Name: טכנולוגיית תאים באנקפסולציה להעברת מוצרים ביולוגיים לעין העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: למדו שיטת מיקרו-אנקפסולציה באלגינט לתאי אפיתל רטינלי להעברת תרופות ביולוגיות לעין העכבר. שיטה זו מאפשרת שחרור ממושך של תרופות תוך מזעור תגובות חיסוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר היה נתמך בחלק על ידי מענקים הוענק B. R. על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01EY019320), המחלקה לענייני ותיקי (RX000444 ו BX003050), ואת הקרן דרום קרוליינה SmartState.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בעלי חיים במחקר אופטלמולוגי וחזון ואושרו על ידי האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה טיפול בעלי חיים ועדת השימוש תחת מזהה פרוטוקול 00399.
1. תרבית תאים
<ol><li>ליצור תאים האפיתל האדם פיגמנט הרשתית (arpe-19) קו התא באופן בלתי נשכח את הגן של הבחירה על פי פרוטוקולים שפורסמו14,15.</li>
	<li>לשמור על התאים ב-בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העוברי (FBS).</li>
	<li>מודאת התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
	<li>החליפו את המדיום כל 2 – 3 ימים.</li>
	<li>מעבר לתאים לאחר שהגיע 70% – 80% זרימה באמצעות הליכים סטנדרטיים התרבות רקמה.</li>
</ol>2. עטיפת תא
<ol><li>מערבבים נתרן קילוף פלסטיצידיות עם (DI) מים לריכוז הסופי של 2% w/v ולטהר על ידי סינון עם מסנן מזרק סטרילי 0.2 יקרומטר.</li>
	<li>הכן את התאים להיות מעורבים עם הפתרון קילוף פלסטיצידיות על ידי טריזיציזציה, תפרידו, ושטיפת אותם עם 10 מ"מ hepes מלוחים באגירה פתרון (pH = 7.4). באמצעות התקן האטה, לספור את התאים ולהתאים את הריכוז התא הסופי כדי 1 x 106 בפתרון קילוף פלסטיצידיות. הערה: תהליך עטיפת הכיסוי צריך להיות מופעל בתוך מכסה מחוטא.</li>
	<li>טען ~ 300 μl ליטר של קילוף פלסטיצידיות ושילוב תאים לתוך מזרק של 3 מ ל ולצרף אותו משאבת מזרק. הפתרון יישאב באמצעות מחט של 30 גרם בוטה לאמבט המים סטרילי ממוקם בגביע 50 mL סטרילי מתחת לקצה המזרק ב 7 מ"מ עבור מחט למרחק ריסוס אמבט.</li>
	<li>האמבטיה מכיל נפח של 40 mL של מלוחים 10 מ"מ HEPES באגירה המכיל 100 מ"מ סידן כלוריד (CaCl2) ו 0.5% w/v פולי-l-האורלך (אש ף). אש ף היא ציפוי פולימרי משני שניתן להשמט או לשנותו בהתאם לצורכי החוקר.</li>
	<li>להתאים את קצב מתח וזרימה ולשמור אותם קבוע במהלך תהליך אנקפסולציה ב 60 mm/h שיעור זרימה ו 6.0 kV מתח ראשוני כדי לייצר בגודל מיקרוקפסולות של ~ 150 μm.</li>
	<li>חבר את הקליפ של חוט אנאודה (אדום) של מחולל מתח גבוה מחט המחט ולחבר את התמונה הקרקע (שחור) לחוט הנחושת כי הוא שקוע באמצע אמבט המים. קבוצה אחת של קילוף פלסטיצידיות + התערובת התא (1 mL) לוקח כ 30 דקות כדי להכין את התאים כמוסות (כ 25,000 microcapsules).</li>
	<li>לשטוף את מיקרוקפסולות שנוצרו המכילים תאים עם פתרון כביסה (10 מ"מ HEPES מלוחים באגירה המכילה 1.5 mM CaCl2, pH = 7.4) פעמיים. אין להשתמש ב-PBS לכביסה.</li>
	<li>מודטה את התאים שעברו אנקפסולציה עם 10% FBS שנוספו מדיה DMEM בתוך מחולל לחות ב 37 ° צ' ו 5% CO2. הערה: מכשירים לעיבוד כימוס מתוארים באיור 1.</li>
</ol>3. אישור שאנקפסולציה אינה משפיעה על הכדאיות בתאים
<ol><li>לאחר הדגירה של תאים שעברו אנקפסולציה עבור 24 שעות במדיה, להכין מדגם קטן של 500 μL (~ 30 microcapsules) עבור כתמים.</li>
	<li>שטוף את מיקרוקפסולות 2x באמצעות פתרון כביסה (10 מ"מ HEPES מלוחים באגירה המכילה 1.5 mM CaCl2) ולהכתים אותם עבור הכדאיות חי מת באמצעות ערכת שיטת חיים/מת.</li>
	<li>הכינו תערובת מכתיבת של calcein AM (acetoxyמתיל) ואתידיום הומודימר -1 בריכוזים סופיים של 2 μM ו-4 μM, בהתאמה.</li>
	<li>הוסף 2 מ ל של תערובת מכתים את התאים שעברו כימוס עבור 30 – 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>עם שאיפה זהירה, מכתים את הפתרון כתמים ולשטוף את microcapsules 2x עם פתרון כביסה. השתמש במערכת מיקרוסקופ פלורסנט כדי להתבונן ולצלם את התאים שעברו אנקפסולציה. הערה: תיעוד האנקפסולציה מתואר באיור 2.</li>
</ol>4. אישור כי קפסולות הם הגודל המתאים עבור משלוח ומשלוח של הביוג'יק
<ol><li>זריקות מיוחדות בעין העכבר מבוצעות בדרך כלל עם המחט 27 G בוטה-עצה (הקוטר הפנימי של 210 μm) מצורף מזרק 2.5 μL המילטון.</li>
	<li>צור קפסולות החל מ 100 כדי 200 μm, לדלל אותם במדיה ללא סרום, ובזהירות למשוך אותם לתוך מזרק המילטון. Pbs אינו רכב מתאים, כמו קפסולות קילוף פלסטיצידיות להתמוסס ב-PBS.</li>
	<li>לאט להוציא 1 μL טיפות המכיל קפסולות על שקופית מיקרוסקופ ולקבוע את השלמות שלהם באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר זקוף.</li>
	<li>כוונן את גודל הקפסולה (ראה שלב 2.3) על-ידי התאמת קצב מתח וזרימה בהתאם. מיקרוקפסולות קטנות יותר מיוצרות בצורה לא לינארית על ידי הגדלת מתח ושיעור הזרימה היורדת מעט8. בידינו, קפסולות של 150 יקרומטר בקוטר הוכח להיות מתאים ביותר. התאמה של גודל קפסולה תלויה גם לשמור על קבוע ריכוז קילוף פלסטיצידיות תוך שינוי הפרמטרים האחרים.</li>
