Name: הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: למדו הזרקת DNA/DOTAP לעיניות של עוברי Xenopus laevis והדמיה של ענפי אקסונים אופטיים מבטאי GFP בראשנים חיים. שיטה זו מאפשרת חקר פונקציית גנים במודל חולייתני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Touro אוניברסיטת קליפורניה המכללה לרפואה אוסטאופתי על תמיכה במחקר שלנו. אנו מכירים את התלמידים הקודמים במעבדה (אסתר וו, גרגורי פנג, Taegun Jin, ג'ון סלים) שסייעו ליישם את טכניקת המיקרוהזרקה הזאת במעבדה שלנו. אנו אסירי תודה לד ר כריסטין הולט, שבמעבדאת הטכניקה הזאת, מיקרופיפוס ה-DNA וטכניקת הליפסד בעוברים התפתחו לראשונה.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת טורו קליפורניה (פרוטוקול TUCA003TE01X).
1. השגת X. זריזה עוברים
<ol><li>השג X. זריזה העוברים על ידי ההזדווגות הטבעית של זוגות של זכר ונקבה צפרדעים מבוגרים מוכן גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG), על ידי הפריה חוץ גופית של ביצים לשפוך מצפרדעים למבוגרים נקבה מוכן hcg, או על ידיהזמנת ישירות (השולחן של חומרים).</li>
	<li>
העוברים dejelly השיגו עם פתרון ציסטאין 2% בטמפרטורת החדר (לוח חומרים)16.
	<ol>
<li>איסוף 50-100 עוברים בצלחת פטרי גדולה. להסיר את הפתרון העוברים הם על ידי היין או שימוש בצנרת העברה פלסטיק. הוסף 25 מ ל של 2% ציסטאין פתרון (0.5 g ציסטאין ב 25 ml ddh2O, pH כדי 8.0) את המנה המכילה את העוברים.</li>
		<li>מערבולת עדינה את צלחת פטרי המכילה את העוברים בתמיסה הציסטאני עד שהמעילים של העוברים נופלים והעוברים אוספים בתוך גוש במרכז המנה (5-10 דקות). בשלב זה, לאט ובעדינות לשפוך את הפתרון ציסטאין לתוך גביע פסולת. לדאוג לא לשפוך רבים מדי העוברים בגביע הפסולת יחד עם פתרון ציסטאין.</li>
		<li>שטפו את העוברים בצלחת פטרי 6x עם 10% הפתרון הצלצול של מארק (MMR) או פתרון מתאים אחרים (למשל, שונה של Barth פתרון, MBS), מתערבל את הצלחת בכל פעם הפתרון מוחלף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תרבות העוברים ב -10% MMR עד שהם מגיעים לשלבים התפתחותיים 22 עד 2417. עוברים מודפוס בטמפרטורה בין 15 ל -25 ° c. שיעור ההתפתחות של העוברים תלוי בטמפרטורה שהם מודבטים ב-17. הערה: העוברים מקטלוג בדרך כלל מגיעים למעבדה בשלבים התפתחותיים 20-24, כך שהם יכולים להיות מדוכא ומוזריקו מייד.</li>
</ol>2. הכנת ה-DNA פלמידים ועשיית DNA/DOTAP תערובת
<ol><li>ביטוי ה-DNA של שיבוט משנה מבנה לתוך xenopus ביטוי וקטורים pCS2 + או pCS2 + MT או נגזרים מהם (במקור נבנה על ידי ד. טרנר ו ר. ראפ)5,6,7. pCS2 + וקטורים מכילים cytomegalovirus שונה (CMV) יזם המסייע הביטוי גנים צפרדעים.</li>
	<li>להגביר את הpCS2 פלמידים המכילים GFP ו/או גנים של עניין עם ערכות miniprep (טבלת חומרים) בעקבות ההליך הסטנדרטי. בשלב הסופי של הפרוטוקול miniprep, לבצע הימנעות רציפים של ה-DNA אל ddH2O כדי להניב ריכוז סופי של &gt; 1 μg/μl.</li>
	<li>אחסן את כל pCS2 פלמידים ב-80 ° צ' עד מוכן לבצע ניסוי מיקרוהזרקה/ליפופה, כלומר, כאשר עוברים בשלבים התפתחותיים 22-24.</li>
	<li>להפשיר את הפלפידים של דנ א. בטמפרטורת החדר , מייד לפני הזיהום. הצנטריפוגה בקצרה דנ א זה ימנע את היווצרות בתערובת DNA/DOTAP שיכול לסתום את הקצה של הצינורות מיקרונימי.</li>
	<li>מערבבים דנ א עם ליפופיזומיום מגיב (לוח חומרים) ב 1:3 (w/v) יחס9,10. לדוגמה, להעביר 2 μg של ה-DNA לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולהוסיף 6 μL של DOTAP, או להעביר 3 μg של DNA בשפופרת מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף 9 μL של DOTAP.</li>
	<li>לאחר DNA ו-DOTAP משולבים, בעדינות קפיצי שפופרת מיקרוצנטריפוגה לערבב את הפתרון. ה-DNA/הפתרון DOTAP צריך להיות אטום מעט לאחר ערבוב.</li>
