Name: מדידת פעילות השינואז בדגימות ביולוגיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 s
Description: למדו שיטה פשוטה למדידת פעילות השינואז בנוזלי ביולוגיים כמו נוזל שטיפת ברונכים וסרום. טכניקה זו מאפשרת ניטור יעיל של מחלות כמו מחלת גושה ומסייעת בהערכת יעילות הטיפול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך על ידי האגודה האמריקנית לריאות ופרסים האגודה האמריקנית לתרבות החזה LS. מחברים בכנות רוצה להודות ד ר ג ' ק אליאס וד ר צ'ון Geun לי על מתן זנים העכבר הטרנסגניים.

כל הליכי בעלי החיים בוצעו תחת פרוטוקול מאושר IACUC בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל.
1. אוסף דוגמאות עכבר
<ol><li>
הרדמה
	<ol>
<li>עכברים מורדם באמצעות קטמין ו xylazine (100 מ"ג/ק ג של קטמין ו 10 מ"ג/ק"ג של xylazine).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אוסף דגימות דם
	<ol>
<li>לאשר את עומק ההרדמה על ידי אי היענות לצביטה בבוהן.</li>
		<li>לפתוח בניתוח את חלל החזה. כדי לחשוף את הלב</li>
		<li>הכנס מחט 26.5 G לתוך החדר השמאלי ולאסוף דם לתוך מזרק. הערה: בדרך כלל, כ 0.5 – 1 מ ל של דם ניתן לקצור מן בריא 20-25 g העכבר.</li>
		<li>לאסוף את הדם בצינורות heparinized, עבור אוסף פלזמה, או צינורות שאינם heparinized עבור אוסף הנסיוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אוסף של נוזל ברונמכתשי (בל)
	<ol>
<li>כדי לאסוף את בל, לעשות חתך אנכי על הצוואר כדי לחשוף את קנה הנשימה.</li>
		<li>צינורית קנה הנשימה עם קטטר G 22 ולאבטח אותו בחוזקה באמצעות מחרוזת כדי למנוע דליפה מתוך האף של העכבר.</li>
		<li>באיטיות להזריק שתי מנות של מלוחים סטרילית מחסני פוספט (PBS, 0.75 mL כל אחד) לתוך הריאות דרך קנה הנשימה ולאחזר חזרה.</li>
		<li>מאגר המים ולשמור על קרח לניתוח נוסף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
. מעבד את הדגימות הביולוגי
	<ol>
<li>דגימת דם: טרי (פלזמה) או לאחר התרת קרישה עבור 4 שעות (סרום), צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות. קח את הסופרנאאנט והקפא לצורך אחסון או שימוש לצורך ניסוי.</li>
		<li>BAL: צנטריפוגה את המדגם ב 350 x g עבור 5 דקות. קח את הסופרנאאנט והקפא לצורך אחסון או שימוש לצורך ניסוי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. שיטת השינואז
הערה: המדע העומד מאחורי המנה הוא פשוט יחסית. מצע לא פלורסנט הוא ביקע על ידי chitinase הפעיל אנזימטי כדי לייצר מוצר פלורסנט, אשר נמדד אז כסמן עקיף של פעילות chitinase. השינוסים בתוך הדגימות לשבור את המצע 4-מתיונין-D-N, N'-diacetylchitobiose הנוכחי במאגר 1x McIlvain. מולקולת פלורסנט 4-מתיונין לומוליפראיל משתחררת. על ידי מדידת הקרינה הכוללת של כל באר, אנו משיגים מדידה מדויקת של השיאינטאז הפעיל בכל דוגמה. בגלל התמוטטות של כיצין ידי chitinase היא תגובה הידרוטית, מאגר לעצור, תערובת של 0.3 M גליצין ו NaOH (12.0 g/L ב-pH 10.6), מסיים את התמוטטות של כיסין על ידי יצירת סביבה כי הוא בסיסי מדי עבור האנזים לתפקד.
<ol><li>
הכן את הסובסטרטים, התקנים והפתרונות.
	<ol>
<li>. הכן מאגר מק מאגר McIlvain מורכב 0.1 M ציטראט ו 0.2 M פוספט ב-pH של 5.2. דלל את היחס של 1:1 עבור מאגר 1x McIlvain.</li>
		<li>מתמוסס הן 4-מתושלח-D-N, N'-diacetylchitobiose ו-4-מתיונין לומפרקסיל-D-N, N ', N '-triacetylchitotriose ב 1x מק מאגר לריכוז של 500 μM כל אחד. הערה: ניתן לאחסן פתרון מניות ב-20 ° צ' לשימושים נוספים; השמורים ביותר באליבטים.</li>
		<li>התמוססות תקן, 4-מתיונין, לריכוז של 0.1 מ"מ במאגר לעצור (התערובת של 0.3 M גליצין ו NaOH (12.0 g/L ב-pH 10.6)) כדי ליצור את הפתרון הרגיל מניות עקומת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ליצור ולוחית את פתרון העבודה.
	<ol>
<li>לשלב 1 x מאגר McIlvain ו-המצע כיאין 4-מתיונין-D-N, N'-diacetylchitobiose כדי ליצור את פתרון העבודה. עבור כל 10 דגימות, לערבב 100 μL של מצע עם 2.17 mL של מאגר 1x McIlvain. ראה טבלה 1 לחישובים נוספים בהתבסס על גודל המדגם. הערה: השתמש 4-מתיונין לפרקסיל-D-N, N ', N-triacetylchitotriose עבור דגימות אנושיות. בעוד מצעים ניתן לעבור על ידי או אנזימים האדם או העכבר, הם הוקצו עבור כל אחד או דגימות העכבר המבוסס על יעילות של מחשוף6.</li>
		<li>פיפטה 95 μL של פתרון עבודה לכל טוב של צלחת 96-באר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הוסף דגימות ביודגימה לפתרון העבודה.
	<ol>
<li>לאחר מכן, להוסיף 5 μL של דגימת הבדיקה (דם/BAL/רקמת ליפוסט/נוזל ביולוגי אחר) לכל טוב.</li>
		<li>ערבב את המדגם לתוך פתרון העבודה עבור התוצאות המדויקות והאמינות ביותר. הערה: יש להפעיל דגימות בכפילויות/טריליטים עם תשומת לב מיוחדת ששולמה לאפקטי קצה פוטנציאליים. כל הדגימות צריך להיות מחומם מראש כדי למזער את אפקט הקצה. כפי שהדוגמא כרוכה בתגובה בין כינויים במדגם ובמצע בפתרון העבודה, עדיף לעבוד במהירות יחסית כדי למזער את ההפרש בזמן בין כאשר המדגם הראשון מצופה והמדגם האחרון מצופה. מומלץ לעשות שפיפטה רב-ערוצי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מודטה ב 37 ° c.
	<ol>
<li>לכסות את הצלחת ולנער בקצרה (5 s).</li>
		<li>מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור 15 דקות. זה מאפשר את התגובה האנזימטית להתרחש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכן את העקומה הסטנדרטית.