	<li>שמור על קבוצה נפרדת של תאים בכמוסות של הגודל המתאים במדיום ללא סרום, כדי לקבוע את כמות ההפרשה הביולוגית הרצויה. השתמש באליאס רגיש או בכתמים מערביים כדי לקבוע את ריכוז התכשירים הרפואיים ב-supernatant.</li>
	<li>לקבוע את הכמות הנדרשת של קפסולות כי צריך להיות מוזרק מבוסס על PK/PD הידוע (פרמקוקינטיקה/פרמקודינמיקה) של הריפוי. בידיים שלנו, 10 קפסולות לכל עין העכבר הוכיחו להיות יעיל ביותר.</li>
</ol>5. משלוח כמוסה לתוך ויטאוס העכבר
<ol><li>לבצע זריקות אמיתיות. בעזרת מיקרוסקופ מבתר ראה איור 3 להגדרה כירורגית וחומרים המשמשים במהלך הפרוצדורה. פרוטוקול מפורט לזריקות מיוחדות ניתן למצוא במקום אחר16.</li>
	<li>עכברים מורדם על ידי הזרקה תוך הצפק של xylazine וקטמין (20 מ"ג/ק"ג ו 80 מ"ג/ק"ג) או הרדמה מועדפת אחרים שאושרו על ידי הוועדה הספציפית לטיפול בבעלי חיים ושימוש. ודא את עומק ההרדמה המתאים באמצעות צביטה בבוהן17.</li>
	<li>להתרחב תלמידים העכבר עם phenylephrine HCL (2.5%) ו אטרופין גופרתי (1%) כדי לאפשר ניראות טובה של החדר האינדקטור ולמרוח ג'ל עין סיכה על העיניים כדי לשמור אותם מנוזלים במהלך ההליך.</li>
	<li>לנקב את sclera ב לימבוס עם מחט של 26 G כמו חור המדריך, וודא כי 1) המחט היא בזווית 45 ° עם העין והשולחן 2) קצה משופע מכוון כלפי מעלה כדי למנוע חדירה של העדשה.</li>
	<li>בזהירות להזריק את כמוסות באמצעות המחט 27 G בוטה-עצה מוצמד מזרק המילטון בזווית 45 ° תחת בדיקה חזותית, והקפד להימנע מלגעת העדשה עם המחט. פציעה של העדשה תוביל להיווצרות קטרקט. הקפסולות צריך להיות גלוי בתוך המיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופ מבתר (איור 4A).</li>
	<li>לאחר הנסיגה של המחט, לטפל באתר ההזרקה עם משחות אנטיביוטיות neomycin ו polymyxin B סולפטים בנוסף למשחה אנטיביוטית בטיפול אופטלמולוגי.</li>
	<li>החלת להוריד פתרון אופטלמולוגי (2.5%) לשתי העיניים כדי למנוע מהקרניות להתייבש בתקופת ההחלמה.</li>
	<li>הניחו את העכבר על משטח חימום שנערך ב-37 ° c והצג עד הערה מלאה.</li>
	<li>הזרקה מוצלחת של כפולת arpe-19 תאים צריך לחשוף את הנוכחות של כמוסות שלמות בחדר אינדקטור של העכבר עם כמויות זעירות בלבד של פסולת בעת הדמיה של העין על ידי טומוגרפיה אופטית קוהרנטית או שיטות אחרות (איור 4b).</li>
	<li>עין העכבר מוזרק, לאחר כמה ימים של התאוששות עקב הניתוח, הוא כעת מוכן הפרדיגמה הניסיונית בהישג יד. הערה: הגדרת כירורגית ותיעוד של כמוסות בעין מתוארות באיור 3 ובאיור 4, בהתאמה.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+systems%3A+entering+the+mainstream%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drug delivery systems: entering the mainstream.</a> Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).</li>
<li>Tonnesen, H. H., Karlsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+in+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+and+Industrial+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Alginate in drug delivery systems.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).</li>
<li>Vilos, C., Velasquez, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+strategies+based+on+polymeric+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic strategies based on polymeric microparticles.</a> Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).</li>
<li>Gasperini, L., Mano, J. F., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+polymers+for+the+microencapsulation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Natural polymers for the microencapsulation of cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (100), 20140817(2014).</li>
<li>Gasper, D. P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasper%2C+DPR+%22Novel+strategy+to+produce+a+drug+delivery+system+for+skin+regeneration.+Uma+nova+estrat%C3%A9gia+para+produzir+um+dispositivo+para+entrega+de+f%C3%A1rmacos+que+ser%C3%A1+usado+na+regenera%C3%A7%C3%A3o+da+pele%22">Novel strategy to produce a drug delivery system for skin regeneration. Uma nova estratégia para produzir um dispositivo para entrega de fármacos que será usado na regeneração da pele</a>. , (2012).</li>
<li>Huang, S., Fu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+materials-based+cell+and+drug+delivery+systems+in+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration.</a> Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).</li>
<li>Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+characterization+of+pDNA-loaded+alginate+microspheres+for+oral+administration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).</li>
