Name: ניתוח תא לווין פונקציה במהלך התחדשות שריר השלד על ידי פציעה קרדיאטוקסין הזרקה של העצמי הספק siRNA ב Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: חקור פונקציית גנים בתאי לווין במהלך התחדשות שריר השלד באמצעות פציעת קרדיאטוקסין והזרקת siRNA עצמי. שיטה זו מאפשרת ניתוח יעיל ללא שימוש בחיות טרנסגניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cells+at+work%3A+regenerating+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytolology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li>
<li>von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+critical+for+the+normal+function+of+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+and+the+muscle+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Satellite cells and the muscle stem cell niche.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).</li>
<li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+muscle%3A+molecular+regulation+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Building muscle: molecular regulation of myogenesis.</a> Cold Spring Harb Perspectives in Biology. 4 (2), (2012).</li>
<li>Schworer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+stress+responses+induce+muscle+stem-cell+ageing+by+Hoxa9+developmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic stress responses induce muscle stem-cell ageing by Hoxa9 developmental signals.</a> Nature. 540 (7633), 428-432 (2016).</li>
<li>Sousa-Victor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geriatric+muscle+stem+cells+switch+reversible+quiescence+into+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence.</a> Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).</li>
<li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li>
<li>von Maltzahn, J., Renaud, J. M., Parise, G., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt7a+treatment+ameliorates+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Wnt7a treatment ameliorates muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 109 (50), 20614-20619 (2012).</li>
<li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+fibronectin+from+the+aged+stem+cell+niche+affects+the+regenerative+capacity+of+skeletal+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice.</a> Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).</li>
<li>Huttner, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+Their+Adjacent+Muscle+Stem+Cells+from+Aged+and+Adult+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Individual Myofibers and Their Adjacent Muscle Stem Cells from Aged and Adult Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. , (2019).</li>
<li>Hardy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Injury+Models+for+Studying+Muscle+Regeneration+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0147198(2016).</li>
<li>Hall, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Skeletal+Muscle+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Skeletal Muscle Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1556, 237-244 (2017).</li>
<li>Dueweke, J. J., Awan, T. M., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Skeletal+Muscle+After+Eccentric+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sport+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Skeletal Muscle After Eccentric Injury.</a> Journal of Sport Rehabilitation. 26 (2), 171-179 (2017).</li>
<li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li>
<li>Bentzinger, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+regulates+Wnt7a+signaling+and+satellite+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibronectin regulates Wnt7a signaling and satellite cell expansion.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 75-87 (2013).</li>
</ol>

היינו רוצים להודות לכריסטינה בוחר וכריסטין מתחזה לסיוע טכני מעולה ו Saskia שטיינר לעזרה עם קביעת היעילות של הטיפול siRNA. אנו מודים לשירות הליבה היסטולוגיה לתמיכה טכנית גדולה, במיוחד סבין לנדמן ולינדה רות'נבורגר. אנחנו גם מודים לעכבר מתקן החי ב FLI לתמיכה מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוך הגרמני Forsch, מייסמייססלססרמייישסביםף (MA-3975/2-1) והגרמני (DKH-JvM-861005) לJ.v.M.