	<ol>
<li>בעוד הדגימות הן מודדיקות, להכין דילול סדרתי של 4-מתיונין, רגיל המשמש לעתים קרובות בקביעת פלוורימטרית של פעילות אנזימים.</li>
		<li>לדלל את המניה של הפתרון הרגיל במאגר לעצור לריכוז של 5 μM.</li>
		<li>ביצוע סידרה של דילול כפי שמצוין בטבלה 2. הוסף את הרכיבים בסכום שצוין וערבב היטב. הערה: העקומה הסטנדרטית מסייעת להבטיח שדגימות מדודות יפלו בטווח הליניארי של העקומה הסטנדרטית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הפסק את התגובה באמצעות מאגר העצירה.
	<ol>
<li>הוסף 200 μL של מאגר העצירה לכל באר כדי לעצור את התגובה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
. הצלחת בסטנדרטים
	<ol>
<li>הוסף 300 μL של כל תקן באופן כפילויות על אותה צלחת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לקרוא את הצלחת באמצעות קורא פלואורומטרי.
	<ol>
<li>קרא את הצלחת בעירור של 360 ננומטר, ו פליטה של 455 ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
<ol><li>
הפחת את החסר
	<ol>
<li>ממוצע הערכים של מדלל התקן הכפול שאין להם 4 מתיונין. הפחת ערך זה מכל שאר הערכים שנרשמו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לקחת ממוצע של משכפל טכני ולהתוות את הסטנדרטים.
	<ol>
<li>ממוצע שני הקריאות לכל ריכוז וגרף הקריאה הממוצעת בריכוז. הערה: העלילה המתקבלת אמורה להיראות קווית ויש לה ערך R2 קרוב ל-1. אם לא, ייתכן שיהיה צורך לבצע שוב את הסטנדרטים ולקרוא שוב את הצלחת כדי להבטיח איכות של ניתוח נתונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לתקנן את ערכי הקריאה.
	<ol>
<li>צור קו התאמה מיטבית עבור נתוני התקנים המותווים. חלק את הפרטים של הדגימות לפי השיפוע של קו ההתאמה הטובה ביותר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
השוואת ערכים מקבוצת הבקרה ומקבוצת המשתנים.
	<ol>
<li>השתמש במבחן t או ב-ANOVA, עבור יותר משתי קבוצות, כדי לקבוע אם ההפרש בין קבוצות הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית. הערכים יקחו את היחידות nmol/mL · h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinases%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li>
<li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chitotriosidase+%28chitinase+1%29+under+normal+and+disease+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Epithelial+Biology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/</a> 1-9 (2012).</li>
<li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Chitin+and+Chitinase%2FChitinase-Like+Proteins+in+Inflammation%2C+Tissue+Remodeling%2C+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li>
<li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase%3A+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li>
<li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li>
<li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+Deficiency%3A+A+Mutation+Update+in+an+African+Population%5BTitle%5D)+AND+%22JIMD+Reports%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population.</a> JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).</li>
<li>Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+CHI3L-1+and+CHIT-1+Expression+in+Differentiated+and+Polarized+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages.</a> Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).</li>
<li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701(2015).</li>
<li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Research%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li>
<li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li>
<li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Fed+Clin+Res%22%5BJournal%5D)">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623</a> 78(1945).</li>
<li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li>
<li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li>
<li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li>
<li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li>
<li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li>
<li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li>
<li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li>
<li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ukrainian+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li>
<li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease%3A+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population%5BTitle%5D)+AND+%22eJIFCC%22%5BJournal%5D)">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li>
<li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutics+and+Clinical+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li>
<li>Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li>
<li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li>
<li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li>
</ol>