<li>Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polymeric+microcapsules+containing+a+low+molecular+weight+peptide+for+controlled+release%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).</li>
<li>Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+encapsulation+of+water-soluble+protein+with+polylactide.+I.+Effects+of+formulations+and+process+on+morphology+and+particle+size%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microencapsulation%22%5BJournal%5D)">Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size.</a> Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).</li>
<li>Gryshkov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+high+voltage+alginate+encapsulation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells.</a> Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).</li>
<li>Thanos, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+secretion+of+ciliary+neurotrophic+factor+to+the+vitreous%2C+using+the+encapsulated+cell+therapy-based+NT-501+intraocular+device%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device.</a> Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).</li>
<li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-year+intraocular+delivery+of+ciliary+neurotrophic+factor+by+encapsulated+cell+technology+implants+in+patients+with+chronic+retinal+degenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).</li>
<li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term%2C+sustained+intraocular+delivery+of+a+VEGF+antagonist+using+encapsulated+cell+technology+implant+for+the+treatment+of+choroidal+neovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455(2012).</li>
<li>Annamalai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+Cell+Technology-Based+Delivery+of+a+Complement+Inhibitor+Reduces+Choroidal+Neovascularization+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Visual+Science+Technology%22%5BJournal%5D)">Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model.</a> Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3(2018).</li>
<li>Alge, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Pigment+Epithelium+Is+Protected+Against+Apoptosis+by+%CE%B1B-Crystallin%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by αB-Crystallin.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).</li>
<li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), 313(2007).</li>
<li>Jove Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Holz, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+Safety+of+Lampalizumab+for+Geographic+Atrophy+Due+to+Age-Related+Macular+Degeneration%3A+Chroma+and+Spectri+Phase+3+Randomized+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials.</a> JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).</li>
<li>Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+inhibition+as+a+therapeutic+strategy+in+retinal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 19 (4), 335-342 (2019).</li>
<li>Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Non+Membrane-Targeted+Human+Soluble+CD59+Attenuates+Choroidal+Neovascularization+in+a+Model+of+Age+Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration.</a> PLoS ONE. 6 (4), e19078(2011).</li>
<li>Vincent, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+combination+PDGF+%2F+VEGF-antagonist+ECT+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290(2013).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+treatment+of+geographic+atrophy+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).</li>
<li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+for+macular+telangiectasia+type+2%3A+results+from+a+phase+1+safety+trial%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial.</a> American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).</li>
<li>Birch, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+trial+of+ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שיטת עטיפת התאים הזאת מהירה וקלה יחסית לביצוע; עם זאת, יש לזכור נקודות מסוימות כדי להשיג תוצאות מדויקות של הזרם. יש לשמור על התאים בתרבות בצלחת פטרי לפני כימוס ומוחזק בשטף מתאים. כימוס יש לבצע במכסה אוורור נאות עם זרימת אוויר מוסדר, אם אפשר. חזק מדי של זרם אוויר יכול להשפיע על היווצרות כמוסה, במיוחד בניסויים ארוכי טווח. כלים ופתרונות סטריליים הם קריטיים לתחזוקה ארוכת טווח של תאים בתוך הקפסולה.
כיום, חי מת מכתים משמש ככלי confirmatory כדי לקבוע את הכדאיות של תאים בתוך הקפסולות. מספר התאים לכל כ...

