Name: שיטת פלואורסצנטית מבוססת על האפיון והקוונפיקציה של היווצרות Droplet ליפיד בגוף מעיים אנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: למדו שיטת סקרינינג פלואורסצנטית לכימות היווצרות droplet ליפיד באורגנואידים מעיים אנושיים. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי תרופות המשפיעות על מטבוליזם ליפידים בדגימות ספציפיות למטופל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ב. Spee על מתן בנדיבות LD540. עבודה זו נתמכה על ידי ארגון הולנד להענקת מחקר מדעי (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) לס

<ol><li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li>
<li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li>
<li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat%3A+Presence%2C+synthesis%2C+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li>
<li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li>
<li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li>
<li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li>
<li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li>
<li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li>
<li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements%2C+Protein-losing+Enteropathy%2C+and+Rickets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li>
<li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+protein+losing+enteropathy%3A+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li>
<li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li>
<li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids%3A+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye%2C+LD540%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li>
<li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי לקבוע את היווצרות LD במעי האנושי אורגנואידים על הדגירה עם חומצה אולאית. שיטה זו מבוססת על LD ספציפי לצבוע פלורסנט LD54018, אשר מאפשר אפיון וכימות של הנפח הכולל של טיפות השומנים בתוך תרבות אורגאידית. ההליכים להקמת ולתחזוקה של תרבויות בעלי מעיים אנושיים פורסמו לפני13, ומדריך חזותי של פרוטוקול זה זמין גם הוא15.
הצעדים הקריטיים בפרוטוקול זה הם התרבות של אורגנואידים המעי האנושי, ואת הקוניוגציה הנכונ...

שומנים הם מרכיב חיוני של התזונה האנושית ולשחק תפקיד חשוב אחסון אנרגיה מערכתית ומטבוליזם. כאשר בלע, ליפידים תזונתיים הם מושפל לתוך חומצות שומן בחינם (FFAs) ו monoglycerides (MGs) על ידי lipases הלבלב. מצעים אלה נלקחים לאחר מכן על ידי הנוציטים של האפיתל המעי, שם הם הראשונים מחדש לדיגלידים (DG) על ידי אנזימים מונגליד (MGAT) ולאחר מכן לטריגליצרידים (TG) על ידי diacylגליצרול (DGAT1)1. לבסוף, האלה משולבים ב-טי. אס. או chylomicrons לייצוא למערכת הלימפה או טיפות השומנים ציטוסולג (השלד) עבור אחסון תאיים2,3. למרות שchylomicrons נחוצים להפצת שומנים תזונתיים לאיברים אחרים, החשיבות של אחסון שומן תאיים ב-השלד אינה ברורה לחלוטין. עם זאת, המכונה הוכחו לבצע פונקציה תקינה במעי, כפי שהם לאט לשחרר שומנים לתוך המחזור עד 16 h אחרי ארוחה4. יתר על כן, המוני הוכחו להגן מפני ריכוזי חומצות שומן רעילים, כגון במהלך התנאים לפני העכבר5.
חלבון DGAT1 ממוקם על הממברנה האנדופלזמית (ER) וממלא תפקיד מכריע ב-LD היווצרות ב אפיתל המעי. מוטציות Homozygous ב DGAT1 להוביל שלשול מוקדם התפרצות חמורה ו/או הקאות, היפואלבומין, ו/או (קטלני) חלבון מאבד בידור עם כישלון מעיים על צריכת שומן, הממחישות את החשיבות של DGAT1 הומאוסטזיס השומנים של האדם , אפיתל המעי6,7,8,9,10 מאז התרחשות של DGAT1-מחסור בבני אדם הוא נדיר, הגישה לתאים שנגזר מטופל הראשי כבר נדיר. יתר על כן, התרבות ארוכת טווח של תאים אפיתל המעי כבר זמן רב מוגבלת קווי הגידול נגזר התאים אשר מייצגים את הפיזיולוגיה נורמלי רק להאריך מוגבל. לכן, היווצרות DGAT1-בתיווך LD למדו בעיקר בפיברותקיעות או בעלי חיים שמקורם שורות תא7,10,11,12. בתור כזה, זה היה לאחרונה הראו כי DGAT1-לקויה מטופלים נגזר פיברוטים לצבור פחות התעודות לעומת תאים בריאים לאחר גירוי עם חומצה אולאית (OA)8.
בעבר, פרוטוקולים הוקמו בתאי גזע האפיתל התרבות מכל איבר העיכול בצורה של תלת מימדי (3D) אורגנואידים13. מעיים אלה ניתן לשמור בתרבות במשך תקופה ארוכה של13, ולאפשר את המחקר הפונקציונלי של המטופל-ואת המעיים מיקום ספציפי מאפיינים האפיתל14. הם גנטית, פנופנטיות בדרך כלל יציבה וניתן לאחסן, המאפשר הרחבה ארוכת טווח ו biobanking13.
לאחרונה הדגמנו כי היווצרות LD ניתן למדוד בקלות בתוך אורגנואידים המעי האנושי במערך LD (LDF) שיטת6. כאשר הם חשופים OA עבור 16 h, אורגנואידים ליצור התעודות כדי להגן על התאים מפני רעילות המושרה ליפיד. כאשר ריכוזי OA גבוהים מדי, התאים מתים על ידי caspase-תיווך ואפופטוזיס6. שיטת LDF הוצגה בעבר להיות תלויה במידה רבה ב DGAT1 כפי שצוין על ידי אורגנואידים נגזר מהחולים DGAT1-מוטנטים ועל ידי שימוש במעכבי DGAT1 ספציפיים6.
עבור שיטת ה-LDF המתוארת בפירוט כאן, אורגנואידים תלת-ממדיים הם מתורבתים מפני ביופסיות מעיים ומהווים שבועי באמצעות הפרעה לתאים בודדים היוצרים בקלות אורגנואידים חדשים. עבור הפעלת שיטת LDF, ~ 7,500 התאים היחידים הנגזרים אורגאיד מצופים בכל טוב של צלחת 24-הבאר. אורגנואידים נוצרות לאורך מספר ימים, מודלבן לילה עם OA 1 מ"מ ו ויטראז ' עם LD540, תא פלורסנט-מוגדר-LD לצבוע ספציפי המקל הדמיה. היווצרות LD הוא לאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, לוחית הפלורסנט קורא, או לזרום cy, לנסות.
על-ידי שינוי קנה מידה זה היווצרות זיהוי LD לפורמט 96-ובכן, הטיפול יכול לשמש גם עבור ניתוח תפוקה גבוהה של היווצרות LD למסך תרופות הרומן המשפיעות על היווצרות LD בתרבויות המעי האנושי מחלות, או ללמוד (האדם הגנטי) הפרעות המשפיעות על . מטבוליזם של LD

