Name: הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: למד שיטה חדשנית לבידוד מיוציטים ממוח הלב בעכברים לצורך מדידה סימולטנית של מתח, סידן וקיצור סרקומרים. שיטה זו מאפשרת הערכה פנוטיפית של רעילות לבית וזיהוי מטרות טיפוליות חדשות לכשל לב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לדנה מורגנשטרן על הגהה זהירה של כתב היד.

<ol><li>Hagen, B. M., Boyman, L., Kao, J. P., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+assessment+of+fluo+Ca2%2B+indicators+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A comparative assessment of fluo Ca2+ indicators in rat ventricular myocytes.</a> Cell Calcium. 52 (2), 170-181 (2012).</li>
<li>Schaffer, P., Ahammer, H., Muller, W., Koidl, B., Windisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Di-4-ANEPPS+causes+photodynamic+damage+to+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Di-4-ANEPPS causes photodynamic damage to isolated cardiomyocytes.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 426 (6), 548-551 (1994).</li>
<li>Hardy, M. E., Lawrence, C. L., Standen, N. B., Rodrigo, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+optical+recordings+of+membrane+potential+be+used+to+screen+for+drug-induced+action+potential+prolongation+in+single+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Can optical recordings of membrane potential be used to screen for drug-induced action potential prolongation in single cardiac myocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 54 (2), 173-182 (2006).</li>
<li>Tian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+action+potential+screening+on+adult+ventricular+myocytes+as+an+alternative+QT-screen%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Optical action potential screening on adult ventricular myocytes as an alternative QT-screen.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 27 (3-4), 281-290 (2011).</li>
<li>Warren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+recording+of+the+action+potential+in+isolated+cardiomyocytes+using+the+near-infrared+fluorescent+dye+di-4-ANBDQBS%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-precision recording of the action potential in isolated cardiomyocytes using the near-infrared fluorescent dye di-4-ANBDQBS.</a> The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (4), 1271-1281 (2010).</li>
<li>FluoVolt™ Membrane Potential Kit. ThermoFisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0009668_FluoVolt_Membrane_Potential_Kit_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0009668_FluoVolt_Membrane_Potential_Kit_UG.pdf</a> (2018).</li>
<li>Fluorescence SpectraViewer. ThermoFisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</a> (2019).</li>
<li>Calcium and Contractility in Isolated Myocytes. IonOptix. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ionoptix.com/product/myocyte-calcium-and-contractility-recording-system/">http://www.ionoptix.com/product/myocyte-calcium-and-contractility-recording-system/</a> (2019).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diastolic+dysfunction+and+thin+filament+dysregulation+resulting+from+excitation-contraction+uncoupling+in+a+mouse+model+of+restrictive+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Diastolic dysfunction and thin filament dysregulation resulting from excitation-contraction uncoupling in a mouse model of restrictive cardiomyopathy.</a> The Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (3), 446-457 (2012).</li>
<li>Ren, J., Davidoff, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+rapidly+induces+contractile+dysfunctions+in+isolated+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diabetes rapidly induces contractile dysfunctions in isolated ventricular myocytes.</a> The American Journal of Physiology. 272, 1 Pt 2 148-158 (1997).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Goldhaber, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+duration+restitution+and+alternans+in+rabbit+ventricular+myocytes%3A+the+key+role+of+intracellular+calcium+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Action potential duration restitution and alternans in rabbit ventricular myocytes: the key role of intracellular calcium cycling.</a> Circulation Research. 96 (4), 459-466 (2005).</li>
<li>Weiss, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+cardiac+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The dynamics of cardiac fibrillation.</a> Circulation. 112 (8), 1232-1240 (2005).</li>
<li>Baher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+cardiac+memory+and+mother+rotor+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Short-term cardiac memory and mother rotor fibrillation.</a> The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (1), 180-189 (2007).</li>
<li>Kleber, A. G., Rudy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+mechanisms+of+cardiac+impulse+propagation+and+associated+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias.</a> Physiological Reviews. 84 (2), 431-488 (2004).</li>
<li>McPheeters, M. T., Wang, Y. T., Werdich, A. A., Jenkins, M. W., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+infrared+optical+pacing+system+for+screening+cardiac+electrophysiology+in+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An infrared optical pacing system for screening cardiac electrophysiology in human cardiomyocytes.</a> PLoS ONE. 12 (8), 0183761(2017).</li>
<li>Gordon, A. M., Huxley, A. F., Julian, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variation+in+isometric+tension+with+sarcomere+length+in+vertebrate+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The variation in isometric tension with sarcomere length in vertebrate muscle fibres.</a> The Journal of Physiology. 184 (1), 170-192 (1966).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Preservation+Solutions+for+Cold+Storage+of+Heart+Allografts%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Three Preservation Solutions for Cold Storage of Heart Allografts: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> The Journal of Artificial Organs. 40 (5), 489-496 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

היכולת לבודד מיזוציטים הלב היא שיטה רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי להבין פיזיולוגיה לב, פתולוגיה, וטוקסיקולוגיה. בפרוטוקול הנ ל, תיארנו שיטה אשר משתמשת בלחץ הכבידה קבוע מנגנון לאנגדורף להשיג מייציטים לב יחיד. לאחר מכן, באמצעות מערכת האור הפלואורסצנטית, אנו מתארים כיצד בו לרכוש או סידן וקיצור או מתח וקיצור עקבות.
