ניתוח תא לווין פונקציה במהלך התחדשות שריר השלד על ידי פציעה קרדיאטוקסין הזרקה של העצמי הספק siRNA ב Vivo

טכניקה זו מאפשרת את השילוב של הזרקה תוך שרירית של ארס הנחש cardiotoxin, הזרקה תוך שרירית של siRNA אספקת עצמית, ובכך מאפשר ניתוח של התחדשות של שרירי השלד. היישום של siRNA מסירה עצמית היא דרך אלגנטית לחקור את האובדן התפקודי של גנים בודדים במהלך התחדשות שרירים, ובכך למנוע בעלי חיים מהועברים. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת הבוהן, לגלח את אזור ההזרקה של הרגל התחתונה הגולגולתית מהברך לכף הרגל, ולהסיר כל שיער רופף.

מניחים את העכבר במצב supine על כרית כותרת מכוסה בד כירורגי סטרילי, ולהשתמש 70% אתנול כדי לחטא את אזור ההזרקה של הרגל התחתונה הגולגולתית. לאחר מכן, לטעון מזרק אינסולין מצויד מחט 29 מד, עם 50 microliters של 20 micromolar cardiotoxin ולנקב את העור באופן מלא לתוך השריר, רק דיסטלי לברך. כאשר המחט נמצאת במקום, להזריק את cardiotoxin על פני 10-20 שניות תקופת משלוח לאורך כל השריר, תוך הזזת המחט קדימה ואחורה, כדי לאפשר חלוקה אחידה של cardiotoxin, ובכך לפגוע את השריר הראשון tibialis כולו.

ואז להחזיר את העכבר לכלוב שלה על כרית חימום עם ניטור עד חקירה מלאה. שלושה ימים לאחר הניתוח, לחטא את אזור ההזרקה כפי שהוכח רק. להזריק עד 50 microliters של siRNA מכוון נגד גן היעד של עניין לתוך השריר לפני השוקיים של העכבר הרדמה, כפי שהוכח רק.

ואז להחזיר את העכבר לכלוב שלה, עם ניטור עד חקירה מלאה. לפני איסוף רקמת השריר הפצועה, לעטוף רדיד סביב עיפרון ולאטום את העיפרון עם סרט הדבקה, כך החלק התחתון של התבנית מספק אפילו, משטח סגור. כאשר התבנית מוכנה, לחטא את החיה כולה עם 70% אתנול, ולהשתמש מספריים חדים במיוחד כדי להסיר את העור בקרסול.

לפני קצירת השריר, השתמש בממטרים עדין כדי לצבוט את המדפים הסגורים דרך fascia ליד עצם השוקה בקרסול של הרגל הפצועה, ולהזיז את המדפים לכיוון הברך כדי לקרוע את fascia, חושף את השריר לפני השוקית. כדי לבודד את השריר לפני השוקיים, לחשוף את הגיד הדיסטלי, ולתפוס את הגיד עם ממטרים עדין. השתמש מספריים באביב לחתוך את הגיד, ולתפוס את השריר בגיד כדי למשוך את השריר לכיוון הברך.

כדי לאפשר את הניתוח של אזור midbelly, להשתמש במספריים ישר לחתוך את השריר לפני השוקית באזור midbelly לשני חצאים בגודל שווה, ולמלא את עובש העיפרון באמצע הדרך עם פתרון הקפאה. הכנס את שני החצאים של השריר הקדמי tibialis לתוך התבנית המקפיאה במצב זקוף, עם אזור midbelly מול החלק התחתון של התבנית. השתמש מדפים כדי להעביר את עובש הקפאה באמצע הדרך לתוך חנקן נוזלי.

כאשר המדיום המקפיא משתנה משקוף ללבן והופך למוצק, מעבירים את התבנית המקפיאה למקפיא של 80 מעלות צלזיוס, או לייבוש קרח לעיבוד עתידי. בשרירי הבקרה, הארכיטקטורה של הרקמה נשארת שלמה, כפי שנצפה על ידי לוקליזציה של הגרעינים בפריפריה של myofibers, וחוסר הצטברות של תאים mononucleated בתוך החלל interstitial. שבעה ימים לאחר פציעה מתווכים cardiotoxin, myofibers חדשים נוצרים כמו מסומן על ידי גרעינים במיקום מרכזי, הצטברות של תאים mononucleated המורכב בעיקר של תאי לווין, אבל גם תאים לא מיוגניים כמו תאים חיסוניים.

בתנאי מנוחה, תאי לווין המסומנים על ידי כתמי Pax7 באדום, ממוקמים מתחת ללמינה הבסיסית, המוצגת בירוק כאן. שלושה ימים לאחר הפציעה, מספר תאי הלוויין עולה, ותאי הלוויין כבר לא ממוקמים מתחת ללמינה הבסיסית. ביום 10 לאחר פציעה, מספר הלוויין עדיין גדל.

כדי להמשיך לנתח את תהליך ההתחדשות, myofibers שזה עתה נוצר יכול להיות מוכתם בנוגדנים המכוונים נגד מיוסין התפתחותי. יומיים לאחר הזרקה עם siRNA, תאי לווין ניתן לנתח לנוכחות של siRNA שכותרתו פלואורסצנטי. בניסוי מייצג זה, כ -75% מתאים הלוויין בשריר המתחדש היו חיוביים עבור siRNA שכותרתו פלואורסצנטי.

יתר על כן, כ -74% מכל myofibers המתחדשים היו גם חיוביים עבור siRNA שכותרתו פלואורסצנטי, מה שמרמז כי גם 74% של myofibers התחדשות לקח את siRNA, כי תאי לווין חיובי siRNA התמזגו יחד כדי ליצור myofibers חדש, או כי היתוך עם myofibers התחדשות הקיימת כבר התרחשה. הצעד הקריטי ביותר הוא להשיג פציעה מלאה של השריר לפני השוקית. בנוסף לניתוח היסטולוגי, פרמטרים כגון הכוח שנוצר ניתן לתעד כדי לנתח התחדשות של שרירי השלד באופן תפקודי.