<table><tbody><tr><td>תוסף DMEM/F12 מתקדם</td><td>Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת ממברנת הבסיס (מטריג'ל)</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>מעכב DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DGAT1 (AZD 3988)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4837/10</td><td></td></tr><tr><td>ללא חומצות שומן BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>קליניפת</td><td>4078-9001</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין (GlutaMAX, 100x)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 מ')</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר</td><td>Leica</td><td>SP8X</td><td></td></tr><tr><td>LD540</td><td></td><td></td><td>סופק באדיבות על ידי ד"ר ב. ספי, אוניברסיטת אוטרכט</td></tr><tr><td>mEGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09_500ug</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N0636-500G</td><td></td></tr><tr><td>תאים המייצרים נוגין (תאי HEK293-mNoggin-Fc)</td><td></td><td></td><td>MTA עם J. den Hertog, מכון הוברכט</td></tr><tr><td>חומצה אולאית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>O1008-5G</td><td></td></tr><tr><td>p38 מעכב MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8662-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>PBS ללא Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (5,000 יחידות / מ"ל)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>תאים המייצרים R-spondin (תאי Cultrex HA-R-Spondin1-FC 293T)</td><td>R& D systems</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>24 צלחות באר מטופלות TC</td><td>Greiner-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>TC מטופלות בשחור שקוף 96 לוחות באר</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>מעכב קולטן TGFb מסוג I (A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין (TrypLE Express)</td><td>Life Technologies</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>תאים המייצרים WNT-3A (תאי L-Wnt-3A)</td><td></td><td></td><td>MTA עם J. den Hertog, מכון הוברכט</td></tr><tr><td>Y-27632 דיהידרוכלוריד (מעכב Rho kinase)</td><td>Abcam</td><td>ab120129-10</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת פלואורסצנטית מבוססת על האפיון והקוונפיקציה של היווצרות droplet ליפיד בגוף מעיים אנושי