הפעילות chitinase התפתחה בתור בסמנים חשוב לניבוי חומרת המחלה, התקדמות המחלה, היעילות הטיפולית ואת הנוכחות של פתוגנים ספציפיים18. למרות שרבות מן התיאוריות הארוכות-היסוד בנוגע לתפקיד השינוסים לא הוכחו בניסויים בגיל19, מחקרים חדשים סיפקו תובנות חשובות לתפקיד השינוסים והצ'יטונים כמו חלבונים במחלות שונות2, 9,20.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא דרך פשוטה, מהירה ויעי...

כיאין הוא הרב ביותר הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ לאחר תאית, המשמש כמרכיב המבני העיקרי של מגוון של אורגניזמים כולל שלד חיצוני של חרקים, פטריות, שמרים, אצות; בעלי חוליות מסוימים כוללים גם את הצ1. השינוסים הם משפחה של אנזימים המסוגלים לשבור את הצ ונשמרים מאוד במהלך האבולוציה במינים הנעים מחיידקים ליונקים2,3. בנוסף על כוונון, יונקים יש גם chitinases כמו חלבונים אשר דומים chitinases ביכולתם לאגד כיטין אבל שונים כי הם חסרי יכולת אנזימטית לקליב את הצ'יטוס4.
למרות שצ וכיטיות כבר נחקרו מזמן-בחקירות שראשיתה בתחילת 1900-המוקד העיקרי היה בתפקידם בחרקים ובחסרי חוליות אחרים. למעשה, זה לא היה עד שנות ה-60 כאשר נמצאו בעלי חוליות בכלל. באמצעות שימוש בשיטה המבוססת על צ'יטיואז, הוצגו השינוסים שנמצאו במערכת העיכול של מספר בעלי חוליות, כולל לטאות ועופות שחורות – תצפית המשוערות להיות בשל צריכת האורגניזמים המכילים כגון חרקים5 .
ליונקים יש שני צורות אנזימליות הפעילות של chitinase: מיונקים חומציים (AMCase; הידוע גם בשם CHIT2 ו-CHIA) ו chitotriosidase (CHIT1)4. שני החלבונים הללו מסוגלים. לעשות הידרוליזינג כיגין עם זאת, CHIT1 הוא הפעיל אנזימטי יותר בבני אדם, שם כמעט כל פעילות chitinase נגזרת מ CHIT1. 4 בעכברים, הן Chit1 ו-amcase כמעט באופן שווה לתרום פעילות chitinase הכולל6. מצד שני, חלבונים כמו...
Chit1 מופרש בעיקר על ידי מקרופאגים והוא נחשב לעתים קרובות להיות תגובה חיסונית כאשר המכיל פתוגנים המכילים7. האנזים הוכח גם להיות מעורב בהבשלה של מונוציטים לשני M1 ו M2 מקרופאג תת, גם ללא נוכחות של המצע כיטין8. יתר על כן, זה עשוי להיות גם מעורב בהבשלה של תאים חיסוניים אחרים כולל T מסייע סוג 2 (Th2) תאים ו אאוזינופילים-כפי שהוצג להיות במקרה של זיהום ריאות cryptococcal9. מחקרים אלה מצביעים על תפקיד מורכב של כביסים במערכת החיסונית.
בשנים האחרונות, Chit1 רמות נמצאו לשמש ביוארקר חשוב של התקדמות עבור מעל 40 מחלות אנושיות שונות, כולל מחלות אחסון lysoזומלית, מחלות זיהומיות, מחלות נשימה, מחלות endocrinological, וכלי דם מחלות, מחלות נוירולוגיות ואחרות (נבדקו10). ברבים ממחלות אלה, רמות של Chit1 הם מנבא חזק של חומרת המחלה ואת האפקטיביות הטיפולית10.