כאן אנו מציגים שיטה לחקור את הפונקציה של גן מסוים במהלך התחדשות של שריר השלד ללא צורך בעלי חיים טרנסגניים. זה מושגת על ידי שילוב של פגיעה קרדיאטוקסין שרירים המושרה עם הזריקה של הספק העצמי siRNA לתוך שריר השלד מתחדשות ביום 3 לאחר הפציעה. תיארנו בפרוטרוט את ההליכים של פגיעה בשריר ידי קרדיאטוקסין, ההזרקה של הספק העצמי siRNA ועיבוד של השרירים שנקטפו לנתח את ההתקדמות של התחדשות. אנו מדגימים כי הזרקה של ארס נחש קרדיאטוקסין לתוך שריר השלד ביעילות פוגעת השריר כולו, כי האספקה עצמית sirnas נמצאים סביב 75% של כל תאי הלווין בין סוגי תאים אחרים יומיים לאחר ההזרקה שלהם לתוך ה מתחדשות שריר השלד (איור 4, איור 5).
תשומת לב מיוחדת צריך להיות ממוקד על פציעה הומוגנית של השריר הקדמי התחדשות מאז דרגות שונות של פגיעה בתוצאת ההתחדשות ובכך גם את ההשפעה של siRNA עשוי להיות מושפע. יתר על כן, חשוב בצורה קריטית כי כל האזור מתחדשות מוזרק עם הספק העצמי siRNA. לניתוח של תהליך ההתחדשות, מומלץ תמיד להשוות אזורים דומים של שריר השלד מתחדשות, ולכן, השריר הקדמי הפיזי צריך להיות חתוך במחצית להשוות תמיד את אזור הבטן האמצעית של השריר. כאשר לנתח את השריר, את כל הקריודור כל צריך להיות מנותח מאז הרכב מיוכי סיבים שונה השריר הקדמי החדש ולכן עשוי להתחדש באופן שונה.
הפונקציה של תאי לווין יכול להיות נחקר על ידי הליכים ניסיוניים שונים, כולל התרבות שלהם על הסמוך המבודד היחיד מיוסיבים17, על ידי השתלת ועל ידי ניתוח התחדשות של שריר השלד לאחר פציעה מושרה 18,19. חקירת הפונקציה של תאי לווין באמצעות מודל פציעה vivo מושרה, למשל, הזרקה של קרדיאטוקסין, מספק את היכולת לנתח את הפונקציה תא לווין גם במונחים של האינטראקציה שלהם עם סוגי תאים אחרים כגון מקרופאגים ו חקירת השפעת גורמים מערכתית2. הפציעה של שריר השלד יכול להתבצע על ידי אמצעים שונים, למשל, תרגיל תמהוני, הקפאת פציעה, הזרקה של bacl2 או הזרקה של מסוכנים נחש כגון קרדיאטוקסין או notexin18. בעוד תרגיל מוזר הוא כנראה שיטת הפציעה הפיזיולוגית ביותר, הפגיעה בשריר אחד מסוים מוגבלת רק20. פציעות הקפאה ניתן להחיל כאשר הגירה של תאי לווין לכיוון האתר של פציעה הוא מטרת המחקר או רק חלק ספציפי של השריר צריך להיפגע. ניסויים בחיסרון של פציעות הקפאה הוא הניתוח הפתוח שצריך לבצע כדי ליישם את הבדיקה מתכת מקורר. הזרקה של bacl2 או מסוכנים נחש היא השיטה הדרמטית ביותר של פציעה, ובכך מאתגר תא לווין הפונקציה ביותר. יתר על כן, הזריקה היא פולשנית מינימלית, זמן ניתוח, באופן כללי, הוא פחות מחמש דקות ואינו כרוך suturing, וכו '. ובכך למזער את הסיכון של זיהומים.