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

ליפידים תזונתיים נלקחים כמו חומצות שומן חינם (בדרך) על ידי אפיתל המעי. אלה מintracellularly המרה לתוך הטריגליצרידים (TG) מולקולות, לפני שהם ארוזים לתוך chylomicrons לצורך הובלה לימפה או לתוך השומנים טיפות ציטוסולג (המוני) עבור אחסון תאיים. צעד מכריע עבור היווצרות של ה-"השלד" הוא הפעילות הקטליטית של הדיליליגליל (DGAT) בשלב הסופי של הסינתזה TG. המורדים חשובים לחיץ מינים רעילים השומנים ולווסת את חילוף החומרים הסלולרי בסוגי תאים שונים. מאז אפיתל המעי האנושי הוא התעמת באופן קבוע עם ריכוזים גבוהים של שומנים, היווצרות LD הוא בעל חשיבות רבה כדי לווסת הומאוסטזיס. כאן אנו מתארים את הבקשה הפשוטה לאפיון וככמת של היווצרות LD (LDF) על גירוי עם חומצת שומן בלתי רווי הנפוץ ביותר, חומצה אולאית, ב אורגנואידים המעי האנושי. שיטת ה-ldf מבוססת על הצבע הפלורסנט הספציפי LD LD540, אשר מאפשר כימות של הזדהות על ידי קונפוקלית מיקרוסקופ מיקוד, הקורא צלחת הפלורסנט, או הזרימה cy, try. שיטת LDF ניתן להשתמש כדי לאפיין את היווצרות LD בתאי האפיתל המעי האנושי, או ללמוד אנושי (גנטי) הפרעות המשפיעות על מטבוליזם LD, כגון DGAT1 מחסור. יתר על כן, ניתן להשתמש באפשרות זו גם בצינור תפוקה גבוהה כדי לבדוק תרכובות טיפוליות הרומן, אשר לשחזר פגמים ביצירת LD במעיים או סוגים אחרים של אורגנואידים.

לניתוח הנכון של היווצרות LD, האורגנואידים לא צריך להיות הנזרע בצפיפות רבה לפני גירוי עם OA והכתים הבאים. הדבר מהווה חשיבות במיוחד עבור מוקד הקריאה וקורא הצלחות, כיוון שהאורגנואידים החופפים עלולים להפריע לזריחה. דוגמה לצפיפות מתאימה של זריעה אורגאידית (איור 1א) ותרבות עם אורגנואידים חופפים מוצגת (איור 1B). כדי למזער את השונות בגירוי לדוגמה עם OA, גודל האורגנואיד וצפיפות הזריעה צריכים להיות מקבילים...

פרוטוקול זה מתאר את התצורה של היווצרות droplet (LD) של השומנים במבנה המעי האנושי על גירוי עם חומצות שומן. אנו דנים כיצד משתמשים באותה שיטת לכימות היווצרות LD, וכיצד ניתן להשתמש בה עבור הקרנת תפוקה גבוהה עבור תרופות המשפיעות על היווצרות LD.

שיטת פלואורסצנטית מבוססת על האפיון והקוונפיקציה של היווצרות Droplet ליפיד בגוף מעיים אנושי