	<li>אם שני פלסטלינה הם ליפומי ביחד (למשל, pCS2-GFP עם השני pCS2 פלמיד המכיל גרסה מעוגלים או באורך מלא של גן) בנוירונים אופטיים, תחילה לשלב את שני הפלמידים (אחרי בקצרה תפרידו שניהם) ביחס 1:1, ולאחר מכן להוסיף DOTAP ב 1:3 (w/v) יחס. לדוגמה, לשלב 1 μg של pCS2-GFP עם 1 μg של השני pCS2 פלאמיד ולאחר מכן להוסיף 6 μL של DOTAP. הערה: מחקרים הראו כי ליפופה של שני פלמידים לתוך העיניים של עוברי xenopus בשלבים ההתפתחותיים אלה תגרום לביטוי המשותף שלהם בנוירונים בודדים אופטיים9,10.</li>
</ol>3. טעינת מחט מיקרוהזרקה עם דנ א/דוברז
<ol><li>בעדינות לחתוך את הקצה של הצנרת מיקרוקפילר זכוכית משכה עם מלקחיים עדינים (שולחן חומרים).</li>
	<li>ממלאים את הצינורות המיקרוקפיליות בשמן מינרלי בעזרת מיקרופיל, כך שטיפה זעירה של שמן מינרלי מופיעה בקצה החתוך של המיקרופיפטה. מלאו את הפיפטה המיקרוקפילי בחצי הדרך עם שמן מינרלי.</li>
	<li>לטעון את הצנרת מיקרוקפילר זכוכית שנמשך כעת מלא שמן מינרלי לתוך מחזיק הזרקה מתאים מחובר מזרק. אם משתמשים במזרק (שולחן חומרים), הוצא את הבוכנה בחצי הדרך לפני טעינת הפיפטה המיקרונימים. לאחר שהפיפטה המיקרונימי מחובר היטב למזרק, הארך את הבוכנה במידה מלאה כדי לוודא שהפיפטה המיקרוקפילר מחובר בחוזקה למזרק ואינו זז עם התוספת של הבוכנה.</li>
	<li>העברת 3 μL שחרור של ה-DNA/DOTAP תערובת על ריבוע לחתוך (1 אינץ ' ריבוע) גיליון של נייר פרפין.</li>
	<li>מתחת למיקרוסקופ מנתח סטריאו, הזז את קצה הצנרת המיקרוקפילר בזכוכית לתוך ה-DNA/DOTAP.</li>
	<li>לאט למצוץ את ה-DNA/DOTAP ירידה לתוך הצינורות מיקרונימי זכוכית באמצעות אפשרות המילוי על מנגנון ההזרקה. כאשר הנוזל נטען לתוך הצנרת המיקרוקפילר, הירידה תהיה קטנה יותר. בשל אטימות קלה של ה-DNA/הפתרון DOTAP, את הגבול בין השמן המינרלים ואת ה-DNA/DOTAP הפתרון צריך להיות גלוי בתוך הצנרת מיקרוקפילר זכוכית (איור 1). במקרה הצורך, הפסיקו למלא את הפיפטה מדי פעם כדי לאפשר את הלחץ בצינורות המיקרוקפילר כדי לכייל מייל.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60123/60123fig01v2.jpg"> איור 1: תמונות של פיפטה מיקרונימי. התמונות מציגות פיפטה מיקרוקפילר על מנגנון ההזרקה, לפני (א), ואחרי (ב) מילוי עם דנ א/דוברז. חצים פתוחים, קצה הבוכנה בפיפטה המיקרונימי (A, B). חץ סגור, קו בין שמן מינרלי DNA/DOTAP בצינורות מיקרונימי ממולא (ב). סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60123/60123fig01v2large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
4. מיקרוזרקת DNA/DOTAP לתוך Eyebuds של יום 1 קסנפוס הישן
<ol><li>הפעלה ידנית של 10 שלב 20 לאורך 24 העוברים עם מלקחיים עדינים בצלחת פטרי בגודל 10 מ"מ מלאה 0.1 x mmr. לתפוס את מעטפת vitelline על המותניים כדי למנוע פציעה העוברים. עם מלקחיים הן בידיים שמאל וימין של הנסניסה, פופ את הבועה של המעטפה vitelline ולשחרר את העובר מן המעטפה vitelline. לדאוג לא לפגוע העוברים בעת הסרת המעטפה vitelline. הערה: החל משלב 20, העוברים מפתחים כניסה או ' מותניים ' בין החצאים הקדמי והאחורי של העובר. המותניים הללו מאפשרות לפער להיווצר בין מעטפת הווילין לבין העובר בתנוחה זו.</li>
	<li>השתמש בפיפטה להעברת פלסטיק עם קצה לחתוך כדי להעביר 5-10 שלבים בשלב 22-24 העוברים לצלחת פטרי של 10 מ"מ מלאה ב-1x MMR. הערה: פתרון מלח גבוה יותר ב-1x MMR מסייע לריפוי פצעי ניקוב שיגרמו להזרקות.</li>
	<li>תחת הstereomicroscope, אחוז באחד מעוברי הדאיטאלליזציה בצלחת הפטרי עם מלקחיים בכל יד, וסדר את העובר כך שהעמוד הקדמי שלו מכוון בשדה הראייה. מכוון את העובר כך שהוא מונח באופן שמאלי ואחד העיניים שלו (ימין או שמאל) פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>מתחת לstereomicroscope, החזיקו את העובר בעזרת הלקחיים בידו הלא-דומיננטית של הנסניסה, וכאשר ידו הדומיננטית של הנסנסיית מציגה את קצה מיקרוסקופ הזכוכית אל תוך העיניים (מהצד הגחוני או הצדדי, תלוי בחצי העובר כרגע מוזרק), ממש מתחת לאפידרמיס (איור 2). הכנס בין 70 עד 210 nL של פתרון ה-DNA/DOTAP. זה יכול להיעשות בפולסים מספר, תלוי בגודל של הדופק מזרק מוגדר (בדרך כלל 70 nL). הערה: עומק ההזרקה חשוב מאוד לליפסתה לנוירונים אופטיים. אם המיקום של קצה המיקרונימי מוכנס היטב בצורה מאוד שטחית לתוך eyebud, ואז אחרי המיקרו הזרקה, את האפידרמיס האפור על גבי eyebud יהיה להתנפח. אם התנוחה עמוקה מדי, העיניים האפורות לא יראו שום שינויים, ותדירות הביטוי של הדנ א בנוירונים אופטיים תהיה נמוכה יותר.</li>