טיפולים מבוססי תא מייצגים טכניקות ביולוגיות מהפכנית שהוחלו רבות ברפואה. לאחרונה, הם הוחלו בהצלחה בטיפול במחלות ניווניות, מחלות עיניים, סרטן. תרפיות בתאים מכסות מגוון רחב של שדות מהחלפת תאים לאספקת סמים, ופרוטוקול זה מתמקד במקרה האחרון. מיקרו כמוסות מתכלות (MC) הראו יעילות כמערכת משלוחים, והם נעשים בשימוש נרחב בתחום הביו-רפואי. Alginate שימש במיקרוכימוס בשל תהליך הג הפשוט שלה, biodegradability, biocompatibility מעולה, ויציבות תחת vivo תנאים1,2,3,4.
שיטת ההתזה, כטכניקת מיקרועטיפת מיקרו, הייתה מנוצל בהצלחה לכשלי פפטידים וחלבונים באמצעות קילוף פלסטיצידיות (פולימר בסיס) ו פולי-l-האורלך (משני פולימר ציפוי). שני הפולימרים מצויים באופן טבעי ומשמשים בביותאימות שלהם5,6,7. עם זאת, האתגר העיקרי בטיפולים מבוססי התא הוא דיכוי של מערכת החיסון המארחת כדי למנוע תופעות לוואי הנגרמות על ידי תרופות מדכאים חיסוני. החדירות של קילוף פלסטיצידיות microcapsules נחשב תכונה מתאימה עבור עטיפת התאים, אשר מאפשר דיפוזיה של חומרים מזינים, פסולת, וגורמים טיפוליים לתוך ומחוץ לתאים תוך הסוואה אותם תגובה חיסונית מארח8,9,10.
בעין, תאים כימוס שימשו ניסויים קליניים למסירה מתמדת של מוצרים ביולוגיים (כלומר, גורמי גדילה11,12 ו פקטור גדילה האנטוניסטים13) לטיפול רטיניטיס פיגמנטוזה או ניוון מקולרי הקשורות לגיל. מטרות אחרות כגון מעכבי המשלים14 הם גם בחקר כרגע הגדרות טרום קלינית.