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות לכמת היווצרות טיפת השומנים באורגנואידים מעיים אנושיים. זה יכול לשמש כפלטפורמת סינון תפוקה גבוהה כדי לבדוק תרופות לווסת היווצרות טיפת השומנים. השיטה שאנו מתארים מבוססת על צבע ספציפי לירידה בדם ואיברנואידים מעיים שמקורם בביופסיה.בכך הוא מספק מודל יציב, מדויק ורלוונטי מבחינה פיזיולוגית להיווצרות טיפות שומנים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לסנן עבור מועמדים תרופה חדשה ספציפית למטופל לווסת את היווצרות טיפות השומנים, למשל, בחולים DGAT1-לקוי. זה טיפת השומנים היווצרות assay יכול להיות מיושם גם על סוגים אחרים של תרבויות organoid ללמוד חילוף החומרים השומנים בסוגי תאים אחרים.ההתמהמה תלויה במידה ניכרת בצפיפות התרבות האורגנואידית. נסו להבטיח צפיפות אורגנואידית עקבית בין דגימות וניסויים. הדגמה חזותית של בדיקה זו היא קריטית משום שחשוב להראות כיצד האורגנואיד צריך להיות מתורבת וכיצד יש לטפל בהם כדי להבטיח ניתוח נכון של היווצרות טיפת השומנים.לאחר הכנת האורגנואידים, שאף בזהירות את מדיום התרבות מבלי להפריע ל טיפות מטריצת קרום המרתף. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מדיום בסיס קר ל הבאר הראשונה של אורגנואידים. באמצעות פיפטה P1000, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את טיפות מטריצת קרום המרתף עם אורגנואידים.חזור על הליכים אלה עם אותו מדיום הבא גם נדרש, אבל לא לקצור יותר משתי בארות לכל 500 microliters של מדיום בסיס. לאסוף את האורגנואידים בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר מחייב נמוך, ולסובב אותם למטה בצנטריפוגה שולחן מיני במשך 15 עד 20 שניות. הוסיפו 400 מיקרוליטרים של טריפסין לאורגנואידים המסובבים.דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה P200 כדי pipette בעדינות את ההשעיה למעלה ולמטה כדי לשבש את הצבירה הנותרת של תאים. דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.כאשר רק תאים בודדים נשארים, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום בסיס ומסובבים כלפי מטה את התאים בצנטריפוגה קטנה לשולחן למשך 15 עד 20 שניות. שאף את העל-טבעי לחלוטין. השתמשו בפיפט P200 כדי להשעות מחדש את התאים הבודדים ב-200 מיקרוליטרים של hSI-EM טרי, ולהוסיף 800 מיקרוליטרים נוספים של hSI-EM.לאחר מכן ספור את מספר התאים בהשעיה וחשב את נפח התאים הדרוש לצפיפות התאים הסופית. מוציאים את נפח המתלים המתאים ומתאימים את הצפיפות ל-750 תאים למיקרוליטר. הוסף מטריצת קרום מרתף לתליית התא ביחס של 2 ל-1.בעדינות pipette ההשעיה לערבב להיות זהיר כדי למנוע יצירת בועות. בצלחת תרבות מחוממת מראש, זרע את שלוש טיפות 10 מיקרוליטר לגם אם הצלחת יש 24 בארות או טיפה אחת חמישה מיקרוליטר לגם אם הצלחת יש 96 בארות. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך 10 עד 15 דקות כדי לחזק את טיפות.בינתיים, מחממים מראש נפח מתאים של hSI-EM+Y באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות את hSI-EM+Y החם מראש לכל באר של הצלחת. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני.לאחר יומיים עד שלושה ימים, החלף את המדיום ב- hSI-EM ודאג לרענן אותו פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע. ראשית, לשקול 0.2 גרם של חומצה אולאית נוזלית בטמפרטורת החדר. מוסיפים 1.5 מיליליטר של PBS סטרילי ברמה תרבותית ומחממים את התערובת ל-70 מעלות צלזיוס למשך שעה ומוודאים מערבולת לסירוגין.לאחר מכן, לשקול 5.89 גרם של BSA ללא חומצות שומן ולהמיס אותו 33.9 מיליליטר של PBS. מחממים את התערובת באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה של ה-BSA. Vortex תערובת חומצה אולאית שוב כדי ליצור אמולסיה של טיפות בסדר מיד להוסיף אותו לפתרון BSA באמצעות פיפטה זכוכית.