבע קוטר וירטואלי במיקרונים בהנחה של צורה מעגלית של אזור סף על-שיח. התווה את עוצמת הפלואורסצנטיות כנגד הזמן, כהבדל בין ערך עוצמת הפלואורסצנטיות בפועל לבין ערך עוצמת הפלואורסצנציה במנוחה חלקי ערך עוצמת הפלואורסצנטיות במנוחה.

לקבוע את משרעת השיא של תגובת הפלואורסצנטיות. בצע התאמה מונו-אקספוננציאלית לריקבון מהשיא של תגובת הפלואורסצנטיות, וקבע את קבוע הזמן של ריקבון, TauD. כדי להעריך את משרעת מקסימלית בסינאפזה נתון, בחר את הפיקסל עם השינוי הגבוה ביותר בעוצמת הפלואורסצנטיות, שהוא האינדיקטור הטוב ביותר לעומס הגלוטמט המוצג למכונות האישור של הסינפסה.

הדמיה סינפסה אחת יכולה לשמש לזיהוי שתי מחלקות של סינפסות קורטיקוסטריאטרליות באמצעות הקריטריונים גודל יחס הדופק מזווג. במרווחי גירוי של 20 עד 50 אלפיות שנייה, המסופים הבין-אנטרופאליים הקטנים יותר מועדים לדיכאון דופק מזווג, בעוד שמסופי המתיחה הפירמידליים הגדולים יותר הראו הנחיית דופק מזווגת. בדיקות על התנהגות מוטורית המבוצעת על עכברים ועכברים מסוג פראי המבטאת פנוטיפ הנטינגטון, חושפות קורלציה חיובית משמעותית בין התוצאות שהתקבלו עבור הנתיב הכולל לרוץ בשדה הפתוח, ואת הצעד על השהיה.

יתר על כן, דימות גלוטמט סינפסה יחיד מראה כי עכברי הנטינגטון סימפטומטיים הציגו גירעון במהירות של ריקבון גלוטמט juxtasynpatic כפי שבא לידי ביטוי בערכי TauD של תגובות גלוטמט לגירוי סינפסה יחיד. בבעלי חיים מסוג בר, הארכה כזו נצפתה רק לאחר היישום של מעכב סלקטיבי, שאינו ניתן להעברה של ספיגת גלוטמט. הערכת ההסתברות להתרחשות של ערך TauD נתון בפרוסות מעכברים מסוג בר, ועכברים המבטאים את הסימפטומים של מחלת הנטינגטון, גילה כי בבעלי חיים מסוג בר, TauD אף פעם לא עולה על 15 אלפיות שנייה.

עם זאת, במחלת הנטינגטון הסימפטומטית, 40% מהסינאפסות מציגות ערכי טאוד בין 16 ל-58 אלפיות שנייה, למרות נטייה לירידה בכמות הגלוטמט המשוחרר. לכן, TauD עשוי להיחשב סמן ביולוגי עבור סינפסות מתפקדות במחלת הנטינגטון, והוא עשוי לשמש עוד יותר כדי לאמת התאוששות תפקודית בניסויים מיקוד הובלת גלוטמט אסטרוציטים. פרוטוקול זה עבור ניטור גלוטמט בסינאפסות קורטיקוסטריאט בודדות עשוי לעזור להבהיר את התפקיד של חוסר ספיגת גלוטמט בפתוגנזה של מחלה נוירודגנרטיבית.

הדמיה סינפסה אחת שימושית במיוחד לחקר אתרים טרום סינפטיים של סינפסות סינפסות סינפסה.