בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן ליסוירוס מרקמות קבועות פורמלין

רקמות המשמשות אימונוהיסטוכימיה והיסטופתולוגיה אבחון קבועים באופן שגרתי ב 10%פוספט חוצץ פורמלין. גילוי נגיף הכלבת אנטיגן ברקמת המוח שתוקן בפורמלין מהווה אתגר ייחודי, ובדיקת IHC נמצאה כשיטה רגישה וספציפית לגילוי אנטיגן של נגיף הכלבת. היתרון העיקרי של ביופסיה או שיטות זיהוי אחרות הוא כי אנטיגנים ניתן לזהות ביחס לרקמות מורפולוגיה הסלולר.

עם IHC, לוקליזציה של אנטיגן כלבת במוח ורקמות שאינן המוח, לספק מידע נוסף שלא ניתן להשיג באמצעות קטעי כתמי המטוקסילין ואוסין שגרתיים. בדיקת אבחון כלבת חשובה לתחילת מניעת חשיפה בבני אדם החשופים לנגיף הכלבת. IHC הוא אחד מהבילויות הנפוצות ביותר על רקמות קבועות פורמלין.

עם נוגדנים ספציפיים, זה יכול לשמש לגילוי של פתוגנים בהתאמה. כדי להתחיל הליך זה, למקם שלוש עד חמש חתיכות מילימטר של רקמת המוח, שנאספו לאחר נמק, לתוך פתרון פורמלין חוצץ 10% במשך 24 עד 72 שעות. להקליט את משקל הרקמה המשוער, סוג הרקמה, ואת נפח הפורמלין.

מניחים את הרקמות ב 70%אתנול לאחסון רקמות ארוך יותר לאחר קיבוע פורמלין, ולפני העיבוד. לאחר קיבוע הדגימה, לנתח את הרקמה כדי לכלול את אזורי המוח החשובים, כגון חתך של גזע המוח, המוח הקטן, או ההיפוקמפוס. כל אחד, לחתוך לעובי בין שלושה לחמישה מילימטרים.

מניחים את הרקמות לתוך קלטות עיבוד. מעבדים את קלטות הרקמה לחדירת שעוות פרפין. הטמע אותם בבלוקים של פרפין ותחלק אותם על מיקרוטום.

הגדר תחילה את צלחת הכתמים כפי שהיא מסומנת באיור 1 של פרוטוקול הטקסט. ממלאים כל מנה ב-250 מיליליטר של הפתרון המוכן. כדי להכין את פתרון מלאי מצע AEC, להשתמש pipette זכוכית להמיס אחד 20 מיליגרם לוח של AEC ב 5 מיליליטר של N, N-Dimethylformamide.

כדי להכין את פתרון מלאי פרוטאז, להמיס 7 מיליגרם של פרוטאז ב 200 מיליליטר של PBS. כדי להכין את חוצץ השטיפה, להוסיף 100 מיליליטר של Tween 80 עד 990 מיליליטר של PBS, ומערבבים היטב כדי ליצור פתרון הומוגני של PBT-T. באמצעות מיקרוטום, לעשות קטע פרפין חמישה מיקרומטר.

טען את המקטע על אמבט מים ב 38 מעלות צלזיוס ולאסוף אותו על מגלשות זכוכית. סמן את השקופיות באמצעות עט עמיד לריגנט. מניחים את השקופיות על מגש וממיסים בתנור ב 55 עד 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

לאחר מכן, להסיר את השקופיות מהתנור מיד deparaffinize אותם, באמצעות 3 שטיפות קסילן רצופות של 5 דקות כל אחד. לאחר מכן, rehydrate את החלקים על השקופית על ידי טבילות רציפות בהפחתת דילול של אתנול למים deionized, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לטפל שקופיות עם פרוטאז במשך 30 דקות עבור אחזור אנטיגן פרוטאוליטי, ולאחר מכן לשטוף את השקופיות PBS-T במשך 10 דקות, ולטפל בהם עם 3% מי חמצן במשך 10 דקות.