כמו chitinases השיגו מוניטין כמו בסמנים עבור מצבים רפואיים רבים כולל מחלת gaucher, כלים בחני פותחו כדי להקל על בדיקות של נוכחות chitinases. שיטות מבוגרות יותר כוללות הליך של Schales, פרוטוקול המותאם מבדיקת הגלוקוז בדם, ואת 3, 5 dinitרוזלין חומצה (DNS) שיטה. עם זאת, שיטות אלה הן לעתים קרובות רגישות הזמן ומבחינה טכנית קשה11. ההליך עבור שני בדיקות אלה דורש הפחתת חמצון אורגניים, ferricyanide במקרה של ההליך של Schales למשל, הפקת שינוי צבע כי ניתן רק למדוד spectrophotometrically. בנוסף, שתי הבדיקות כרוכות בחימום או בצעד רותח שהוא זמן רב והכרחי לצבע לפתח12,13.
המתואר כאן הוא שיטה מהירה ופשוטה פלוורימטרית כדי לקבוע רמות של צ'יטאנאז בדגימות של ממיונקים14,15. שניים מהדגימות המשמשות כאן כוללות ששטיפה סרום וברונשיים (BAL); פעילות chitinase נמדדה גם בדגימות חלב ושתן, וניתן לבצע את הטכניקה בסוג זה של דגימות כמו גם בכל נוזל ביולוגי אחר16,17.

<table><tbody><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Standard: נפוץ במבחנים פלורימטריים לקביעת פעילות האנזים</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc2</td><td>Sigma</td><td>M9763</td><td>מצע כיטינאז פלואורסצנטי לשימוש בדגימות עכברים</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc3</td><td>Sigma</td><td>M5639</td><td>מצע כיטינאז פלואורסצנטי לשימוש בדגימות אנושיות</td></tr><tr><td>חומצת לימון-מונוהידראט</td><td></td><td></td><td>לשימוש ב-McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td>לשימוש ב-Stop Buffer בריכוז של 0.3 M</td></tr><tr><td>Na2HPO4xH2O</td><td></td><td></td><td>לשימוש ב-McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td></td><td>לשימוש ב-Stop Buffer בריכוז של 12 גרם/</td></tr><tr><td>ליטר לוחית ראייה: לא סטרילי, לא מטופל שחור 96 צלחת באר</td><td>4titude</td><td>4ti-0224</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת פעילות השינואז בדגימות ביולוגיות

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

השינוסים הם האנזימים. שקליב כיגין גם בהיעדר כלאין, ממאנים יש כמויות משמעותיות של השטיות הקיימות בגוף, כולל בבסיס. התפקיד המדויק של chitinase אינו ידוע, אולם זה היה האמין לשחק תפקיד חשוב בעיכול והגנה מארחים נגד המזון המכיל מזון פתוגנים, בהתאמה. העבודה האחרונה, כולל שלנו, הראה תפקיד חשוב של מחלת המין הצ והחלבונים בחסינות המארחת ומחלות אלרגיות. חשוב מכך, פעילויות chitinase לשמש בסמנים חשובים של חומרת המחלה במגוון רחב של מחלות כולל סוג 2 מחלות דלקתיות כגון אסטמה פיברוזיס ריאתי. באופן דומה, חולים עם הפרעות גנטיות כמו מחלת Gaucher יש משמעותית רמות chitinase גבוהות, אשר לא רק לתאם עם חומרת המחלה אלא גם לשמש בסמנים אמין עבור יעילות טיפולית. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את הדרך פשוטה, מהירה, וישירה כדי למדוד פעילות chitinase בדגימות בל או סרום של עכברים והוא יכול להיות מותאם באופן נרחב לנושאים בני אדם ואורגניזמים מודל אחרים בשל הטבע שימור מאוד של אנזימים.