שומרים את התערובת על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד פתרון צהבהב ברור נשאר. מעבר האורגנואידים כפי שתואר בעבר וזרע את התאים הבודדים שמקורם באורגנואידים לתוך צלחת שחורה ברורה 96 באר. ביום השישי של culturing על hSI-EM, להחליף את מדיום התרבות עם hSI-EM המכיל מילימול אחד של חומצה אולאית BSA מצומד.דגירה התאים במשך 16 עד 17 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות או היעדר 0.1 מעכבי DGAT1 מיקרומולרי. לאחר מכן, שאף את המדיום מבלי להפריע טיפות מטריצת קרום המרתף. לקבע את האורגנואידים על ידי הוספת 100 microliters של ארבעה אחוז ניטרלי מאגר פורמלדהיד ל בארות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.הסר את פורמלדהיד בעדינות ובזהירות לשטוף את התאים עם 150 microliters של PBS ל הבאר. להכתים את התאים עבור טיפות השומנים עם 025 מיליגרם למיליליטר LD540 ו DAPI ב PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. ואז לשטוף את הבארים בזהירות עם PBS.לתמונות סקירה של אורגנואידים שלמים יש להשתמש בסובייקטיבי פי 40 שמתאים להדמיה פלואורסצנטית קונפוקל. הגדר את המיקרוסקופ לתמונה עבור DAPI וצבע LD540 באמצעות הגדרות העירור וההפחתה המוצגות כאן. הגדר את גודל חור הסיכה ליחידה אווריורית אחת לקבלת רזולוציה מספקת של ציר z.כדי לדמיין חצי של אורגנואיד כדורי להגדיר z-מחסנית כ 85 מיקרומטר. באמצעות מערכת עיבוד תמונה מתאימה, שנה את ערימת z של כל אורגנואיד להקרנה מרבית על-ידי לחיצה על תמונה, ערימות, פרוייקט Z. הגדר את סף ההקרנה המרבית לרמה שבה אין אות LD540 גלוי בדגימה של בקרת רכב BSA על-ידי לחיצה על תמונה, כוונון, סף.השתמש בהגדרות אלה כדי לסף כל תמונה. לאחר מכן למדוד את השטח הכולל של פלואורסצנטיות עבור כל הקרנה מקסימלית באמצעות הפונקציה לנתח, לנתח חלקיקים. לניתוח נכון של היווצרות טיפת השומנים, האורגנואידים לא צריכים להיות זרע בצפיפות מדי לפני גירוי עם חומצה אולאית וכתמים הבאים.זה חשוב במיוחד עבור הקריאה קונפוקל קורא צלחת מאז אורגנואידים חופפים עלול להפריע פלואורסצנטיות. לאחר גירוי עם מילימולר אחד של חומצה אולאית בן לילה, היווצרות טיפת השומנים ניתן לדמיין עם מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך. הצטברות של טיפות שומנים מפזרת אור מועבר, ולכן האורגנואידים נראים כהים יותר, ואילו אורגנואידים שאינם מגורים יש מראה שקוף.לאחר האורגנואידים המושרים בחומצה אולאית קבועים ומוכתמים, ניתן לדמיין את היווצרות טיפת השומנים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל. מכיוון שהאברנואידים הם מבנים תלת-מימדיים, מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי רגיל אינו מתאים בשל אות הרקע מחוץ לפוקוס, ולכן נעשה שימוש בערימה קונפוקלית כדי לאפיין LDF באורגנואידים. כימות של דגימות מיקרוסקופיה confocal יכול להתבצע גם באמצעות קורא לוח פלואורסצנטי מנורמל לאות Hoechst פלואורסצנטי.מסמן קורא הלוחות מצביע על ירידה משמעותית באות LD540 בתאי אורגנואידים שטופלו במעכב DGAT1 בהשוואה לאורגנואידים לא מטופלים. כימות של היווצרות LD בתאים בודדים ניתן להשיג באמצעות ציטומטר זרימה. אסטרטגיית הגתה המוצגת כאן היא לאיברואידים מעיים אנושיים נותק.היסטוגרמות נציג עבור שניהם SSC-A ואת האות LD540 של אוכלוסיית התא החי הסופי להראות כי היווצרות טיפת השומנים יגרום לעלייה SSC-A עקב היווצרות של טיפות שומנים תאיים. בנוסף, כתמי LD540 עבור שומנים המאוחסנים טיפות השומנים, ואת האות גם יגדל עם אינדוקציה של היווצרות טיפת השומנים. ככזה, היווצרות טיפת השומנים נמדדת כשינוי בעוצמת הפלואורסצנט הממוצעת של SSC-A ו- LD540.הצעדים המכריעים ביותר של פרוטוקול זה הם התרבות של אורגנואידים מעיים אנושיים ואת גלית נכונה של חומצה אולאית ל- BSA. כדי להתאים לתנאים נוספים, ניתן לנתח את ההתראה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי. כדי לתקן עבור מספר האורגנואיד ל באר, אות LD540 היה מנורמל לאות DAPI.בעזרת טכניקה זו, חוקרים יכולים לחקור היווצרות טיפות שומנים במערכות אורגנואידיות, ולשפר טכניקות ניתוח שונות כגון מיקרוסקופ אלקטרונים כדי לאמת את הממצאים שלהם.