פגיעה בשריר משמשת בעיקר כדי לחקור את ההשלכות הפונקציונליות של אובדן של פונקציות גנים, למשל, אובדן של Pax77,21. במיוחד אם עכברים מיושנים הם המוקד של השאלה המדעית, הדור או השימוש בעכברים טרנסגניים הוא לעתים קרובות לא ריאלי. הזרקה של הספק העצמי siRNAs המיקוד גן ספציפי הוא חלופה קיימא במקרים אלה והשתמשו בהצלחה22. בקצרה, השרירים הקדמי הפרושורי של עכברים נפצע על ידי הזרקה של קרדיאטוקסין והספק העצמי siRNAs מכוון נגד fibronectin (FN) הוזרק ביום 3 לאחר הפציעה. שרירים נותחו 10 ימים לאחר הפציעה וירידה משמעותית במספרים תא לווין נצפתה siFN לעומת התנאים siRNA שליטה מקושקשות. היעילות של הנוק-אין נקבע ב-lysates שרירים שלמים על ידי ה-PCR בזמן אמת כמותי 2 ימים לאחר הזרקת siRNA, ירידה ברמות הביטוי של 58% הושג כי מסירה ו-מציאה יעילות מספיקים עבור פונקציונלי ניתוח22. חלופות לבדיקת יעילות הנוק-אין הן או כתמי החיסונית או ניתוח חיסוני או נוגדנים המכוונים נגד הגן היעד. את היעילות ואת הספציפיות של siRNA המשמש זריקות vivo צריך להיקבע לפני הזרקה לתוך עכברים, למשל, על ידי בדיקת היעילות בתאי לווין מבודדים או myoblasts חזיק ראשוני. השימוש במאגר חכם המורכב 4 siRNAs שונים לעומת Sirnas יחיד מגביר את היעילות של הסתרה, אך גם מגביר את הסיכון של המיקוד לא ספציפי. הספציפיות של כל רצפי siRNA המשמשים צריך להיבדק בתרבות התא כדי למנוע אפקטים מחוץ ליעד. כפקד, לא מיקוד מקושקשות siRNA יש להשתמש מאז ההזרקה של siRNA למשל עלול להשפיע על תהליך התחדשות בשל הזריקה, ובכך, נזק נוסף של השריר. נקודת הזמן של הזרקת siRNA היא בהתאם לשאלה המדעית ועל פרופיל הביטוי של הגן היעד. באופן כללי, הזרקה של הספק עצמית siRNA ביום 3 לאחר קרדיאטוקסין פציעה מטרות רוב הגנים חשוב עבור התפשטות תא לווין מאז פסגות לווין הפצת התפשטות סביב היום 3 לאחר הפציעה. נקודת הזמן עבור הזרקת siRNA הראשון לא צריך להיות פחות מ 48 h לאחר פציעה קרדיאטוקסין מאז נפח ההזרקה של קרדיאטוקסין הוא גבוה למדי וספיגה מחדש של הנוזל היה צריך להתרחש לפני הזרקת פתרונות נוספים לתוך השריר. באופן כללי, זריקות מרובות של siRNAs או שילוב של siRNAs שונים אפשרי למרות שצריך לשקול כי כל הזרקה לתוך השריר מחדש גורם נזק נוסף.
מגבלה אחת של השיטה המתוארת היא העובדה, כי ההשפעה נצפתה היא לא בהכרח רק תלוי בנוק של הגן היעד בתאי לווין, אבל יכול להיות מיוחס סוגים אחרים של תאים כגון תאים חיסוניים או בתאי מחולל הזרע fibro. לכן, יש צורך לשלב ניסויים אלה עם ניסויים בחקירת אוכלוסייה טהורה של תאי לווין. אפשר לבצע ניסויים באמצעות תרבויות מיוסיבים צף, שבו תאי לווין הם מתורבתים על הסיבים הסמוכים שלהם או לבצע ניסויים השתלת באמצעות תאי לווין מבודדים17.
חלופה להזרקה של הספק העצמי siRNAs היא הזרקה של מעכבי מולקולה קטנה או חלבונים רקומביננטי אשר ניתן לבצע, בהתאם לשאלה המדעית. למשל, ההזרקה של חלבון מטריקס fibronectin או מולקולה קטנה מעכבי של JAK/STAT איתות בוצע בהצלחה עכברים בגילאי15,16. ניתוח של פונקציה גנטית מסוימת סוג תא אחד במהלך התחדשות של שריר השלד, למשל, בתאי לווין, ניתן רק באמצעות שימוש של מודל העכבר הגנטי inducible. זריקות של הספק העצמי siRNAs, חלבונים רקומביננטי או מעכבי מולקולה קטנה עשויה להשפיע על סוגי תאים מרובים להתחדשות שריר השלד.