	<li>הפוך את העובר סביב ולבצע את אותה מיקרוזריקה לתוך eyebud בצד המקביל של העובר.</li>
	<li>הכנס את שתי העיניים של 6-10 (או יותר) עוברים בכל ניסוי.</li>
	<li>לאחר המיקרו הזרקה, לאחסן עוברים בצלחת פטרי עם 1x MMR עבור כ 30 דקות כדי להקל על ריפוי הפצע.</li>
	<li>לאחר 30 דקות, העברת עוברים מוזרק לתוך פתרון 0.1 x MMR עם 0.001% הלבנת הסוכן (פנילתאיובםבמאמיד) כדי להפחית פיגמנטציה. תרבות העוברים המכוסים במשך כחמישה ימים, עד שהעוברים התפתחו לעמודים בשלבים 46-4716.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60123/60123fig02v2.jpg"> איור 2: תיחום אזור העיניים עבור מיקרוהזרקה. סכימטי (א) וphotomicrograph (ב) של X. זריזה העובר בשלבים התפתחותיים 22/23 להראות האזור eyebud כי צריך להיות מכוון מיקרו הזרקה (אדום מדגיש). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. פאנל A שונה מ-בר ואח '18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60123/60123fig02v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
5. הדמיה של GFP ביטוי אופטי המבטא האופטיים ללא שינוי, חיים Tadpoles
הערה: כאשר העמודים שהיו מזוהמים בדגימת דנ א מגיעים לשלבים התפתחותיים 46-47, הם מוכנים להדמיה.
<ol><li>, לפני ההדמיה. מוטות הראש חייבים להיות מורדם כדי להדלף את העמודים האלה, העבירו את המוטות ליפופיטרים בתמיסה של 0.02% tricaine ב-ddH2O בצלחת פטרי בגובה 10 מ"מ. המתן 5 עד 10 דקות עד שהעמודים יהיו משותק. לוודא כי המוטות הם עדיין בחיים על ידי התבוננות לבבות המכות שלהם תחת מיקרוסקופ מבתר סטריאו.</li>
	<li>לתוך תא סיליקון מותאם אישית. על מגלשת זכוכית וחותם עם שמיכות הראשן צריך להטות מעט את הראש כך שבצד אחד (ימין או שמאל) של ראשו בזווית כלפי מעלה ובקושי נוגע בשובר הכיסוי.</li>
	<li>הטקו את חצי המוח הטשני של הראשן המוטה כלפי מעלה בהגדלה נמוכה עבור המבטא האופטי של GFP. הערה: שטח מיקרוסקופ זקוף מצויד בתאורה אפיפומית ועדשת אובייקטיבי האפורומטית (טבלת חומרים) ניתן להשתמש כדי לעבור על המסך עבור arbors פלורסנט.</li>
	<li>אם חצי הכדור tectal מכיל בין אחד עד שלושה gfp המבטא האופטית סוכת, ללכוד z סדרה של תמונות של סוכת אלה באמצעות ניגודיות גבוהה 40 x אוויר מטרה העבודה במרחק זמן רב (טבלת חומרים). עבור כל אחד מהארבור, לכידת 10-20-עשרים פרוסות z-series במרווחי זמן של 1.5 יקרומטר.</li>
	<li>כדי לראות אקסון סוכת בצד השני של המוח tectal, טען מחדש את הראשן בתא הסיליקון, כך שהוא נוטה לצד השני וחותם עם שובר כיסוי. לאחר מכן חזור על שלבים 5.3 ו-5.4.</li>
</ol>6. שחזור וקוונפיקציה של מורפולוגיה האופטית של ארבור
<ol><li>בחר מחסנית תמונה המכילה בין אחד לשלושה מבני מוצרים בעלי מבטא GFP המבטא אופטי.</li>
	<li>השתמש בכלי ציור ביד חופשית בתוכנה לעריכת גרפיקה (טבלה של חומרים) כדי לעקוב אחר החלק של כל ארבור האקונאליות אופטית לעין בכל z-פרוסה. מעקב דרך פיסות של כל מובן ארבור בכל z-פרוסה תיצור הקרנה דו-ממדית מדויקת של הארבור. בצבעים שונים ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר GFP מובחנת המבטא האופטית arbors.</li>
	<li>הפוך את כל המידות המורמטריות על שחזורים דו-ממדיים של ה-סיבי arbors, עם התייחסות לסדרת z המקורית של תמונות בעת הצורך7. באמצעות תוכנת Image J (טבלה של חומרים), למדוד פרמטרים מורפולוגיים כגון מספר סניפים (כלומר, מספר עצות הסניף או נקודות הסניף), סה כ הענף ארבור אורך, אורך לכל ענף, אורך ורוחב של ארבור, הצורה הכוללת של ארבור (L/W יחס, מעגליות) וזווית ענפים7.</li>
</ol>