<table><tbody><tr><td>מזרק 3 מ"ל</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם 1 אינץ' מחט קהה</td><td>SAI טכנולוגיית עירוי</td><td>B30-100</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אלגינית מלח נתרן, מאצות חומות</td><td>Sigma</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>Atropine Sulfate תמיסת עיניים (1%)</td> <td>Akorn</td><td>NDC 17478-215-15</td><td>להרחבת אישונים</td></tr><tr><td>BD 1 מ"ל מזרק 26 גרם x 3/8 (0.45 מ"מ x 10 מ"מ)</td> <td>בקטון, דיקינסון ו החברה</td><td>DG518105 500029609 REF 309625</td><td>ליצירת חור ההנחיה</td></tr><tr><td>סידן כלורי, נטול מים, גרגירי</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal Tears</td><td>Alcon</td><td>NDC 0078-0429-47</td><td>לשימון העיניים בזמן הרדמה</td></tr><tr><td>Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (סטרילי)</td><td>Altaire Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 59390-182-13</td><td>לשימון העיניים בזמן הרדמה</td></tr><tr><td>קצה מחט/מזרק המילטון: 27 גרם, רכזת קטנה RN NDL, אורך קוסטום (12 מ"מ), סגנון נקודה 3, 6/PK</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>לאספקה תוך זגוגית של כמוסות</td></tr><tr><td>מזרק המילטון: 2.5 ומיקרו; L, דגם 62 RN SYR, NDL נמכר בנפרד</td><td>המילטון</td><td>7632-01</td><td>לאספקה תוך-זגוגית של כמוסות</td></tr><tr><td>מאגר HEPES, 1 M</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP299100</td><td></td></tr><tr><td>מחולל מתח גבוה</td><td>ESD EMC Technology</td><td>ES813-D20</td><td></td></tr><tr><td>חי/מת כדאיות/ציטוטוקסיות</td> ערכת <td>Thermofisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornithine hydrochloride, 99%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A12111</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin ו-Polymyxin B Sulfates ומשחת עיניים דקסמתזון</td><td>SANDOZ</td><td>NDC 61314-631-36</td><td>אנטיביוטיקה למניעת זיהום לאחר הזרקה תוך זגוגית</td></tr><tr><td>תמיסת עיניים פנולפרין הידרוכלוריד (2.5%)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-201-15</td><td>להרחבת אישונים</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>מזרק סטרילי מסננים, 0.2 &mu; m</td><td>VWR</td><td>28143-312</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>GRASEBY</td><td>MS16A</td><td></td></tr></tbody></table>