שריר השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר של הגוף המייצג כ 40% ממשקל הגוף הכולל המאפשר התנדבותי תנועה. האדריכלות רקמה של שריר השלד מורכב בעיקר של postmitotic, סופני הבדיל, מיוקלאוסין סיבים, כמו גם תאים אחרים שונים ממערכת העצבים ההיקפית, כלי דם מערכת, ו ביניים בתאים1. חשוב מכך, שריר השלד יש יכולת אדירה להתחדש ולשחזר פונקציה על פציעה או נזק2. תהליך זה תלוי בתאי גזע השריר תושב הרקמה המכונה גם תאים לווין3,4. תאי לווין ממוקמים בין המויוסיבים לבין הבסיס לאמינה ומאופיין בביטוי של הגורם התמלול Pax75,6,7. תחת תנאים הומסטטיים, תאי לווין הם השקט אבל להיות מופעל עקב פציעה טראומטית, למשל, דרך תרגיל תמהוני או ניסוי באמצעות הזרקה של ארס נחש קרדיאטוקסין6,8. לאחר הפעלת, Pax7 חיובי תאים לווין co-express MyoD ו-Myf5, אשר מבצע את תאי גזע לבידול מיוגני. תאי לווין המתנגדים לupregulation של גורמי מחויבות ישמרו על פוטנציאל הסטדיות שלהם ויחזרו לשקט כדי לחדש את בריכת תאי הגזע לדרישות עתידיות. לאחר התרחבות בריכת הקדמון מיוגני, רשתות מופעלות על ידי גורמי בידול כמו מיוגנמין כדי ליזום את יציאת מחזור התא ובידול מסוף. הmyoprogenitors האלה מנתיך זה לזה או לסיבים הקיימים שתורמים ליוקליאני כדי לשמור על הגודל של התחום היורור. מיוסיבים לבטא שריר מסוף בידול גנים כמו שרשרת כבד רירן. לבסוף, החדש שנוצר מיוסיבים לגדול ובוגרת כדי לבנות את יחידות פונקציונלי של שריר השלד9,10.
התחדשות של שריר השלד יכול להיות מושפע מתנאים שונים, כולל מחלות שריר אוהזדקנות 11,12, החל ליקויים מתון לתנאים סכנת חיים, למשל, ב ניוון שרירים duchenne13 , 14. לכן, הרפואה הרגנרטיבית שואפת לשחזר נזק פגום או בתפקוד שרירי השלד באמצעותכוח ההתחדשות הטבועה שלה על ידי התמקדות בתפקוד תאלווין 15,16. כדי להשתמש בפוטנציאל המלא שלה הבנה מקיפה של תאי לווין נישה אנדוגניים שלהם במהלך התחדשות של שריר השלד נדרש. למרות שגישות נסיוניות קיימות כדי לבודד תאי לווין הסמוכים לסיבים שלהם17, המורכבות המלאה של אינטראקציה תאית ומערכתית של תאי לווין עם הסביבה שלהם יכולה להיות רק לכידה בvivo. בהקשר זה, הידע הגדול על התחדשות שריר השלד נרכשה באמצעות מודלים לפגיעה בעכבר2,18.
כאן אנו מציגים מודל מסוים העכבר הניסיוני פציעה כדי ללמוד את תא גזע מתווך התחדשות של נזק קרדיאטוקסין המושרה של השריר הטישורי הקדמי ב vivo. קרדיאטוקסין, נחש המופק הרעלן cytolytic הגורם מיופולריזציה ו נמק, הוא מוזרק לתוך השריר הקדמי התחדשות, אשר בתורו יגרום ניוון רקמות ואחריו התחדשות. כדי לנתח את הפונקציה של גנים במהלך התחדשות חריפה, הספק העצמי siRNAs מוזרק ביום 3 לאחר הפציעה, בשיא של הרחבת התא לווין. בעלי חיים ניסיוניים מוקרבים בנקודות זמן שונות, והשרירים הקדמי העושורי נאספים. שרירי הגזור קפואים ומעובדים עבור הקפאה נוספת. מיקרוסקופ immunofluorescence משמש לניתוח סמנים של התחדשות. שיטה זו מאפשרת חקירה של הפונקציה של גן יחיד במהלך התחדשות תא לווין מונחה שריר השלד באמצעות עכברים סוג פראי.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>Isothesia</td><td>אינהלציה נרקוטיקה</td></tr><tr><td>פלטה חמה 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הרדמה (Tec 7) עם קופסת אינהלציה + מסכות אף</td> מכונת גילוח <td>Tem Sega</td><td>Minihub</td><td></td></tr><tr><td>למכרסמים</td><td>isis</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Latoxan</td><td>L8102</td><td>ארס נחש הדרוש לפגיעה בשרירים</td></tr><tr><td>Accell siRNA חכם בריכה</td><td>Dharmacon</td><td>בהתאם לגן היעד שלך</td><td>מספק עצמי siRNA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21206</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 עז נגד עכבר IgG1</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21123</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>631-1574</td><td></td></tr><tr><td>CV Mount</td><td>Leica</td><td></td><td>מדיום הרכבה 14046430011 לאימונוהיסטוכימיה</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td> נוגדן devMHC <td>לצביעה גרעינית</td></tr><tr><td></td><td>DHSB</td><td>F.1652</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Thermo Fisher</td><td>73104</td><td></td></tr><tr><td>Haematoxylin Gill No3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS316-500ML</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין (29 גרם)</td><td>Terumo</td><td>3SS05M2813</td><td>סירינג המשמש להזרקות שרירים</td></tr><tr><td>נוגדן למינין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>M.O.M חוסם ריאגנט</td><td>מעבדות</td><td>וקטור MKB-2213</td><td>חסימה לצביעה אימונופלורסנט</td></tr><tr><td>מלוקסיקם</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>Metacam</td><td>משככי כאבים</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Thermo Fisher</td><td>6502</td><td>הטמעת רקמות</td></tr><tr><td>נוגדן Pax7</td><td>DSHB</td><td>PAX7</td><td>נוגדן ספציפי לתאי לוויין</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36934</td><td>aequos הרכבה בינונית</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>קארל רוט</td><td>4621.1</td><td>הטמעת רקמות</td></tr><tr><td>Superfrost בתוספת</td><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1830AMNZ</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>מגיב</td></tr><tr><td></td> פרמבילציה<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5, ישר</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 7,</td><td>Fine Science Tools</td> מעוקל <td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים במיוחד של Bonn (קצה חיתוך: 13&nbsp; מ"מ)</td> <td>כלי מדע עדינים</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים דפוס צר</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-16</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים (קצה חיתוך: 5&nbsp; מ"מ, קוטר קצה: 0.35&nbsp; מ"מ)</td> <td>כלים מדעיים עדינים</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח תא לווין פונקציה במהלך התחדשות שריר השלד על ידי פציעה קרדיאטוקסין הזרקה של העצמי הספק sirna ב vivo