בגלל הקינטיקה השונה בין צבעי סידן, יש לקחת את הטיפול באיזה צבע לבחור. עבור פרוטוקול זה, הן fura-2 ו-fluo-4 בשימוש ההונדסים עם אסטרים של AM המחייב לשטוף את הצעד כדי לאפשר מחיקת הזמן לדבוק את הקבוצה AM וללכוד את הצבע בתא. בעוד fura-2 ו fluo-4 נחשבים צבע סידן אהדה גבוהה, Kd עבור fura-2 הוא 145 ננומטר לעומת 345 nM עבור fluo-49. עוד, fura -2 הוא טימטרי. בגלל זה, זה יכול לשמש לכמת רמות סידן תאיים9,12. Fluo-4 מצד שני הוא גל אחד לחקור סידן. היתרון של שימוש fluo-4 הוא מייצר אות זריחה בהיר יותר. ללא קשר לצבע הסידן משמש, בהשוואה לצבע הסידן, בבדיקות מתח ממברנה יש SNR נמוך יותר.
כפי שמוצג באיור 4 ואיור 5, עקבות מתח לעומת עקבות הסידן הם קטנים יותר משרעת. באמצעות סינון המעקב הדיגיטלי של התוכנה, ניתן להגדיל את SNR ולכמת את הנתונים (איור 4 ואיור 7). לאחר כימות, שני מעבר סידן ו-APDs אופטי להפגין פיצוי, קיצור המשך שלהם בתדרים הולכים מהר יותר (איור 2, איור 3, איור 6, איור 7). APDs קצר יותר במהלך מחזורי התנועה מהיר הכרחי כדי לאפשר מספיק זמן למילוי חדרית במהלך הדיאמדים. שינויים בתופעה זו נחשב לרמז על גידול בסיכון של הפרעה13,14,15,16. בעוד שינויים APD יכול להיגרם על ידי מחלה, הם יכולים גם להיגרם על ידי כימיקלים. כפי שמוצג באיור 7, כאשר ה, השולט הדומיננטי מקרין אשלגן, אניל, נחסם, ה-apd האופטי הופך לארוך יותר.
עדיין, כפי שדווח בעבר עם צבעים רגישים מתח, עוצמת אור ומשך יכול לשנות את apd2,5,17. זה הוא האמין להיות תוצאה של הדור של מינים חמצוני תגובתי (ROS)5. בעבר, זה כבר הוכח כי התוספת של נוגדי חמצון לפתרון ההקלטה יכול למנוע את המתח הרגיש ומתח הצבע5. כתוצאה מכך, הוספנו את ה-"נוגד חמצון" (10 מ"מ) לתמיסה של טירכבה. מוצג באיור 8 הוא 11 האחרונים של הקלטה של 20 שהתקבלו ב 1 הרץ התנועה. כפי שמצוין על ידי החצים האדומים, שינויים ב-APD לא התרחשה עד 15 s לתוך ההקלטה; לכן, בעוד הפתרון של Tyrode המתוקן לא מנע את הרעילות היא עיכבה אותו באופן משמעותי. באמצעות הפתרון של Tyrode שונה, באמצעות הגדרת עוצמת אור נמוכה ושמירה על משך ההקלטה מתחת 5 s, ניתן להימנע כל שינויים המושרה צבע ב-APD. זה חשוב כי מבלי לטפל להימנע מפני הרעלה, הנתונים יכול להיות מפורש כגורם מוקדם או מתעכב לאחר הדפולציות. בנוסף להגבלת החשיפה לאור כחול, ישנם אמצעי זהירות נוספים שניתן לנקוט כדי למנוע אי-פרשנות של הנתונים.
הראשון הוא להקליט רק מתאים שאחרי אחד אחד הצעדים יש אורך סרקומר מנוחה גדול או שווה 1.75 μm. הניתוק 1.75 יקרומטר נלקח מההתבוננות על ידי גורדון ואח '18 כי המתח מסרב במהירות לאחר אורך סרקומר הוא מתחת לסכום זה. למרות זאת, פתווגיות מסוימות עלול לגרום לשינויים משמעותיים באורך סרקומר מנוחה. כדי להיות בטוח כי הפנוטיפים אמיתי ולא פריט של הבידוד, הבעיות הבאות לירי גישות צריך להילקח.
