הכנה בינונית לטיפוח מיקרואורגניזמים בתנאים אנאירובית/אנקסימית בלבד
15 באוגוסט 2019
כמו אורגניזמים אנאירובית מחייב אינם מסוגלים לצמוח על החשיפה לחמצן, השימוש של טכניקות culturing אנאירובית הוא הכרחי. כאן, אנו להדגים שיטה פשוטה ויעילה לטפח תרבות מעורבת נגזר צמח ביוגז מפני התקשורת הכנה גז וכימות חומצות שומן נדיף.
בניגוד לאורגניזמים אירוביים, מיקרואורגניזמים אנאירוביים לחלוטין דורשים היעדר חמצן. מכיוון שחמצן נמצא בכל מקום באוויר, שמירה על תנאים נטולי חמצן במהלך הטיפוח היא דרישה מוקדמת לטיפוח אנאירובי. הטכניקה המיושמת מייצגת שיטה פשוטה וזולה לספק תנאים אנוקסיים לטפח אוכלוסייה מיקרוביאלית מעורבת בתרבות הנוזלית.
טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם לטיפוח תרבויות טהורות. עם זאת, עבור מיקרואורגניזמים רגישים לחמצן מאוד, הליך זה עשוי שלא להיות ישים. התחל על ידי שקילה של מרכיבים בינוניים בבקבוקון מתאים, והמסתם עם חצי נפח של מים מזוקקים.
לאחר מכן, להוסיף מיליליטר של מחוון REDOX, ואחריו ויטמינים בפתרון אלמנט קורט. כוונן את ה- pH בהתאם לדרישות האורגניזם, וה להביא את הנפח הסופי ל 1 ליטר עם מים מזוקקים. הצבע של מחוון REDOX תלוי ב- pH, וייתכן שיהיה לו זמן להתאים אותו.
ממלאים 120 בקבוקי סרום מיליליטר עם 50 מיליליטר של מדיום, ולאחר מכן דגירה אותם באמבט מים 100 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות, כדי להפחית את מבודדות החמצן בשלב הנוזלי. לשטוף את מרחב הראש עם חנקן. לטפל אוורור החדר המתאים בעת עבודה עם חנקן.
סוגרים את הבקבוקים עם ספטה גומי בוטיל, ולתקן את כובעי אלומיניום. לאחר מכן, הוסף 0.1 מיליליטר של הפחתת סוכן לכל בקבוקון, כדי להפחית עוד יותר את פוטנציאל REDOX. ו autoclave את flasks במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
יש להשתמש במקלטה אוטומטית המאושרת לערקור כלי שיט סגורים בעת החלת פרוטוקול זה. אחרת, לחץ יתר הנגזר מעליית הטמפרטורה עלול לגרום לבקבוקי סרום להתפוצץ. כדי להכין inoculum מעכל אנאירובי, להוסיף 400 מיליליטר של מים מזוקקים לבקבוק ולהביא אותו לרתיחה.
מצננים אותו לכ-30 מעלות צלזיוס תוך שטיפה קבועה של חלל הראש בחנקן. מוסיפים כ -100 גרם של בוצה, נגזר מעכל אנאירובי, הקפדה על רשומות המסה המדויקת של הבוצה לקביעת דילול. החלף את חלל הראש של הבקבוק עם חנקן, וסגור אותו עם מחיצת גומי בוטיל.
לנער את הבקבוק במשך 30 דקות ב 120 סל"ד. תן חלקיקי בוצה גדולים יותר מים, ולאחר מכן להשתמש מזרק וקנולה כדי להסיר 5 מיליליטר של inoculum ולהזריק אותו לתוך בקבוק נסיוב מוכן בעבר. הדגירה את בקבוק הסרום מחוסן בטמפרטורה המתאימה לניסוי, הקפד לנקז את הלחץ יתר שנגרם על ידי עליית הטמפרטורה, כ 15 עד 30 דקות לאחר תחילת הדגירה.
כדי להעריך את ייצור והרכב הגז הביולוגי בזמן הדגירה, להקליט את הלחץ האטמוספרי הנוכחי ולהכין מד חום כדי להעריך את הלחץ בתוך הבקבוק. לנער את flasks ולהסיר 1 מיליליטר של גז חלל הראש באמצעות המזרק ואת canula. למדוד את מימן, חמצן, מתאן, וריכוז פחמן דו חמצני באמצעות כרומטוגרפיה גז.
השתמש 1 מיליליטר של נוזל מן הבקבוק כדי לפקח על הריכוזים של כל חומצות שומן גבוהות, על פי הוראות כתב היד, ולנקז את flasks מעל הלחץ לאחר החזרתו לטמפרטורה המתאימה. פרוטוקול זה שימש ליצירת ביו-חומרים מיניאטוריים המבצעים עיכול אנאירובי. טריפטופן, טירוסין, פנילאלנין, תמצית בשר, קזין נוספו ב 3 ריכוזים שונים, וייצור מתאן היה במעקב על פני תקופת דגירה 28 יום.