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

שריר השלד בעל קיבולת עצומה להתחדש לאחר הפציעה. תהליך זה מונע בעיקר על ידי תאי גזע שרירים, הנקרא גם תאי לווין. תאי לווין מאופיינים בביטוי של שעתוק גורם Pax7 ומיקומם מתחת הבסיס לאמה בשריר השלד המנוחה. בעת הפציעה, תאי לווין מופעלים, עוברים התחדשות עצמית או בידול ליצירת סיבי מיואלה חדשים או לנתיך עם שנפגעו. הפונקציונליות של תאי לווין ב vivo ניתן לחקור באמצעות מודל פציעה מבוסס קרדיאטוקסין של שריר השלד. כדי ללמוד את הפונקציה של גן אחד במהלך התחדשות של שריר השלד, מודלים העכבר הטרנסגניים משמשים בעיקר. כאן, אנו מציגים שיטה חלופית לעכברים טרנסגניים, כדי לחקור את פונקציית הגן בתאי לווין במהלך התחדשות, למשל, במקרים בהם עכברים טרנסגניים אינם זמינים. אנו משלבים את הפציעה קרדיאטוקסין תיווך של שריר השלד מסוים עם הזריקה של הספק העצמי siRNA לתוך השריר מתחדשות אשר נלקח לאחר מכן על ידי תאי לווין בין תאים אחרים. כך, אנו מספקים שיטה לנתח פונקציה גנטית בתאי לווין במהלך התחדשות בתנאים פיסיולוגיים ללא צורך עכברים טרנסגניים.