אם הציטים שלי הם בעקביות לא בעקבות 1:1 הצעדים, יש סרקומר אורכי מתחת 1.75 μm, ממברנה כבדה מלתרים, או לא לשרוד את הבידוד, הדבר הראשון לבדוק הוא הזמן לקח כדי צינורית הלב. ככל שזמן הצינורית ארוך יותר, כך היבול יהיה נמוך יותר. אם נדרש זמן הצינורית ארוך, ניתן לשפר את הכדאיות על ידי הצבת הלב בפתרון קרדיואופציאלי19. ובכל זאת, בגלל שהקולגן הוא אנזים, הפעילות והספציפיות של שינוי מסוים של הרבה לאורך זמן. אם התשואות הכלליות הופכות לגרועות יותר למרות זמני הצינורית הטובים, יש לחייב הרבה מאוד דברים חדשים. בעוד הפרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הקלטות 5 s, אם יש צורך במתח נוסף, מסנני דחיסות נייטרלית יש צורך לרכוש. המערכת המתוארת בפרוטוקול מגיעה עם מסנני דחיסות נייטרלית המקהירים את האור המשודר על-ידי 37%, 50%, 75%, 90% ו-95%.
לסיכום, תיארנו מתודולוגיה המותרת לבידוד של מיציטים חדרית מבוגרים ששימשו לשימוש בסידן, מתח ומדידות סרנקופה.

כדי ללמוד את הלב במהלך מדינות בריאות ופתולוגי, הוא מועיל לעתים קרובות לבחון את הפנוטיפים במפלס התא הבודד. בעוד ההתקדמות המדעית אפשרה את המדידה החזקה של דינמיקה בודדת הסידן התאים, תא יחיד מדידות מתח אופטי נותרו נדירים1. ללא ספק, זה בגלל האות נמוך ליחס רעש (SNR), פוטורעילות, ו פוטולבנת של צבעים הפוטנציאל המסורתי2,3. עם זאת, מבודדים myocyte אופטי פעולה פוטנציאליות הושגו2,3,4. עוד, עם ההתקדמות בכימיה והפיזיקה של צבעים רגישים מתח, SNR השתפר5. ממברנה חדשה בדיקה פוטנציאליים (טבלה של חומרים) להגיב לשינויים בפוטנציאל ממברנה בתת-מילישניות יש טווח תגובה fluorogenic של כ -25% לכל 100 mV. עוד, עירור/פליטה של ערכת פוטנציאל הממברנה (למשל, FluoVolt ולט; רשימת חומרים) בשימוש בפרוטוקול זה עובד עם fluorescein רגיל isothiocyanate (FITC) או חלבון פלורסנט ירוק (GFP) הגדרות6.
הריגוש FITC ו-GFP העירור/פליטת הפליטה חפיפה עם fluo-4 סידן מאוגד ספקטרום7. רכישה מקבילה של מדידות הגיאומטריה של תאים דיגיטליים באופן מסורתי, שימשו לרכישה בו של מדידות הסידן והסלולר8. פרוטוקול זה מתאר בפרוטרוט כיצד לבודד את מיוזיציטים וכיצד להקליט אותות סידן או מתח באמצעות הגדרות FITC סטנדרטיות. בנוסף, הוא מתאר כיצד מתג פשוט ב מסנני עירור/פליטה על תחנת העבודה הדמיה ניתן להשתמש כדי להשיג סידן וקיצור מדידות באמצעות מדד הסידן לצבוע fura-2. לעומת fluo-4, fura-2 יש זיקה גבוהה יותר עבור סידן והוא עמיד יחסית כדי photobleaching לבנה9. כתוצאה מכך, שימוש בתחנת עבודה בודדת פרוטוקול זה מאפשר בדיקה יסודית של צימוד עירור התכווצות מיציט.

