בידוד של לוקיולוציטים מחלב השד האנושי לשימוש בנוגדן-מותנה תאית הסלולר שיטת מטרות HIV

פיתחנו שיטה קפדנית לבודד תאים מחלב אם אנושי כדי לחקור phagocytosis הסלולר תלוי נוגדנים, או ADCP, על ידי phagocytes חלב אם נגד מטרות HIV. טכניקה זו מקלה על בידוד מהיר וקל יחסית של תאי חלב אם כדי להעריך את היכולת של אוכלוסיות לויוציט לבצע ADCP. הדגימה של ההליך תהיה אליסה פוקס, טכנאית מהמעבדה שלי.

לאחר בחירת אנטיגן יעד רלוונטי, השתמש בערכה מסחרית כדי להפוך את החלבון לעניין על פי פרוטוקול היצרן. ולהפקיד את הדגימה biotinylated לתא העליון של עמוד ספין. מוסיפים PBS עד 400 מיקרוליטרים ומכסים את התא לפני הכנסת העמודה לצינור איסוף לצנטריפוגה.

לאחר השלכת הזרימה דרך, להוסיף PBS ל 400 microliters עבור צנטריפוגה שנייה. השלך את הזרימה דרך, להוסיף PBS ל 400 microliters, ולמדוד את ריכוז החלבון על ידי ספקטרופוטומטר כדי להצטיין את החלבון biotinylated מיקרומטר מיקרוספרות. הדגירה שישה מיקרוגרם של חלבון עם 12 microliters של חטיף מלאי ב 200 microliters של PBS לכל צלחת של חרוזים נדדים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים, עם מערבולת עדינה כל 20 דקות.

בסוף הדגירה, גלולה את החלבון חרוזים גדוש על ידי צנטריפוגה להשליך את supernatant. לאחר מערבולת עדינה, יש להתריע מחדש על החלבון ב-1200 מיקרוליטרים של 0.1%BSA ב-PBS, ולשטוף את הצינור על ידי צנטריפוגה פעמיים נוספות כפי שהודגם זה בלבד. לאחר הכביסה האחרונה, יש לעשות שימוש חוזר ב-1200 מיקרוליטרים ב-PBS פלוס BSA.

כדי להקים צלחות ADCP Assay, הכינו תחילה 12 דילול מיקרוליטר של נוגדנים, או את הנסיוב החיסוני המעניין, ב-2%BSA ב-PBS בצלחת עגולה תחתונה של 96 בארות. מוסיפים לצלחת 10 מיקרוליטרים של חרוזים נקובים בחלבון למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, להוסיף 200 microliters של PBS בתוספת BSA.

לאחר קבלת חלב אם אנושי מנשים מניקות בריאות המביעות באמצעות משאבה, בתוך ארבע שעות של ביטוי להפריד את תכולת החלב על ידי צנטריפוגה בזהירות לשפוך את חלב דל שומן ושומן, משאיר את גלולת התא באין מפריע. לנגב את החלק הפנימי של הצינור עם לנגב ללא מוך כדי להסיר את כל השומן מקיר הצינור ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS בתוספת HSA. תן את גלולה עם צינור עדין כדי למנוע הפעלת תאים באפופטוזיס, ולהעביר את ההשעיה התא צינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה.

לאחר שטיפה שנייה ב- PBS בתוספת HSA כפי שהודגם זה הרגע, יש לעכל בעדינות את התאים באחד עד שני מיליליטר של PBS טרי בתוספת HSA לספירה. עבור ADCP Assay, במהירות להפוך את צלחת ADCP מוכן כדי decant supernatant לאחר הצנטריפוגה הסופית ולהוסיף חמש פעמים 10 בתאי חלב אם מבודדים טריים הרביעי ב 200 microliters של PBS בתוספת BSA עבור דגירה של שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, צנטריפוגה התאים לשטוף את כדורי פעמיים 200 microliters של PBS טרי כפי שהוכח.

לאחר הכביסה האחרונה, להכתים את התאים עם 0.5 מיקרוגרם למיליליטר של כתם הכדאיות לתיקון 450 ל באר ב 50 microliters של PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, גלולה את התאים עבור שתי שטיפות PBS טרי כפי שהודגם, ולהכתים את התאים עבור סמני לויוציט עניין במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים צנטריפוגה, ולשטוף את התאים פעמיים 200 microliters של 1%BSA בתוספת PBS לכל לשטוף.

לאחר הכביסה האחרונה, לתקן את כדורי 200 microliters של 0.5% פורמלדהיד לכל באר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לניתוח ציטומטרי זרימה של דגימות התא, הגדר ציטומטר זרימה המצויד ב קורא לוחות תפוקה גבוהה כדי למשוך 175 מיקרוליטרים של מדגם ולאסוף 5000 תאים ל הבאר. בצע את gating הראשונית כדי לחסל כפילים ופסולת על פיזור קדימה לעומת חלקת פיזור בצד.

השתמש פיזור בצד לעומת עלילה כתם הכדאיות כדי לחסל את התאים המתים. ולהשתמש פיזור בצד לעומת העלילה CD45 כדי להבדיל את המעמדות הגדולים leukocyte. עבור כל התאים החיוביים CD45, או עבור כל תת קבוצה של לויוציטים של עניין, למדוד את פעילות phagocytosis הסלולר תלוי הנוגדן על ידי gating עם סמן על התאים החיוביים חרוזים בהיסטוגרמה של ערוץ פלואורופור המתאים עבור חרוזים משותף.

לאחר מכן לחשב את הנוגדן תלוי phagocytosis הסלולר ציונים כמו החציון של עוצמת הפלואורסצנטיות של תאים חיוביים חרוז באחוזים של CD45 הכולל בתוספת התאים באוכלוסייה החיובית. כאן מוצגת אסטרטגיית הגתה לחיסול כפילים, פסולת ותאים מתים. בין אחד ל -12% מכלל התאים החיים הם בדרך כלל CD45 לויוציטים חיוביים כאשר רוב פיזור הצד כביכול נמוך עד בינוני CD45 מונוציטים נמוכים שנראים מבשרים, או לתאים לא בוגרים, בהתבסס על פיזור הצד לעומת CD45 gating.

הגרנולוציטים כביכול מוגדרים כפיזור צד גבוה, תאי ביניים CD45. מדידת פעילות ADCP של תאי חלב אם מבודדים טריים באמצעות נוגדן חד שבטי אנושי ספציפי ל- HIV בחודש אחד לאחר הלידה מגלה כי טיפול במעכב אקטין ציטוכלאסין D וקולטן Fc החוסם נוגדנים לפני הדגירה עם נוגדנים הקשורים לאנטיגן תוצאות פעילות ADCP ב או מתחת שנצפו בנוכחות נוגדן בקרה. ציון ADCP שנקבע עבור תאים חיוביים CD45 הכולל הוא בדרך כלל בין 25 ל 35 לקפל מעל רמות הרקע, מוגדר באמצעות שליטה שלילית, נוגדן חד שבטי אנטי אנתרקס.

כל דגימת חלב אם היא ייחודית וכמה כדורי עשוי להיות קשה לראות. בנוסף, אוכלוסיות לויוציט, ולכן ציוני ADCP, עשויים להשתנות מאוד מדגם לדגימה.