<ol><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li>
<li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo%3A+dynamics+and+modulation+by+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li>
<li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axons+with+and+without+their+somata%2C+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos%3A+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li>
<li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system%3A+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li>
<li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-and+C-terminal+domains+of+%CE%B2-catenin%2C+respectively%2C+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li>
<li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK-3%CE%B2+and+%CE%B1-catenin+binding+regions+of+%CE%B2-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li>
<li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number%2C+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li>
<li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li>
<li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li>
<li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li>
<li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li>
<li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li>
<li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2%CE%B4+in+developing+retina%3A+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li>
<li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107(2007).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2000).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , North Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).</li>
<li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zahn+drawings%3A+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li>
<li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li>
<li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ena%2FVASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li>
<li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290(2015).</li>
<li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

במאמר זה, אנו מדגימים כיצד לבטא במבנים DNA אקסוגני במספר יחיד או קטן של נוירונים אופטיים וכיצד התמונה בודדים gfp המבטא האופטית סוכת עם איתות רגיל ומשתנה מולקולרית בשלמותו, החיים ראשנים של הצפרדע X . . אני מבין. אנו גם מסבירים כיצד לשחזר ולכמת את המבנה של gfp המבטא האופטית סוכת מתמונות שנתפסו vivo. כדי לבטא את ה-DNA האקסוגני במספר קטן של נוירונים אופטיים, אנו מזריקים התערובת DNA/ליפועיהזיהום לתוך הראש הפריחידייה של עוברי יום אחד הישן Xenopus , באמצעות טכניקה שפותחה לראשונה במעבדה של כריסטין הולט ללמוד או...