התוצאות המוצגות כאן הם ממחקר מדידת הפעילות chitinase בסרום ודגימות BAL של סוג פראי (C57BL/6) ו Chit1 העכברים הטרנסגניים (על C57BL/6 רקע) כי overexpress הגן Chit1 על מקדם דוקסיציקלין. הנתונים שלנו מראים כי שני הנסיוב וגם הדגימות בל יש לגילוי פעילות chitinase בתוכנית הבסיסית 698.2 ± 189.9 nmol/mL · h ו 485.7 ± 114 nmol/ml · h, בהתאמה. ביטוי יתר של הגן Chit1 באמצעות דוקסיציקלין במים לשתייה עבור 4 שבועות הביא העלאת הפעילות של chitinase כי נצפתה בשני באל (4,575 ± 673.8 nmol/mL · h, p = 0.003) ו סרום 1556 ± 251.2 nmol/mL · h, ...

מוצג כאן היא שיטה פשוטה למדוד פעילות chitinase בנוזלים ביולוגיים כגון שאיפה ברונבשיים או סרום.

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

שיטה זו מאפשרת דרך יעילה יותר לכמת פעילות כיטין בדגימות ביולוגיות. פעילות Chitinase הוכח לשמש סמן טוב לאבחון ויעילות טיפולית בתנאים ומחלות רבות. שיטות קודמות למדידת פעילות chitinase היו לעתים קרובות זמן רב וקשה לבצע, שתי הבעיות נפתרו על ידי ההתמדה המוצגת כאן.טכניקה זו תסייע להגשים את chitinases הפוטנציאלי יש כסמן אבחון וטיפולי על ידי הפיכת קל יותר למדוד פעילות chitinase;למשל, זה יכול לשמש כדי לפקח על הטיפול במחלת גושה כי פעילות chitinase הוכח לרדת במהלך טיפול יעיל. התחל בהכנת מצעים, תקנים ופתרונות להנחיה. הכן חיץ 1x McIlvain על פי הוראות כתב היד ולהשתמש בו כדי לדלל מצעים כיטין ל 500 micromolar כל אחד.ממיסים 4-methylumbelliferone, התקן, לריכוז של 0.1 מילימולאר במאגר עצירה כדי ליצור פתרון מלאי עקומה סטנדרטי. עבור כל 10 דגימות, לערבב 2.17 מיליליטר של חיץ McIlvain 1x עם 100 microliters של מצע כיטין כדי ליצור פתרון עובד, ולאחר מכן פיפטה 95 microliters של פתרון העבודה לתוך כל באר של צלחת 96 באר. הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של דגימת הבדיקה לכל באר וערבבו אותה בת פתרון העבודה.מכסים את הצלחת ומנערים אותה במשך חמש שניות, ואז דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לאפשר את התגובה האנזימטית להתקיים. בינתיים, לדלל את פתרון המלאי של 4-methylumbelliferone כדי להפוך פתרון תקן עבודה חמישה מיקרומולרים וליצור עקומה סטנדרטית על ידי הכנת סדרה של דילולים על פי כתב היד. התחל עם ריכוז של חמישה מיקרומולרים ומערבבים כל דילול היטב.לאחר הדגירה, להוסיף 200 microliters של חיץ עצירה לכל באר כדי לעצור את התגובה. הוסף כפילויות 300 מיקרוליטר של כל תקן לאותה צלחת, ולאחר מכן לקרוא את הצלחת בגירוי של 360 ננומטר ו פליטה של 455 ננומטר. פרוטוקול זה שימש בהצלחה למדידת פעילות chitinase lavage ברונכואלוולאר ונוזל סרום מסוג פראי ועכברים מהופנטים יתר על המידה.הבדיקה מאשרת כי לחץ יתר של הגן CHIT-1 בעכברים גורם לפעילות צ'יטינאז מוגברת. עקומה סטנדרטית שימשה כדי לקבוע chitinase מבוסס על פלואורסצנטיות של הדגימות. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת הניסיון הראשון של הפרוטוקול הוא להוסיף את הדגימות במהירות וביעילות האפשרית תוך ערבוב יסודי.כאשר אתה מתחיל לראשונה, זה עשוי להיות מועיל לעשות פחות דגימות לכל ריצה כדי להבטיח דיוק במדידות, עקב תקופת דגירה קצרה יותר.

measurement-of-chitinase-activity-in-biological-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים עלות נמוכה, גבוה שיטת התפוקה למסך לפעילות endoglucanase פטרייתי...