מתנוגנים הוצגו על ידי הקרנת האנזים השותף F420, שהוא נושא אלקטרונים במתנוגנזה, ומפגין פלואורסצנטיות כחולה-ירוקה עם ספיגה מקסימלית של 420 ננומטר. במקביל לניתוח גז, נותחו דגימות עבור חומצת שומן נדיפת, וריכוזי חומצת פניל במהלך תקופת הדגירה. ניתן ליישם שיטות ביולוגיות מולקולריות המכוונות לשפע של מיקרואורגניזמים ו/או הרכב של הקהילה המיקרוביאלית, בשלב מסוים של הניסוי, באמצעות ההליך המתואר.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה פשוטה לגידול מיקרואורגניזמים אנאירוביים המופקים ממתקן ביוגז. הוא מפרט את הכנת המצעים ואת הכמות של הגז וחומצות שומן נדיפות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביוטכנולוגיה
- מדעים סביבתיים
רקע
- אורגניזמים אנאירוביים אינם יכולים לשרוד בנוכחות חמצן.
- שמירה על תנאי אנוקסיה היא קריטית לגידולם.
- שיטה זו היא פשוטה וכלכלית עבור אוכלוסיות מיקרוביאליות מעורבות.
- ניתן להתאימה גם עבור תרביות טהורות.
מטרת המחקר
- להדגים פרוטוקול יעיל לגידול אנאירובי.
- לכמת את ייצור הביוגז ואת החומצות השומניות הנדיפות.
- לוויזואליזציה של מתגנוגנים במהלך התהליך.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת מצעים אנארוביים עם אינדיקטורים של REDOX.
- השהיה של בוצה ממכלים לעיכול אנארובי.
- ניטור הרכב הגז באמצעות כרומטוגרפיה של גזים.
- ניתוח חומצות שומן נדיפות במהלך הדגירה.
תוצאות עיקריות
- הושגה גידול מוצלח של מיקרואורגניזמים אנרוביים.
- ייצור ביוגז נוטרר לאורך תקופה של 28 ימים.
- ריכוזי מתאן וחומצות שומן נדיפות נמדדו כמותית.
- מתנוגנים הודגמו באמצעות טכניקות פלואורסצנציה.
מסקנות
- השיטה המתוארת יעילה לגידול של תרביות אנרוביות.
- היא מאפשרת להעריך את ייצור הביוגז ואת הרכב הקהילה המיקרובית.
- ניתן להתאים פרוטוקול זה למגוון יישומים מחקריים בתחום האנרובי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
גידול מהימן של מיקרואורגניזמים אנאירוביים קשירים הוא חיוני למחקר ופיתוח בביופארמה (biopharma R&D)&המיועד למיקוד במטבוליזם מיקרוביאלי, ביולוגיה סינתטית וחדשנות בתהליכים ביולוגיים. פרוטוקול זה מאפשר הכנה הדירה של מצעים נטולי חמצן וניטור כמותי של תפליטים מיקרוביאליים, ובכך תומך בגילוי מוקדם ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בזרימות עבודה מונעות על ידי אנרובים. יכולת ההרחבה וההסטנדרטיזציה של השיטה מקלות על שילובה בסריקות ברמת ארגון ובמסלולי מחקר תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה&ד׳
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מונחית-השערה של מסלולים מטבוליים אנאירוביים ותפקוד מיקרוביאלי.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי שמירה על תנאים אנוקסיים קפדניים עבור מטרות רגישות.
- מסייע בתיקוף תפקודי של קונסורציומים מיקרוביאליים הרלוונטיים לפיתוח תהליכים ביולוגיים וטיפולים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק הכנה סטנדרטית וניתנת לשחזור של מצעים אנאירוביים עבור בדיקות המשך.
- מבטיח מדידה כמותית של פלטי גזים ומטבוליטים לצורך הערכה מהימנה של תרכובות.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה במערכות אנאירוביות מגוונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר התאמה של תוצרי מיקרובים עם סממנים ביולוגיים תרגומיים כגון מתאן וחומצות שומן נדיפות.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני ביישומים המונעים על ידי אנרובים.
- מפחית את הסיכון בקידום מועמדים מיקרוביאליים באמצעות אספקת נתונים כמותיים חסונים.
שילוב זרימה ותהליכי עבודה
פרוטוקול זה מציב את הגידול האנאירובי כיכולת בסיסית, החל משלב הגילוי המוקדם, דרך זיהוי מועמדים מובילים ועד למחקר פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות אישור שליטה קפדנית ברמות החמצון והחמצגן.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור ניתוח גזים ומטבוליטים, ובכך תומכת במוכנות הבדיקה.
- אנליטיקה: משלבת כרומטוגרפיה של גזים ו-HPLC למדידה מדויקת של פעילות מיקרוביאלית ומוצרי מטבוליזם.
- מחקר תרגומי: מתאימה תוצרים מיקרוביאליים לנקודות סיום פרה-קליניות הרלוונטיות לפיתוח תרפויטי וביו-תהליכים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר עבור גידול אנאירובי בתוכניות מחקר ופיתוח (R&D).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מערכות אנרוביות.
- ערך תפעולי: מספק גידול ואנליזה אנרובית סטנדרטיים, ניתנים להרחבה ולשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון על ידי אספקת נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של נכסים המבוססים על אנרובים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוביולוגיה אנאירובית ובטכניקה אספטית.
- נדרשת גישה לבקבוקים אטומים לגזים, לאוטוקלאבים לכלי סגורים ולפלטפורמות אנליטיות (GC, HPLC).
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים כדי לשמור על תנאים אנוקסיים ועל הדירות התוצאות.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור זנים הרגישים מאוד לחמצן או עבור מערכות מודל חלופיות.
- פרוטוקולי בטיחות לטיפול בגזים בלחץ ובחנקן הם חיוניים.