תוצאה אופיינית של המטאוקסילין ו אאוזין (H &amp; E) מכתים את השריר הקדמי הטישורי לפני ואחרי הפציעה קרדיאטוקסין בתיווך מוצג באיור 4א, ב. בשרירי השליטה, הארכיטקטורה של השריר שלמה כנראה על ידי לוקליזציה של גרעינים בפריפריה של סיבים מיואיים וחוסר הצטברות של תאים מונונותים בחלל ביניים (איור 4A). 7 ימים לאחר קרדיאטוקסין מתווכת פציעה סיבים חדשים נוצרות מסומנים על ידי גרעיני מרכזי הממוקם (איור 4B). יתר על כן, הצטברות של תאים מונונותים ניתן לצפות, המורכב בעיקר של תאי לווין, אך גם תאים לא מיוגניים כמו תאים חיסוניים. השריר כולו צריך להיפגע על ידי המיקום המרכזי של כל והצטברות של תאים מונונוקלאואיים בחלק השריר כולו.
כדי לאפיין את ההתקדמות וההצלחה של תהליך ההתחדשות, מספר מעבדים אימונוofor, שימוש בסמנים של התחדשות ניתן לבצע. את מספר תאי הלווין ניתן להעריך על ידי כתמים עבור Pax7, סמן קאנוני עבור תאי לווין (איור 4ג, ד). שלושה ימים לאחר הפציעה מספר התאים לווין עולה (איור 4D), תאי לווין אינם נמצאים תחת הבסיס לאמנה יותר. כדי לנתח עוד יותר את תהליך ההתחדשות, סיבים מיותמים שנוצרו לאחרונה יכול להיות מוכתם עם נוגדנים מכוונים רירן התפתחותית (איור 4E). מיוסיבים שנוצרו לאחרונה להציג גרעינים מרכזי ממוקם ביטוי חזק של רירן התפתחותית. כמו סיבי מיוהים בוגרת, הביטוי של הרירן פוחתת התפתחותית, קוטרו של מיויוסיבי גדל בעוד גרעיני הם מגירה לפריפריה של סיבי מיוכן.
ההשפעה של גן יחיד על תהליך של התחדשות יכול להיות נחקר באמצעות עכברים טרנסגניים או כפי שמוצג כאן על ידי הזרקה של siRNA לספק את עצמו. Fluorescently התווית עצמית שליטה השליטה מקושקשות siRNA הוזרק לתוך השריר להתחדשות התחדשות הקדמית ביום 3 לאחר הפציעה, נקודת הזמן כאשר התפשטות של תאים לווין פסגות. יומיים לאחר ההזרקה של התאים siRNA לווין נותחו עבור נוכחות של siRNA המסומן בדגל (איור 4F). ניתחנו כמה תאי לווין לקחו את התווית באופן fluorescently כיום לאחר ההזרקה לתוך השריר מתחדשות (איור 5). כ 75% של כל תאי הלווין בשריר מיוצר מתחדשות היו חיוביים עבור התווית siRNA שכותרתו. יתר על כן, קבענו כי כ 74% של כל הסיבים להתחדשות מיותהיו חיוביים עבור התווית siRNA המסומן באופן מרומז כי או 74% הסיבים התחדשות מיועלה לקח את siRNA או כי התאים siRNA-חיובית לווין או התמזגו עם זה לזה כדי ליצור סיבים חדשים או היתוך עם הסיבים הקיימים כבר מחדש מחדש שהתרחשו (איור 5). זה מרמז כי תאים לווין לקחת את הספק העצמי siRNA וכי siRNA נמשכת בתאי הלווין לפחות יומיים.
<img alt="הליך הזרקת עכבר; הרדמה בעכבר, הזרקת וריד זנב, מריחת מזרק." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: הזרקת קרדיאטוקסין לתוך השריר הקדמי הפיזי. (א) עכברים מורדם על ידי שאיפת isofלאנה והגפיים התחתונות מגולחים. (ב) 29 גרם מחט מוזרק לתוך השריר הקדמי הטישורי (C) והועבר לאורך עצם השוקה במהלך ההזרקה של הפתרון קרדיאטוקסין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="רצף מיצוי רקמת עכבר; הכנת דגימה וזרימת תהליך; שלבי ניסוי ביולוגי." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: שלבים המעורבים בניתוח והקפאת השריר הקדמי הפצוע. (א) שרירי הגפיים האחוריות חשופים (ב) ו fascia המקיפים את השריר הקדמי החישורי נקרע כדי לחשוף את השריר. (ג) לאחר הסרת השריר, הוא נחתך באזור הבטן האמצעית לשני חצאים של גודל דומה באמצעות מספריים ישרים חדה (D). (ה) החצאים של השריר הגזור מוטבעים בעובש רדיד אלומיניום מלא בתמיסה קפואה וקפוא בחנקן נוזלי (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="הכנת דגימת מיקרוטום; שלבים A-C; הגדרת חיתוך, מהדק דגימה, מיקום שקופיות." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: ציוד ושלבים המעורבים בהקפאה של השרירים הקדמי השרישורי. (א) הטמפרטורה הקאמרית של הקריוסטט מוגדרת ל-21 ° c. (ב) השריר החישורי הקדמי בתמיסת ההקפאה מותקן על מחזיק המדגם. (ג) סעיפים 14 יקרומטר מחוברים שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="היסטולוגיה ואימונופלואורסצנציה של רקמת שריר, המציגה את מבנה התא וביטוי החלבון." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4: תמונות מייצגות של מתחדשות השרירים הקדמי השרישורי. H &amp; E כתמים של השרירים הקדמי הקרדיאטוקסין לפני (A) ו -7 ימים לאחר פציעה (ב). (ג) בתאי לווין שPax7 חיוביים (באדום) ממוקמים מתחת ללאטינה הבסיס המסומן על ידי למינציה (בירוק). גרעינים מוכתם נגד DAPI (בכחול). Pax7 תאים חיוביים מסומנים בחץ. (ד) לאחר 10 ימים של התחדשות, סיבי מיוים מאופיינים על ידי גרעין ממוקם במרכז (בכחול), Pax7 מוצג באדום, למינציה בירוק. Pax7 תאים חיוביים מסומנים בחץ. (ה) שנוצר מחדש סיבים התפתחותיים רירן (באדום), הלמינציה בירוק, גרעינים מוכתם נגד dapi (בכחול). (ו) באמצעות התווית העצמית שכותרתו Sirna (sired, מתואר באדום) עדיין נמצא בתאי לווין (Pax7 חיוביים, בירוק, מסומן על ידי חץ בכניסה) 2 ימים לאחר ההזרקה של העצמי הספק sirna לתוך ליצור מתחדשות הקדמי הבריא שריר (הזרקה ביום 3 לאחר פציעה קרדיאטוקסין מתווכת). הלמינציה מוצגת בלבן, גרעינים מוכתמים באמצעות DAPI (בכחול). סרגל בקנה מידה = 100 יקרומטר (A ו-B), 50 יקרומטר (C-E), 25 יקרומטר (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="גרף עמודות ביטוי siRNA וטבלת נתונים; השוואה בין תאי Pax7+ לעומת תוצאות מחודשות של סיבי שריר." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> איור 5: כימות הספיגה של siRNA המסומנת בדגל. (א) כימות של ספיגת sirna על ידי תאי לווין (Pax7 + תאים) ומתחדשות מיואיים 2 ימים לאחר ההזרקה לתוך שריר השלד מתחדשות. הזריקה בוצעה ביום 3 לאחר קרדיאטוקסין מתווכת פציעה. n = 3, קווי שגיאה מציגים את ה-SEM. (B) כבסיס לגרף המתואר ב-(א). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אנו מתארים בשיטה vivo לחקור את אובדן פונקציונלי של גן ספציפי בתאי לווין באמצעות שילוב של קרדיאטוקסין בתיווך הפציעה של שריר השלד ואת הזריקה של siRNA הספק.

