הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles
September 4th, 2019
פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של קסנופוס
בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד לבטא מבני דנ"א אקסוגניים בנוירונים אופטיים וכיצד לדמיין ארברים אקסונאליים אופטיים מבטאים GFP בודדים בערימות קסנופוס לאבס שלמות וחיות. זהו הליך זול ופשוט עבור transgenesis תאים ארעיים ספציפיים המאפשר קביעת תפקוד גנים אוטונומיים התא arbors אקסונאלי אופטי בודדים, פיתוח במערכת מודל בעלי חוליות חיים. בהדגמת ההליך יהיו אני, סופיה דאו, עוזרת מחקר, וד"ר טמירה אלול, חוקרת מעבדה.
כדי להתחיל, בעדינות קליפ קצה של פיפטה מיקרו נימי זכוכית משך עם מדפים עדין. למלא את פיפטה מיקרו נימי זכוכית עם שמן מינרלי באמצעות MICROFIL כך טיפה זעירה של שמן מינרלי מופיע בקצה קצוץ של פיפטה מיקרו. מלאו את פיגט המיקרו נימי הזכוכית באמצע הדרך בשמן מינרלי.
במזרק, להוציא את הבוכנה באמצע הדרך ולטעון את פיפטה מיקרו נימי זכוכית משך לתוך מחזיק ההזרקה. לאחר מכן להאריך את הבוכנה במידה המלאה כדי לאשר כי פיפטה נימי מיקרו מחובר בחוזקה מזרק ולא זז עם הרחבת הבוכנה. מעבירים טיפת מיקרוליטר של תערובת הדנ"א/DOTAP לגיליון ריבועי של נייר פרפין.
תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו, הזז את קצה פיפטה נימי מיקרו זכוכית לתוך טיפת DNA / DOTAP. השתמש באפשרות המילוי על מנגנון ההזרקה, למצוץ לאט את ה-DNA / DOTAP טיפה לתוך פיפטה נימי מיקרו זכוכית. הגבול בין השמן המינרלי לבין פתרון הדנ"א/DOTAP נראה בפיפיט המיקרו נימי הזכוכית בשל האטימות הקלה של תותב הדנ"א/DOTAP.
במידת הצורך, להפסיק למלא את פיפטה נימי מיקרו מעת לעת כדי לאפשר את הלחץ פיפטה נימי מיקרו זכוכית לכייל מחדש. ראשית, בצלחת פטרי 10 מיליליטר מלא 0.1X MMR, ידנית de-vitellinize 10 שלב 20 כדי 24 עוברי קסנופוס עם ממטרים בסדר. אחוז במעטפת הויטליין במותניים כדי להימנע מפגיעה בעוברים.
עם מטליות ביד שמאל ובימין של הניסוי, פופ הבועה של מעטפת vitelline ולשחרר את העובר מן המעטפה vitelline. יש לדאוג לא לפגוע בעוברים בעת הסרת מעטפת הויטלין. לאחר מכן השתמש פיפטה העברת פלסטיק עם קצה לחתוך להעביר חמישה עד 10 de-vitellinized שלב 22 כדי 24 עוברים לצלחת פטרי 10 מיליליטר מלא 1X MMR.
תחת מיקרוסקופ סטריאו, לתפוס את אחד העוברים de-vitellinized בצלחת פטרי עם מטליות ולסדר את העובר, כך מוט anterior שלה הוא הצביע בשדה המבט. לאחר מכן לכוון את העובר כך שהוא שוכב באופן מאוחר ואחד ניצני העין משמאל לימין פונה כלפי מעלה. החזק את העובר עם המעצורים ביד הלא דומיננטית של הניסוי ועם היד הדומיננטית של הניסוי, להציג את קצה פיפטה מיקרו זכוכית מהצד הגחוני או הגבי ממש מתחת לאפידרמיס לתוך ניצן העין.
להזריק בין 70 ל 210 nanoliters של פתרון DNA / DOTAP. ואז להפוך את העובר סביב ולבצע את אותה הזרקת מיקרו לתוך ניצן העין השני בצד ההפוך של העובר. להזריק את שני ניצני העין של שישה עד 10 עוברים בכל ניסוי.
לאחר הזרקת מיקרו, לאחסן עוברים בצלחת פטרי עם 1X MMR במשך כ 30 דקות כדי להקל על ריפוי הפצע. לאחר 30 דקות, להעביר את העוברים מוזרק עם פיפטה העברת פלסטיק לתוך פתרון MMR 0.1X עם 0.001% הלבנת סוכן phenylthiocarbamide כדי להפחית פיגמנטציה. מכסים את צלחת פטרי עם מכסה לתרבות העוברים במשך כחמישה ימים עד העוברים התפתחו ראשנים בשלבים 46 עד 47.
פרוטוקול זה מניב שיעור הצלחה של 30 עד 60% של עוברי קסנופוס מוזרקים המבטאים GFP באחד עד 10 ארבורים אקסונאליים אופטיים. תמונות קונפוקליות מייצגות של GFP מראות את השליטה המביעים ואת ארברים אקסונאליים אופטיים מוטנטים בחלקי ראשן קסנופוס שלמים. שני מוטציות דומיין של APC, APCNTERM ו- APBbeta-cat משובטים לפלסמידים pCS2.