במהלך הפיתוח של מערכת העצבים, אקסונים של נוירונים טרום סינפטיות לנווט באזורים שונים של המוח כדי להגיע לאזורי היעד שלהם. כאשר אקסונים לפלוש רקמות היעד שלהם, הם לבסס קשרים סינפטית עם היעד הפוסט נוירונים. בסוגים רבים של נוירונים, אקסונים להגדיל את המספר ואת ההיקף המרחבי של חיבורי סינפטית הם יכולים לעשות על ידי הגברת רשתות של סניפי מסופים או סוכת1. ההקרנה retino-tectal של טתרנים של הצפרדע הימית xenopus זריזה הוא מודל בעלי חוליות רב עוצמה עבור בדיקת מנגנונים בבסיס מסוף אקסון arborization קישוריות סינפטית2,3,4 . בודדים gfp ביטוי סוכת אופטיים עם איתות מולקולרי נורמלי ושונה ניתן לצפות ישירות בתוך שלמים, חי xenopus ראשנים5,6,7,8. כדי לבטא GFP בלבד או ביחד עם גירסאות באורך מלא או מקוצר של גנים במספר קטן של נוירונים אופטיים, אנו משתמשים בטכניקה הכוללת מיקרוהזרקה/ליפופישל דנ א לתוך eyebuds של עוברי יום אחד עוברים9, 10. טכניקה זו פותחה במקור כדי לחקור מנגנונים של אקסון האופטי מציאת הצעיר xenopus tadpoles, והוא כבר הוחל על ידינו ואחרים כדי לקבוע מנגנונים מולקולריים סלולריים בבסיס האקסון האופטי , הארבוריזציה בקספוס העמודים5,6,7,8,9,10
טכניקות חלופיות כדי לבטא גנים אקסוגני במספר קטן של נוירונים אופטיים פותחו במינים מודל אחרים, כמו גם ב -X זריזה. עם זאת, כל אחת מגישות אלה מציגה אתגרים ומגבלות בהשוואה למיקרו הזרקת דנ א/ליפופישל מגיב בeyebuds של עוברי קסנפוס . בעכברים, הטרנסגנזה יכולה לשמש כדי לבטא גנים במספר קטן של נוירונים אופטיים, אבל הדור של עכברים טרנסגניים הוא יקר, עכברים הזמן לארוך ולעתים קרובות להציג עם תופעות לוואי לא רצויות11. בנוסף ניתן ליצור על ידי הזרקת פלסטלינה לתוך השלב המוקדםשל עוברימחשוף בעלי הצבע האופטי בנוירונים. עם זאת, תהליך זה דורש שיבוט של מיזם מסוים כדי לבטא גנים בתבנית פסיפס בנוירונים אופטיים בזחלים של דג הרימות12. תדירות הביטוי של דנ א אקסוגני בנוירונים אופטיים ב-דג זברה הוא גם נמוך במקצת (< 30%) שהיו מוזרקים באמצעות מגיב DNA/ליפוזומלי (30-60%) בשנת אלקטרופורציה שימש גם לבטא גנים במספר קטן של נוירונים אופטיים באפרוחים13. עם זאת, הליך זה נכשל באפיון מלא של מנגנונים הקובעים הקרנות אופטיות, מכיוון שאין אפשרות ליצור תמונה של מנגנוני הראייה האופטיים ללא שינוי, עוברים בחורות חיות. בסופו של דבר, מספר מעבדות השתמשו באלקטרופורציה לגנים שונים למספר קטן של נוירונים אופטיים בקספוס טתרנים14,15. עם זאת, האלקטרופורציה דורשת אופטימיזציה של ציוד ופרוטוקולים (מלקחיים, אלקטרודות, דפוסים מרחביים ומרחבי של פולסים בגלי גל) מעבר לכך ששימשו להזרקות של דנ א/ליפופיציה מגיב לעיניים של עוברי קספוס .
אנחנו ואחרים בעבר השתמשנו בטכניקה של מיקרוהזרקה/ליפושל ה-DNA לתוך eyebuds של עוברי xenopus כדי לקבוע מנגנוני איתות אוטונומי האוטונומית הקמת אקסון אופטי5,6, מיכל סבן , 8. בתחילה השתמשנו בגישה זו כדי לנתח את הפונקציות של מתאם הקדהרין ו-wnt חלבון β-catenin בארבוריזציה אופטיתב- xenopus ראשנים עמודים 5,6. במחקר אחד, הראנו כי β-catenin קשירה ל α-catenin ו pdz נדרש, בהתאמה, עבור ייזום ועיצוב סוכת אופטיים בvivo5. בדו ח השני, הדגמנו כי התחומים β-catenin קשירה עבור α-catenin ו GSK-3β הקרנה לווסת את דפוסי ההקרנה של הפלבטים אופטיים הגחותיים6. לאחרונה, זיהינו תפקידים לגורם wnt, מאפייני פוליפוזיס coli (APC), בוויסות תכונות מורפולוגיות של סוכת אופטיים בתוך xenopus ראשנים7. על ידי שיתוף הביטוי את N-terminal ואת התחומים המרכזיים של APC לווסת יציבות β-catenin וארגון מיקרוכדורית יחד עם GFP בנוירונים בודדים אופטיים, החלטנו תפקידים משותפים וייחודיים עבור אלה תחומים האינטראקציה APC על מספר הסניף, אורך, וזווית בתוך סוכת אופטיים ב vivo7. מעבדה נוספת השתמשה בטכניקת המיקרוהזרקה/ליפוחות כדי לקבוע את תפקידי האוטונומית של התא עבור איתות על-ידי קולטן bdnf, trkb, ב-סיבי אופטיים ב- xenopus ראשנים8. קבוצה זו הראתה כי הביטוי של הסתעפות מודאג שלילי-TrkB המוני והתבגרות סינפטית בתוך האקסון האופטי הבודד ב vivo8. באופן כללי, טכניקת הליפיפוס ב- Xenopus כבר הרחיבה את התפקידים הספציפיים של גנים שונים בעלת הסתעפות אופטית בסביבה הטבעית.