טכנולוגיית תאים באנקפסולציה להעברת מוצרים ביולוגיים לעין העכבר

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Therapeutics הנוכחי רבים תחת פיתוח עבור מחלות של הקוטב האחורי של העין הם מוצרים ביולוגיים. תרופות אלה צריך להיות מנוהל לעתים קרובות, בדרך כלל באמצעות זריקות אמיתי. תאים בעלי כימוס המבטאים את הביוג'יק של הבחירה הופכים לכלי לייצור חלבון מקומי ושחרור (למשל, באמצעות אספקת סמים לטווח ארוך). בנוסף, מערכות כימוס לנצל חומרים חדירות המאפשרים דיפוזיה של חומרים מזינים, פסולת, וגורמים טיפוליים לתוך ומחוץ לתאים. הדבר מתרחש בזמן שהוא מסווה את התאים מהתגובה החיסונית של המחשב המארח, תוך הימנעות מצורך בדיכוי מערכת החיסון המארחת. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באלגיאט כפולימר במיקרומניפולציה בשילוב עם שיטת ההתזה כטכניקת מיקרו-כימוס. ARPE-19 תאים, הנובעים באופן ספונטני קו התאים RPE האנושי, כבר בשימוש ניסויים תא לטווח ארוך בגלל הפונקציונליות שלה במשך החיים, והוא משמש כאן לעטיפת משלוח של קפסולות לעיני העכבר. כתב היד מסכם את הצעדים למיקרועטיפת תאים, לבקרת איכות ולמסירה בעינית.

ARPE-19 תאים הם הונצח באופן ספונטני RPE תא האדם כי כבר הוכח להיות קלה כימוס והישרדות לטווח ארוך עם השרשה של קפסולות לתוך העין. כלים לעטיפת מסגרות האלגינג מוצגים באיור 1. במחקר זה, הוכח כי על כימוס ב קילוף פלסטיצידיות, התאים בקפסולות קילוף פלסטיצידיות אושרו על ידי דימות שדה בהיר (איור 2a). חי-מת בחני בוצעו על התאים בתוך הקפסולות, הוכחת 90% הכדאיות שלאחר כימוס (איור 2b). כדי להבטיח הכדאיות ארוכת טווח של התאים בתוך קפסולות, קפסולות היו...

מוצג כאן הוא פרוטוקול לשימוש קילוף פלסטיצידיות כמו פולימר במיקרועטיפת של תאים מונצח למסירה לטווח ארוך של מוצרים ביולוגיים לעיניים מכרסמים.