תמונות מסדרת Z של בקרת GFP ו- APC מוטנטים אופטיים axonal arbors שוחזרו. חלקות של מספר ענפים, אורך ענף ארבור כולל, ואורך ענף ממוצע מאשרים הבדלים שנצפו בין שליטה לבין מוטנט APC המבטא ארברים אקסונאליים. חלקות פיזור נוספות של מספר ענפים לעומת אורך ענף ממוצע עם קווי רגרסיה מראות מתאם הפוך בין פרמטרים אלה לבין arbors אקסונאלי אופטי המבטאים תחומי APC.
הקצה של פיפטה נימי מיקרו חייב להיות מוכנס כראוי באופן שטחי מאוד לתוך ניצן העין, כך האפידרמיס האפור overlying ניצן העין מתנפח במהלך כל הזרקת מיקרו. הליך זה יכול לשמש הן תווית ולשנות תפקוד גנטי ספציפי נוירונים אופטיים תוך הערכת גידול, מיקוד, הסתעפות של אקסונים מתאי עצב אופטיים אלה. הזרקת מיקרו DNA זו וטכניקת ליפוקציה אפשרה לחוקרים בנוירוביולוגיה התפתחותית לחקור מנגנונים מולקולריים אוטונומיים של תאים המווסתים את ארבוריזציה של אקסון אופטי בערימות קסנופוס לאביס שלמות וחיות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים מיקרו-הזרקה של תערובת DNA/DOTAP לתוך עיני ביצים של עוברים בני יום של Xenopus laevis והדמיה של עצבים אופטיים המבטאים GFP בראשנים חיים. שיטה זו מאפשרת מחקר של תפקוד גנים במודל חולייתנים.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- טרנסגנזה
רקע
- Xenopus laevis הוא אורגניזם מודל נפוץ בביולוגיה התפתחותית.
- טרנסגנזה זמנית ספציפית לתא מאפשרת את המחקר של תפקוד הגן בסוגי תאים ספציפיים.
- GFP מאפשרת הדמיה של מבנים עצביים בדגימות חיות.
- טכניקה זו היא חסכונית ופשוטה.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה לביטוי DNA אקסוגני בנוירונים אופטיים.
- להדגים עצבים אופטיים פרטניים בראשנים חיים.
- להקל על מחקר של תפקוד גן אוטונומי של תאים.
שיטות בשימוש
- מיקרו-הזרקה של תערובת DNA/DOTAP לתוך עיני העובר.
- שימוש בפיפטות מיקרו זכוכית לצורך ההזרקה.
- הדמיה של נוירונים המבטאים GFP בראשנים חיים.
- שיחזור של עצבים אופטיים במוח האמצעי.
תוצאות עיקריות
- ביטוי מוצלח של GFP בנוירונים אופטיים.
- הדמיה של עצבים אופטיים פרטניים בדגימות חיות.
- הדגמה של יעילות השיטה למחקר תפקוד גנים.
- ביסוס שיטה אמינה עבור טרנסגנזה זמנית ב- Xenopus laevis.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק כלי חשוב למחקר מדעי המוח.
- הוא משפר את ההבנה של תפקוד הגן במודלי חוליות מתפתחים.
- השיטה נגישה וניתנת לשחזור עבור חוקרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Direct microinjection of DNA into Xenopus laevis eyebuds enables precise, cell-specific genetic manipulation and live imaging of optic axonal arborization. This approach provides a robust platform for dissecting cell-autonomous molecular mechanisms underlying neuronal connectivity, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in neurodevelopmental research. The method's quantitative outputs and reproducibility enhance predictive confidence for portfolio triage and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function in individual optic neurons within a living vertebrate system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating cell-autonomous effects on axonal branching and targeting.
- Facilitates functional target validation through direct visualization and quantification of neuronal morphology.
- Provides predictive confidence for advancing neurodevelopmental targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, live biological systems for downstream imaging and quantitative analysis workflows.
- Delivers reproducible, quantifiable outputs such as branch number and arbor length for comparative studies.
- Enables assay standardization and scalability for evaluating genetic constructs or pathway modulators.
- Supports reliable screening of gene function and phenotypic outcomes in a vertebrate context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying neuronal connectivity and synaptic development.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical validation of neurodevelopmental targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on in vivo functional readouts.
- Supports translational biomarker identification through live imaging of neuronal architecture.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven gene function studies, quantitative phenotyping, and live imaging in a vertebrate model.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for neuronal development.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating genetic or pharmacological interventions.
- Analytics: Generates quantitative morphological data for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic discovery with preclinical validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse gene function and connectivity studies across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible genetic manipulation and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust in vivo data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, live imaging, and quantitative morphological analysis.
- Needs access to microinjection apparatus, confocal microscopy, and image analysis software.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for other model systems or neuronal subtypes.
- Success rates and throughput are influenced by technical proficiency and embryo handling.