<table><tbody><tr><td>3.5 אינץ' Micropipettes</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 - תוכנת G/X</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-manager (גרסה 1.4)</td><td>Vale Lab</td><td></td><td>www.micro-manager.org</td></tr><tr><td>CCD מצלמה Scion</td><td>Corporation</td><td>CFW-1312 M</td><td></td></tr><tr><td>Chorulon (גונדוטרופין כוריוני אנושי)</td><td>AtoZ Vet Supply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149-100G</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11202375001</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Ocps #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11250-10</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800 מיקרוסקופ אפיפלואורסנטיות</td><td>Nikon</td><td></td><td>מטרות: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td></tr><tr><td>GNU Image Manipulation Program (גרסה 2.10.10)</td><td>GIMP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator (2017 Creative ענן)</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (גרסה 1.46r)</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF 34G-5</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור עם מתאם אוניברסלי ובסיס תמיכה</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-024-R</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>3-000-025-SB</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>3-000-024-A</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>ממונע z-stage</td><td>MFC-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II מזרק</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Powerpoint (גרסה 15.31)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis עוברים</td><td>Nasco</td><td>LM00490</td><td></td></tr></tbody></table>

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

ההקרנה החזותית העיקרית של טתרנים של הצפרדע הימית xenopus זריזה משמש מערכת מודל מעולה למחקר מנגנונים המסדירים את ההתפתחות של קישוריות עצבית. במהלך הקמתה של ההקרנה retino-tectal, מרחיבים אופטיים להאריך מן העין ולנווט באזורים שונים של המוח כדי להגיע רקמת היעד שלהם, tectal אופטי. לאחר אקסונים אופטיים להיכנס tectum, הם מורכבים סוכת הטרמינל כי הפונקציה להגדיל את מספר הקשרים סינפטית הם יכולים לעשות עם היעד interneurons ב tectum. כאן, אנו מתארים שיטה לבטא קידוד ה-DNA חלבון פלורסנט ירוק (GFP), ו-להשיג ואובדן של פונקציה מבנים גנים, ב נוירונים אופטיים (בתאי גנגליון הרשתית) ב העוברים Xenopus . אנו מסבירים כיצד להחדיר מיקרו DNA/ליפופיהזיהום מגיב לתוך eyebuds של עוברים הישן יום אחד כגון גנים אקסוגני מבוטא במספר יחיד או קטן של נוירונים אופטיים. על-ידי תיוג גנים עם gfp או שיתוף הזרקת עם gfp פלאבאמצע, הטרמינל סיבי סוכת של נוירונים בודדים אופטיים עם איתות מולקולרי שונה ניתן לדימות ישירות במוח של שלמים, חי xenopus ראשנים מספר ימים לאחר מכן, ואת מורפולוגיה שלהם ניתן לכמת. פרוטוקול זה מאפשר לקבוע את המנגנון המולקולרי האוטונומי התאי הנמצא בתוך הvivo.