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

טכניקה זו היא דרך אמינה לספק כל תוכן כגון תרופות, חלבונים או תאים למקומות ספציפיים ברקמות או בבעלי חיים. אתה יכול לעקוב אחר המסירה ולכוונן את שחרורו של התוכן כדי להתאים את הניסוי שאתה רוצה. זה יכול לשמש לטיפול במחלות רבות מריפוי פצעים למחלות עיניים לב.היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לספק תאים טיפוליים באמצעות microcapsules alginate לאתרי היעד מבלי לגרום לתגובות חיסוניות ולשמור על אספקה מתמשכת של טיפולים מופרשים טריים לתקופה ארוכה יותר של זמן. התחל על ידי culturing תאי אפיתל רשתית על פי הוראות כתב היד. מעבר התאים כאשר הם מגיעים 70 כדי 80%confluency באמצעות הליכים סטנדרטיים תרבות רקמה.כדי לכמת את התאים, מערבבים נתרן אלגינט עם מים deionized לריכוז סופי של 2% משקל לנפח ולטהר את התערובת באמצעות סינון עם מסנן מזרק סטרילי 0.2 מיקרומטר. טריפסינוז, צנטריפוגה, ולשטוף את התאים עם 10 מילימולרים HEPES תמיסת מלח במאגר. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים ולהתאים את ריכוז התא הסופי למיליון למיליליטר של פתרון אלגינט.לטעון 300 aliquots microliter של אלגינט ותאים תערובת לתוך מזרק שלושה מיליליטר ולחבר אותו למשאבת מזרק. הכינו אמבט גלינג לפי הוראות כתב היד והמקמים אותו במזנון סטרילי של 50 מיליליטר מתחת לקצה המזרק במחט של שבעה מילימטרים למרחק ריסוס רחצה. כוונן את המתח לשמונה קילו-וולט ואת קצב הזרימה ל-30 מילימטרים לשעה כדי לייצר מיקרו-קפליות בגודל של כ-150 מיקרומטר.חבר את קליפ הקרקע השחור לחוט הנחושת כי הוא באמצע הדרך שקוע באמבט gelling ולחבר את קליפ חוט אנודה אדום למחט. זה לוקח בערך 30 דקות להכין תאים אנקפסולציה מתוך כל אצווה מיליליטר אחד של אלגינט ותערובת תאים. כאשר נוצר, לשטוף את microcapsules עם פתרון כביסה פעמיים דגירה אותם עם 10% FBS בתוספת מדיה DMEM באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5%CO2.לאחר דגירה 24 שעות ביממה, הכינו דגימה של 500 מיקרו-קפולים להכתמה על ידי שטיפתם פעמיים בתתכונת הכביסה. השתמש בערכת בדיקה חיה/מתה כדי להכתים אותם לצורך כדאיות. כדי להבטיח שהמיקרו-סקוולים יהיה בגודל מתאים, לדלל אותם במדיה נטולת סרום.בזהירות שאף אותם עם מזרק המילטון 2.5 מיקרוליטר. יש להוציא באיטיות מיקרוליטר אחד שנופל על מגלשת מיקרוסקופ ולקבוע את תקינות המיקרו-קאפסולים באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד זקוף. בעכבר הרדמה כראוי, להחיל חומר סיכה עינית כדי לשמור על לחות העין ולהשתמש 26 מד 3/8 מזרק משופע מחט כדי להקים ניקוב עיניים ראשוני ממש מתחת ללימבוס.הקפד להתקרב לעין מכיוון האף בזווית של 45 מעלות שמירה על הקצה משופע כלפי מעלה, כדי למנוע ניקוב עדשה. לאחר מכן, ודא כי קצה המחט כולו מוכנס לתוך העין עבור הדור חור מדריך, אבל להיזהר לא לנסוע רחוק מדי לנקב את הרשתית הזמנית. ברגע שזה יושלם, לאט לסגת המחט.בתוך micromanipulator, למקם 27 מד קהה קצה 2.5 מיקרוליטר המילטון מזרק כי כבר מלא בת פתרון קפסולה בשורה המחט עם חור המדריך הראשוני. החזק את ראשו של בעל החיים בתקורה יציבה ותמרן בכוונה את המחט לכיוון העין. כדי להבטיח תנוחת מחט נכונה בתוך הזיפים, הכנס את המזרק עד שניתן יהיה לדמיין את קצה המחט מאחורי העדשה.ואז להזריק את פתרון הקפסולה לאט במהלך 25 עד 30 שניות. וברגע שהושלם, בהדרגה לסגת מזרק קצה קהה על מנת למזער את הפגיעה בעין. במידת הצורך, התאימו את גודל הקפסולה על ידי התאמת המתח וקצב הזרימה בהתאם לכיווני כתב היד.אנקפסולציה של התאים באלגינט אושרה עם הדמיה ברייטפילד ו בדיקה חיה / DEAD הוכיחה כי 90% מהתאים היו קיימא לאחר אנקפסולציה. הכדאיות ארוכת הטווח של התאים הובטחה על ידי המסת הכמוסות בנתרן ציטראט ו Replating. הזרקה תוך-ואטראלית בוצעה תחת בדיקה ויזואלית שאיפשרה הדמיה של כמוסות ב הזין.בעת ניסיון הליך זה, אין להשתמש ב- PBS עבור שלבי כביסה כלשהם מכיוון ש- PBS ממיס מיקרו-קפליונים אלגינטים שנוצרו. לאחר התפתחותה, המעבדה שלנו משמשת כמערכת משלוח לטיפול בצורות של אי ספיקת לב יתר לחץ דם. טכניקה זו נחשבת לכלי מבטיח לטיפול עתידי במחלות לב וכלי דם ונוירולוגיות שונות.

encapsulated-cell-technology-for-delivery-biologics-to-mouse

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

השיטה מתוארת להפיץ גידולים אנושיים בעכברים רטינובלסטומה. תאים סרטניים הם מוזרק ישירות לתוך עיניו של עכברים חסר החיסונית. גידולים משניים הוקמו בהצלחה הן באמצעות תאים שנקטפו ישירות גידולים אנושיים tumorspheres תרבותי.