לאחר מכן, לשטוף את השקופיות שוב עם PBS-T במשך 10 דקות. כדי להתחיל, הסר שקופית אחת מהמאגר, הקפד לטפל רק בשקופית אחת בכל פעם, בעוד האחרים נשארים שקועים, והשתמש במגבת נייר כדי למחוק חוצץ עודף מסביב למקטע הרקמה. מניחים את השקופיות לתוך תא לחות ודגרה עם סרום עזים רגיל בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.

לאחר מכן, לדגור על השקופיות בתא הלחות עם נוגדן דילול ראשוני אופטימלי קבוע מראש נגד כלבת, ונוגדנים שליטה שלילית, בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות ללא שטיפות בין לבין. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות עם PBS-T במשך 10 דקות ודגורה בתא לחות עם נוגדן biotinylated בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לשטוף את השקופיות שוב עם PBS-T במשך 10 דקות.

לדגור על המגלשות ואת תא הלחות עם חלוקת רצועה ומתחם HRB בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ולשטוף את PBS-T במשך 10 דקות. לאחר מכן, דגירה עם AEC בתא לחות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לשטוף את המגלשות במים deionized במשך 10 דקות ואת הנגד עם Hematoxilyn של גיל, מדולל אחד עד שניים עם מים deionized במשך שתי דקות.

לאחר מכן, לשטוף את המטוקסילין עודף על ידי טבילה לשטוף את המגלשות במים deionized. לשטוף את השקופיות במי הברז של סקוט במשך 30 שניות ולשטוף במים deionized במשך 10 דקות. הסר את השקופיות אחת בכל פעם ולהרכיב אותם עם מדיום הרכבה מסיס במים.

לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ אור כדי לקרוא את השקופיות. במחקר זה, מבחן כימיה אימונוציטית מוצגת לגילוי אנטיגן וירוס כלבת כמו בדיקה אבחון חלופי עבור רקמות קבוע פורמרין. כימיה חיסונית מייצגת מכתימה תוצאה של דגימות שליטה חיובית ושלילית ברקמות מוח שונות מוצגת כאן, כולל גזע המוח, תאי המוח הקטן והפורקיניה, וההיפוקמפוס.

הכתם האדום של המגנטה, המציין את התפתחות הצבע באמצעות מצע AEC על רקע כחול מוכתם, נובע מתגובה של נוגדנים נגד אנטיגן כלבת. תוצאה חיובית אימונוהיסטוכימיה תואמת את הכתמים האדומים של מגנטה בקטעי הרקמה. הכתמת תכלילים ציטופלסמיים והכללים פרטניים בגדלים שונים מעידים על דגימות חיוביות לזיהומים RABV.

דגימות נחשבות שליליות אם לא נצפו כתמים אדומים ספציפיים או רק הרקע הכחול, עקב המטוקסילין. בנוסף להכתמה החיובית, התפלגות ההכללות יכולה לספק כימות עקיף של רמות האנטיגן של כלבת במדגם, אשר עשוי להתאים את העומס הנגיפי של דגימת הרקמה. ללא קשר לרמות ההפצה, כל כתם ספציפי י לסווג את המדגם כחיובי לזיהוי אנטיגן RABV.

רקמות צריך להיות קבוע כראוי פורמלין, ולהימנע הקפאת הרקמות במהלך תהליך זה. אנטיגן כלבת מזוהה על ידי IHC, אז טכניקות מולקולריות ניתן לבצע על מקטעי פרפין כדי לקבוע את וריאנט Lyssavirus מבוסס על מידע רצף RNA. ריאגנטים כמו קסילן ופורשטין צריכים להיות מטופלים בברדסים אדים.

יש להקפיד בעת טיפול AEC כפי שהוא מסרטן.