הפרוטוקול המתואר במאמר זה מניב שיעור הצלחה של 30 ל-60% של מוזרקים העוברים ביטוי gfp (לבד או ביחד עם מבנים DNA נוספים) באחד עד עשר arbors אופטיים. באיור 3, אנו מציגים הנציג מיקוד תמונות של בקרת הביטוי gfp ו-מוטציה אופטיים מוטנטים בתוך שלמים של xenopus ראשנים מן המחקר שפורסם לאחרונה7. עבור מחקר זה, שיכלנו שני מוטציות בתחום של APC (APCNTERM ו-APCβ-cat) לתוך pCS2 פלמידים, ושיתוף הזריק אלה הפלמידים יחד עם התוויות pCS2-GFP בתוך העיניים של עוברי יום אחד העו...

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של קסנופוס

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד לבטא מבני דנ"א אקסוגניים בנוירונים אופטיים וכיצד לדמיין ארברים אקסונאליים אופטיים מבטאים GFP בודדים בערימות קסנופוס לאבס שלמות וחיות. זהו הליך זול ופשוט עבור transgenesis תאים ארעיים ספציפיים המאפשר קביעת תפקוד גנים אוטונומיים התא arbors אקסונאלי אופטי בודדים, פיתוח במערכת מודל בעלי חוליות חיים. בהדגמת ההליך יהיו אני, סופיה דאו, עוזרת מחקר, וד"ר טמירה אלול, חוקרת מעבדה.כדי להתחיל, בעדינות קליפ קצה של פיפטה מיקרו נימי זכוכית משך עם מדפים עדין. למלא את פיפטה מיקרו נימי זכוכית עם שמן מינרלי באמצעות MICROFIL כך טיפה זעירה של שמן מינרלי מופיע בקצה קצוץ של פיפטה מיקרו. מלאו את פיגט המיקרו נימי הזכוכית באמצע הדרך בשמן מינרלי.במזרק, להוציא את הבוכנה באמצע הדרך ולטעון את פיפטה מיקרו נימי זכוכית משך לתוך מחזיק ההזרקה. לאחר מכן להאריך את הבוכנה במידה המלאה כדי לאשר כי פיפטה נימי מיקרו מחובר בחוזקה מזרק ולא זז עם הרחבת הבוכנה. מעבירים טיפת מיקרוליטר של תערובת הדנ"א/DOTAP לגיליון ריבועי של נייר פרפין.תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו, הזז את קצה פיפטה נימי מיקרו זכוכית לתוך טיפת DNA / DOTAP. השתמש באפשרות המילוי על מנגנון ההזרקה, למצוץ לאט את ה-DNA / DOTAP טיפה לתוך פיפטה נימי מיקרו זכוכית. הגבול בין השמן המינרלי לבין פתרון הדנ"א/DOTAP נראה בפיפיט המיקרו נימי הזכוכית בשל האטימות הקלה של תותב הדנ"א/DOTAP.במידת הצורך, להפסיק למלא את פיפטה נימי מיקרו מעת לעת כדי לאפשר את הלחץ פיפטה נימי מיקרו זכוכית לכייל מחדש. ראשית, בצלחת פטרי 10 מיליליטר מלא 0.1X MMR, ידנית de-vitellinize 10 שלב 20 כדי 24 עוברי קסנופוס עם ממטרים בסדר. אחוז במעטפת הויטליין במותניים כדי להימנע מפגיעה בעוברים.עם מטליות ביד שמאל ובימין של הניסוי, פופ הבועה של מעטפת vitelline ולשחרר את העובר מן המעטפה vitelline. יש לדאוג לא לפגוע בעוברים בעת הסרת מעטפת הויטלין. לאחר מכן השתמש פיפטה העברת פלסטיק עם קצה לחתוך להעביר חמישה עד 10 de-vitellinized שלב 22 כדי 24 עוברים לצלחת פטרי 10 מיליליטר מלא 1X MMR.תחת מיקרוסקופ סטריאו, לתפוס את אחד העוברים de-vitellinized בצלחת פטרי עם מטליות ולסדר את העובר, כך מוט anterior שלה הוא הצביע בשדה המבט. לאחר מכן לכוון את העובר כך שהוא שוכב באופן מאוחר ואחד ניצני העין משמאל לימין פונה כלפי מעלה. החזק את העובר עם המעצורים ביד הלא דומיננטית של הניסוי ועם היד הדומיננטית של הניסוי, להציג את קצה פיפטה מיקרו זכוכית מהצד הגחוני או הגבי ממש מתחת לאפידרמיס לתוך ניצן העין.להזריק בין 70 ל 210 nanoliters של פתרון DNA / DOTAP. ואז להפוך את העובר סביב ולבצע את אותה הזרקת מיקרו לתוך ניצן העין השני בצד ההפוך של העובר. להזריק את שני ניצני העין של שישה עד 10 עוברים בכל ניסוי.לאחר הזרקת מיקרו, לאחסן עוברים בצלחת פטרי עם 1X MMR במשך כ 30 דקות כדי להקל על ריפוי הפצע. לאחר 30 דקות, להעביר את העוברים מוזרק עם פיפטה העברת פלסטיק לתוך פתרון MMR 0.1X עם 0.001% הלבנת סוכן phenylthiocarbamide כדי להפחית פיגמנטציה. מכסים את צלחת פטרי עם מכסה לתרבות העוברים במשך כחמישה ימים עד העוברים התפתחו ראשנים בשלבים 46 עד 47.פרוטוקול זה מניב שיעור הצלחה של 30 עד 60% של עוברי קסנופוס מוזרקים המבטאים GFP באחד עד 10 ארבורים אקסונאליים אופטיים. תמונות קונפוקליות מייצגות של GFP מראות את השליטה המביעים ואת ארברים אקסונאליים אופטיים מוטנטים בחלקי ראשן קסנופוס שלמים. שני מוטציות דומיין של APC, APCNTERM ו- APBbeta-cat משובטים לפלסמידים pCS2.תמונות מסדרת Z של בקרת GFP ו- APC מוטנטים אופטיים axonal arbors שוחזרו. חלקות של מספר ענפים, אורך ענף ארבור כולל, ואורך ענף ממוצע מאשרים הבדלים שנצפו בין שליטה לבין מוטנט APC המבטא ארברים אקסונאליים. חלקות פיזור נוספות של מספר ענפים לעומת אורך ענף ממוצע עם קווי רגרסיה מראות מתאם הפוך בין פרמטרים אלה לבין arbors אקסונאלי אופטי המבטאים תחומי APC.הקצה של פיפטה נימי מיקרו חייב להיות מוכנס כראוי באופן שטחי מאוד לתוך ניצן העין, כך האפידרמיס האפור overlying ניצן העין מתנפח במהלך כל הזרקת מיקרו. הליך זה יכול לשמש הן תווית ולשנות תפקוד גנטי ספציפי נוירונים אופטיים תוך הערכת גידול, מיקוד, הסתעפות של אקסונים מתאי עצב אופטיים אלה. הזרקת מיקרו DNA זו וטכניקת ליפוקציה אפשרה לחוקרים בנוירוביולוגיה התפתחותית לחקור מנגנונים מולקולריים אוטונומיים של תאים המווסתים את ארבוריזציה של אקסון אופטי בערימות קסנופוס לאביס שלמות וחיות.