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים...

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

טכניקה ניתוחית זו ממחישה את הזריקה של וקטורים בריפוי גנטי ותאי גזע לתוך חלל subretinal של עין העכבר.

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

סרטון זה מתאר שיטה ליצירת מודל עכברי המחקה אנדופתלמיטיס חיידקית – זיהום תוך עיני הנובע מפלישה חיידקית לחלל הזגוגית של העין – באמצעות הזרקה תוך ויטריאלית של תרחיף חיידקי לעין. מודל עכבר זה מסייע ללמוד את מנגנון המחלה ולהעריך טיפולים עבורה.

מודל עכבר אנדופתלמיטיס חיידקי: שיטה ליצירת אנדופתלמיטיס חיידקית באמצעות הזרקה תוך ויטריאלית של תרחיף חיידקי לעין העכבר

סרטון זה מדגים טכניקת העברה משופרת הסעה (CED) להעברת נוגדנים למוח העכבר. גולגולתו של עכבר מורדם נחשפת, ונוצר חור בור באזור היעד למסירת נוגדנים. צנתר שלב המכיל נוגדנים מוחדר לאתר המטרה, ובאמצעות משאבת עירוי נוצר שיפוע לחץ המספק נוגדנים בקצב מבוקר.

העברה משופרת של נוגדנים למוח עכבר

הזרקה תת-רשתית היא טכניקה כירורגית להעברת גנים יעילה לאפיתל פיגמנט הרשתית בעין העכבר.  כאן אנו מתארים שיטה קלה וניתנת לשכפול להזרקה תת-רשתית של וקטורים נגיפיים לאפיתל פיגמנט רשתית בעכברי ניסוי.

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

כאן אנחנו מדגימים גישה מוזרה לשימוש טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי ברזולוציה גבוהה (HR-SD-אוקטובר) כדי לסייע משלוח של סוכנים טיפול גנטי לחלל subretinal להעריך את פעולתה אמיתיות, לאפיין את קולט אור חיוניות.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית העכבר הרזולוציה על קוליים כדי לסייע הזרקה תוך-עיני במחקר ריפוי גנטי ברשתית

אנו מתארים כאן שיטה של הזרקה תוך-ואטראלית וכמות חיידקית עוקבת במודל העכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי. ניתן להאריך פרוטוקול זה למדידת תגובות חיסוניות מארחות וביטוי גנים חיידקי ומארח.

הזרקה תוך-ואטראלית וכמות של פרמטרי זיהום במודל עכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במיקרונדוסקופיית לייזר קונפוקלית סיבים אופטיים (CLM) כדי לחקור באופן לא פולשני את ההתפלגות המרחבית-זמנית של ליפוזומים בעין לאחר הזרקה תת-ימית.

Spatio-Temporal In Vivo הדמיה של מערכות אספקת תרופות עיניות באמצעות מיקרונדוסקופיה לייזר קונפוקל קונפוקלי פיברופטים

אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת תאי אב קולטי אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (photoreceptor) שמקורם בהקפאה, ואת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי RD10 .

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

למדו שיטת מיקרו-אנקפסולציה באלגינט לתאי אפיתל רטינלי להעברת תרופות ביולוגיות לעין העכבר. שיטה זו מאפשרת שחרור ממושך של תרופות תוך מזעור תגובות חיסוניות.

טכנולוגיית תאים באנקפסולציה להעברת מוצרים ביולוגיים לעין העכבר

גלה סרטונים נוספים