ניתוח תא לווין פונקציה במהלך התחדשות שריר השלד על ידי פציעה קרדיאטוקסין הזרקה של העצמי הספק siRNA ב Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

טכניקה זו מאפשרת את השילוב של הזרקה תוך שרירית של ארס הנחש cardiotoxin, הזרקה תוך שרירית של siRNA אספקת עצמית, ובכך מאפשר ניתוח של התחדשות של שרירי השלד. היישום של siRNA מסירה עצמית היא דרך אלגנטית לחקור את האובדן התפקודי של גנים בודדים במהלך התחדשות שרירים, ובכך למנוע בעלי חיים מהועברים. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת הבוהן, לגלח את אזור ההזרקה של הרגל התחתונה הגולגולתית מהברך לכף הרגל, ולהסיר כל שיער רופף.מניחים את העכבר במצב supine על כרית כותרת מכוסה בד כירורגי סטרילי, ולהשתמש 70% אתנול כדי לחטא את אזור ההזרקה של הרגל התחתונה הגולגולתית. לאחר מכן, לטעון מזרק אינסולין מצויד מחט 29 מד, עם 50 microliters של 20 micromolar cardiotoxin ולנקב את העור באופן מלא לתוך השריר, רק דיסטלי לברך. כאשר המחט נמצאת במקום, להזריק את cardiotoxin על פני 10-20 שניות תקופת משלוח לאורך כל השריר, תוך הזזת המחט קדימה ואחורה, כדי לאפשר חלוקה אחידה של cardiotoxin, ובכך לפגוע את השריר הראשון tibialis כולו.ואז להחזיר את העכבר לכלוב שלה על כרית חימום עם ניטור עד חקירה מלאה. שלושה ימים לאחר הניתוח, לחטא את אזור ההזרקה כפי שהוכח רק. להזריק עד 50 microliters של siRNA מכוון נגד גן היעד של עניין לתוך השריר לפני השוקיים של העכבר הרדמה, כפי שהוכח רק.ואז להחזיר את העכבר לכלוב שלה, עם ניטור עד חקירה מלאה. לפני איסוף רקמת השריר הפצועה, לעטוף רדיד סביב עיפרון ולאטום את העיפרון עם סרט הדבקה, כך החלק התחתון של התבנית מספק אפילו, משטח סגור. כאשר התבנית מוכנה, לחטא את החיה כולה עם 70% אתנול, ולהשתמש מספריים חדים במיוחד כדי להסיר את העור בקרסול.לפני קצירת השריר, השתמש בממטרים עדין כדי לצבוט את המדפים הסגורים דרך fascia ליד עצם השוקה בקרסול של הרגל הפצועה, ולהזיז את המדפים לכיוון הברך כדי לקרוע את fascia, חושף את השריר לפני השוקית. כדי לבודד את השריר לפני השוקיים, לחשוף את הגיד הדיסטלי, ולתפוס את הגיד עם ממטרים עדין. השתמש מספריים באביב לחתוך את הגיד, ולתפוס את השריר בגיד כדי למשוך את השריר לכיוון הברך.כדי לאפשר את הניתוח של אזור midbelly, להשתמש במספריים ישר לחתוך את השריר לפני השוקית באזור midbelly לשני חצאים בגודל שווה, ולמלא את עובש העיפרון באמצע הדרך עם פתרון הקפאה. הכנס את שני החצאים של השריר הקדמי tibialis לתוך התבנית המקפיאה במצב זקוף, עם אזור midbelly מול החלק התחתון של התבנית. השתמש מדפים כדי להעביר את עובש הקפאה באמצע הדרך לתוך חנקן נוזלי.כאשר המדיום המקפיא משתנה משקוף ללבן והופך למוצק, מעבירים את התבנית המקפיאה למקפיא של 80 מעלות צלזיוס, או לייבוש קרח לעיבוד עתידי. בשרירי הבקרה, הארכיטקטורה של הרקמה נשארת שלמה, כפי שנצפה על ידי לוקליזציה של הגרעינים בפריפריה של myofibers, וחוסר הצטברות של תאים mononucleated בתוך החלל interstitial. שבעה ימים לאחר פציעה מתווכים cardiotoxin, myofibers חדשים נוצרים כמו מסומן על ידי גרעינים במיקום מרכזי, הצטברות של תאים mononucleated המורכב בעיקר של תאי לווין, אבל גם תאים לא מיוגניים כמו תאים חיסוניים.בתנאי מנוחה, תאי לווין המסומנים על ידי כתמי Pax7 באדום, ממוקמים מתחת ללמינה הבסיסית, המוצגת בירוק כאן. שלושה ימים לאחר הפציעה, מספר תאי הלוויין עולה, ותאי הלוויין כבר לא ממוקמים מתחת ללמינה הבסיסית. ביום 10 לאחר פציעה, מספר הלוויין עדיין גדל.כדי להמשיך לנתח את תהליך ההתחדשות, myofibers שזה עתה נוצר יכול להיות מוכתם בנוגדנים המכוונים נגד מיוסין התפתחותי. יומיים לאחר הזרקה עם siRNA, תאי לווין ניתן לנתח לנוכחות של siRNA שכותרתו פלואורסצנטי. בניסוי מייצג זה, כ -75% מתאים הלוויין בשריר המתחדש היו חיוביים עבור siRNA שכותרתו פלואורסצנטי.יתר על כן, כ -74% מכל myofibers המתחדשים היו גם חיוביים עבור siRNA שכותרתו פלואורסצנטי, מה שמרמז כי גם 74% של myofibers התחדשות לקח את siRNA, כי תאי לווין חיובי siRNA התמזגו יחד כדי ליצור myofibers חדש, או כי היתוך עם myofibers התחדשות הקיימת כבר התרחשה. הצעד הקריטי ביותר הוא להשיג פציעה מלאה של השריר לפני השוקית. בנוסף לניתוח היסטולוגי, פרמטרים כגון הכוח שנוצר ניתן לתעד כדי לנתח התחדשות של שרירי השלד באופן תפקודי.