microinjection-dna-into-eyebuds-xenopus-laevis-embryos-imaging-gfp

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

כאן אנו מציגים שתי טכניקות מניפולציה ביטוי גנים בתאי הגנגליון ברשתית Murine (RGCs) על...

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

וידאו זה מדגים כיצד לדמיין מסלולי axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים בחוט השדרה ניצול חומוס...

פענוח מסלולים axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים התחתית צ&#39;יק עצבית ניצול ב אובו Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים...

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

אנו מדווחים כאן הביטוי חזק ויעיל של חלבוני ניאון לאחר הזרקת mRNA לביציות מופרה של lanceolatum מיתרני הראש. הפיתוח של טכניקת microinjection בchordate בסיס זה יסלול את הדרך למרחיקה לכת חידושים טכניים במערכת מודל מתפתח זה, לרבות בתחום ההדמיה vivo ומניפולציות גנטיות ספציפית.

ביטוי של חלבונים ניאון ב Lanceolatum מיתרני הראש על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במפות גורל ועוקבי שושלת כדי למקד זריקות לבלסטומרים בודדים המולידים כליה של עוברי Xenopus laevis.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

למדו הזרקת DNA/DOTAP לעיניות של עוברי Xenopus laevis והדמיה של ענפי אקסונים אופטיים מבטאי GFP בראשנים חיים. שיטה זו מאפשרת חקר פונקציית גנים במודל חולייתני.

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

גלה סרטונים נוספים