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

סרטון זה מדגים בדיקה לסינון אנזימים יעילים בפירוק רב-סוכרים מורכבים בביומסה צמחית באמצעות ביומסה כרומוגנית בלתי מסיסה או ICB. האנזימים מבצעים הידרוליזה של ICB כדי לשחרר אוליגוסכרידים מסיסים הקשורים לצבע, ופעילות האנזים מוערכת על ידי ניתוח קולורימטרי של תוצר התגובה.

בדיקת אנזימים כרומוגנית בלתי מסיסה מבוססת ביומסה: בדיקה להערכת פעילות הפירוק של אנזימים מפרקים ביומסה צמחית

סרטון זה מדגים מדידה חוץ גופית של פעילות אנזימים עבור α-גלקטוזידאז A וחומצה α-גלוקוזידאז בדגימות באמצעות מצעים סינתטיים 4-Methylumbelliferyl.

מדידה חוץ גופית של פעילות האנזים α-גלקטוזידאז A וחומצה α-גלוקוזידאז

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לסינון ואפיון מהיר של אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות ובדיקת שחרור הצבע משתמשות במצעי חיידקי מטרה להערכת פעילות אנזימטית איכותית וכמותית.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

מתואר מבחן תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים. ערכת בדיקה מוכנה לשימוש מרובה זו מורכבת ממצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) שנבחרו מראש ומצעי Chromogenic B iomass (ICB) מורכביםI בלתי מסיסים. אנזימי המטרה הם אנדו-אנזימים ופרוטאזות מפרקים רב-סוכרים.

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לכימות פעילות ATPase במבחנה. ניתן לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה על סמך רמת הפעילות והדרישות עבור ATPase מטוהר נתון.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כרומטין immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מ שמרים ניצני האפייה. Immunoprecipitated DNA משמש לאחר מכן PCR כמותי לחקור את השפע ואת לוקליזציה של שינויים post-translational היסטון ברחבי הגנום.

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

אנו מתארים שיטה מבוססת אגר שונה שנועדה לכמת את ההשפעות האנטי פטרייתיות של מוצרים שמקורם בצמחים. ניתן להעריך הן תרומות תנודתיות והן תרומות לא תנודתיות לפעילות האנטי-פטרייתית באמצעות פרוטוקול זה. בנוסף, ניתן למדוד את היעילות נגד פטריות בשלבים התפתחותיים מרכזיים במערך ניסיוני יחיד.

מדידת פעילות אנטי פטרייתית נדיפה ולא נדיפה של מוצרי ביו-בקרה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקבלת נתונים כמותיים על הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים ותרכובות אחרות, כגון חומרים אנטי-פטרייתיים בעלי מולקולות קטנות, כנגד קנדידה אלביקנס. השימוש בו בצפיפות אופטית במקום לספור יחידות יוצרות מושבה כדי לכמת עיכוב גדילה חוסך זמן ומשאבים.

כימות הפעילות האנטי פטרייתית של פפטידים נגד קנדידה אלביקנס

במאמר זה מוצגות שיטות אקוטוקסיקולוגיות סטנדרטיות להערכת סמנים ביולוגיים במינים ניאוטרופיים של אנורן. באופן ספציפי, מאמר זה מפרט מספר מתודולוגיות בקני מידה שונים של הערכה אקוטוקסיקולוגית, כגון הרמה הגנטית, ההיסטולוגית-תאית, הביוכימית, המורפולוגית והאינדיבידואלית.

מתודולוגיות אקוטוקסיקולוגיות להערכת סמנים ביולוגיים בקני מידה שונים באנורנים ניאוטרופיים

למדו שיטה פשוטה למדידת פעילות השינואז בנוזלי ביולוגיים כמו נוזל שטיפת ברונכים וסרום. טכניקה זו מאפשרת ניטור יעיל של מחלות כמו מחלת גושה ומסייעת בהערכת יעילות הטיפול.

מדידת פעילות השינואז בדגימות ביולוגיות

גלה סרטונים נוספים