analyzing-satellite-cell-function-during-skeletal-muscle-regeneration

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן...

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי לוויין משרירי ראש מסועפים של חולדה בת 9 שבועות. מקורם של השרירים בקשתות ענפיות שונות. לאחר מכן, תאי הלוויין מתורבתים על ציפוי נקודתי בגודל מילימטר כדי לחקור את ההתמיינות שלהם. גישה זו מונעת התרחבות ומעבר של תאי לוויין.

בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש Branchiomeric

אנו מתארים פרוטוקול in vivo למדידת כיפוף הגב של כף הרגל בעקבות גירוי של העצב הפרונאלי והתכווצות התא האחורי הקדמי של הגפה האחורית של החולדה. מדידות כאלה הן כלי תרגומי הכרחי להערכת פתולוגיה של שרירי השלד וגישות הנדסת רקמות לתיקון והתחדשות שרירים.

יישומים של<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקות פונקציונליות של עכברוש השוקה הקדמי להערכת רקמות מהונדסות תיקון שרירי שלד

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט להניע התחדשות שרירי שלד חריפה בעכברים בוגרים ומניפולציות הבאות של השרירים, כגון לנתיחה, מקפיא, חיתוך, מכתים שיגרתי, וניתוח שטח החתך myofiber.

אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

בפרוטוקול זה מתוארת שיטת ניתוח מבחנה וניתוח תפקודי לתאי גזע שריריים, המשמרת את רוב האינטראקציות שלהם עם הנישה האנדוגנית שלהם.

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר זיהוי וניתוח ממדי גבוה של תאי גזע שריר ותאי אב על ידי ציטומטריית מסה של תא בודד וטיהורם על ידי FACS לצורך מחקרים מעמיקים של תפקודם. גישה זו יכולה להיות מיושמת כדי לחקור דינמיקה התחדשות במודלים של מחלות ולבדוק את היעילות של התערבויות פרמקולוגיות.

זיהוי וניתוח של אבות מיוגניים in vivo במהלך פגיעה חריפה בשרירי השלד על ידי ציטומטריית מסה חד-תאית חד-ממדית גבוהה

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting siRNA ב cytotrophoblasts villous אדם המבודד טרי באמצעות microporation וזיהוי מתחמים-חלבון ה- DNA בתאים אלה. תאי transfected יכולים להיות במעקב על ידי כתם מערבי Emsa מנתח בזמן תרבות 4 ימים.

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

חקור פונקציית גנים בתאי לווין במהלך התחדשות שריר השלד באמצעות פציעת קרדיאטוקסין והזרקת siRNA עצמי. שיטה זו מאפשרת ניתוח יעיל ללא שימוש בחיות טרנסגניות.

ניתוח תא לווין פונקציה במהלך התחדשות שריר השלד על ידי פציעה קרדיאטוקסין הזרקה של העצמי הספק siRNA ב Vivo

גלה סרטונים נוספים