a-fluorescence-based-assay-for-characterization-quantification-lipid

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים בדיקת ציטומטריית זרימה לכימות רמות ROS באורגנואידים תלת-ממדיים במעי המתקבלים מעכברים טרנסגניים המבטאים GFP. שיטה זו מספקת מודל ניסויי במבחנה כדי לחקור את היעילות של תרכובות בדיקה על ייצור ROS.

בדיקת ציטומטריית זרימה לכימות עקה חמצונית: בדיקה לכימות מיני חמצן תגובתי באורגנואידים במעיים באמצעות בדיקות פלואורוגניות

פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ליפוזומים וכיצד ניתן להשתמש בקיבוע על פני השטח ולעבור באופן אינדיבידואלי בצורה מקבילה מסיבית תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבר מאפשר לכמת את הגודל והאחידות בין ליפוזומים בודדים של האוכלוסייה.

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

כאן אנו מתארים טכניקה כדי לכמת את שלמות המכשול של אורגנואידים מעיים קטנים. העובדה כי השיטה מבוססת על אורגנואידים חיים מאפשר חקירה רציפה של שלמות מכשול שונים חומרים מודולים או שילובים אותם באופן שנפתר בזמן.

חקירת פירוק מחסום המעיים באורגנואידים חיים

במסמך זה, אנו מדגימים פרוטוקול מותאם BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות לאפיון טיפות שומנים ברקמת הכבד. באמצעות שימוש בהקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, הפלואורופור מאפשר הבחנה מוצלחת בין סטאטוזיס מיקרו-שלפוחית וסטאטוזיס מקרו-שלפוחית ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים להערכת סטאטוזיס בכבד.

ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד

המחקר הנוכחי מתאר מתודולוגיות מבוססות דה-צלולריזציה להדמיה וכימות של שקיעת רקמת שומן תוך-שרירית (IMAT) באמצעות נפח שריר שלם, כמו גם כימות מדדים של אדיפוציטים בודדים המרכיבים IMAT.

כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד

ליפופגיה היא צורה סלקטיבית של אוטופגיה הכוללת פירוק של טיפות שומנים. תפקוד לקוי בתהליך זה קשור להתפתחות סרטן. עם זאת, המנגנונים המדויקים עדיין לא מובנים במלואם. פרוטוקול זה מתאר גישות הדמיה כמותית כדי להבין טוב יותר את יחסי הגומלין בין אוטופגיה, מטבוליזם של שומנים והתקדמות סרטן.

חקר הוויסות של קטבוליזם טיפות שומנים באמצעות ליפופגיה

אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב להדמיה ברזולוציה גבוהה, ללא תוויות ותלת מימד של אורגנואידים באמצעות הולוטומוגרפיה קוהרנטית נמוכה. פרוטוקול זה מפרט הכנת תרבית אורגנואידים, רכישת הדמיה וניתוח תמונה חישובי, המאפשר הדמיה בזמן אמת של דינמיקה מבנית ותגובות תרופות באורגנואידים חיים.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה וניתוח למידת מכונה ללא תוויות של אורגנואידים במעי באמצעות הולוטומוגרפיה בקוהרנטיות נמוכה

פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה שחזורית של טיפות שומן ודינמיקת האברונים במהלך מיטוזה באמצעות תאי הפטומה מסונכרנים.

שיטה מבוססת פלואורסצנציה להמחשת דינמיקת טיפות שומן ואברונים במהלך מיטוזה בתאי הפטומה

אנו מתארים שיטה מינימלית פולשנית וללא כאבים למדוד hindlimb כלבים שריר וכוח התגובה התכווצויות שריר אקסצנטרי חוזרות ונשנות.

In vivo Assay שרירים כלב פונקציה

למדו שיטת סקרינינג פלואורסצנטית לכימות היווצרות droplet ליפיד באורגנואידים מעיים אנושיים. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי תרופות המשפיעות על מטבוליזם ליפידים בדגימות ספציפיות למטופל.

שיטת פלואורסצנטית מבוססת על האפיון והקוונפיקציה של היווצרות Droplet ליפיד בגוף מעיים אנושי

גלה סרטונים נוספים