<table><tbody><tr><td>0.25 ליטר מאגר מעטפת מים</td><td>Radnoti, LLC</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק נפח 1 ליטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10-205F</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB-100-100 100</td><td></td></tr><tr><td>מ"ל צילינדר מדורג</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08 562 5C</td><td></td></tr><tr><td>1000 מ"ל בקבוק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB-500-1000</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מעבדה 2 בר עם מוט מייצב ומוטות נירוסטה 24 אינץ'</td><td>Radnoti, LLC</td><td>159951-2</td><td></td></tr><tr><td>4-Aminopyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>275875</td><td></td></tr><tr><td>40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2 מ"מ)</td> <td>IonOptix</td><td>MSCP1-40 (b)</td><td></td></tr> <tr><td>מזרק 60 מ"ל, BD Luer-Lok tip</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>צינורית מתכת אבי העורקים</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>73-0112</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>C-6 סירקולטור חימום סטנדרטי</td><td>Chemyx</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510500</td><td></td></tr><tr><td>מתאם מסגור תאים</td><td>IonOptix</td><td>CFA300</td><td></td></tr><tr><td>CellPr0 מערכת סינון ואקום, 1 ליטר, 0.22 ומיקרו; m, Cs / 12</td><td>Labratory Product Sales, Inc</td><td>V100022</td><td></td></tr><tr><td>מערכת סינון ואקום CellPro, 250 מ"ל, 0.22 ומיקרו; m,Cs/12</td><td>מכירת מוצרי מעבדה, Inc</td><td>V25022</td><td></td></tr><tr><td>מערכת סינון ואקום CellPro, 500 מ"ל, 0.22 ומיקרו; m,12/CS</td><td>Labratory Product Sales, Inc</td><td>V50022</td><td></td></tr><tr><td>CMC (mTCII) בקרת טמפ' עם מחמם זרימה מוטבע</td><td>IonOptix</td><td>TEMPC2</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer בעל קדח גדול תלת כיווני, נעילת זכר, פקקי עצירה</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-30600-23</td><td></td></tr><tr><td>אביזרי Cole-Parmer Luer, פקקי עצירה עם קדח גדול, מנעול זכר, 4 כיווני</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-30600-12</td><td></td></tr><tr><td>קול-פארמר סטופקוקס עם Luer Connections; חד-כיווני; זכר סליפ</td><td>קול-פארמר</td><td>EW-30600-01</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג II</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאים סטריליים קורנינג</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro</td><td>IonOptix</td><td>CPUD7M</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50980367</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה דומונט סגנון 5</td><td>אמזון</td><td>B00F70ZDEQ</td><td></td></tr><tr><td>FHD תא גירוי לשינוי מהיר</td><td>IonOptix</td><td>FHDRCC1</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3/4 חבילת אופטיקה</td><td>IonOptix</td><td>IonOP-Fluo</td><td></td></tr><tr><td>ממשק מערכת פלואורסצנטי &ndash; (עם כרטיס PCI-I/O)</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>Gibco פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>המוסטט, מעוקל 5-1/2 אינץ'</td> <td>Amazon</td><td>B00GGAAPD0</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310500</td><td></td></tr><tr><td>HyperSwitch מקור</td> <td>אור עירור כפולIonOptix</td><td>HSW400</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי מוטי הפוך</td><td>IonOptix</td><td>MSCP1-40 (a)</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Core + ניתוח</td><td>IonOptix</td><td>IONWIZ</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לאיריס, אמזון מעוקל</td><td></td><td>B018KRRMY6</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P288-100</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP3661</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטתיון מופחת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>LOOK סליל משי, קלוע שחור, 4-0, 100yds</td><td>SouthernAnesthesiaSurgical Inc.</td><td>SP116-EA</td><td></td></tr><tr><td>M199 מדיה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12 340 030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>MP021914215</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP2131</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S מערכת וידאו CCD דיגיטלית</td><td>IonOptix</td><td>MCS100</td><td></td></tr><tr><td>MyoPacer ממריץ שדה</td><td>IonOptix</td><td>MYP100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP358212</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>56-754-9250GM</td><td></td></tr><tr><td>מבעבע חמצן עם כניסת נוזל ל-0.25 ליטר</td><td>Radnoti, LLC</td><td>140143-025</td><td></td></tr><tr><td>תת-מערכת פוטו-מכפיל</td><td>IonOptix</td><td>PMT400</td><td></td></tr><tr><td>PMT תוסף רכישה</td><td>IonOptix</td><td>PMTACQ</td><td></td></tr><tr><td>Radnoti סליל חימום 5 מ"ל עם מלכודת הסרת גז</td><td>Radnoti, LLC</td><td>158830</td><td></td></tr><tr><td>מהדק טבעת 60 &ndash; קוטר 80 מ"מ עבור מאגר 250 מ"ל</td><td>Radnoti, LLC</td><td>120141-025</td><td></td></tr><tr><td>מהדק טבעת לתא תאימות למלכודת בועות</td><td>Radnoti, LLC</td><td>120149RC</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain ACF000010 5/32 אינץ' 9/32 אינץ'.</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-171-214</td><td></td></tr><tr><td>סן-גוביין ACF000013 3/16 אינץ' 3/8 אינץ'</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-171-217</td><td></td></tr><tr><td>סן-גוביין ACF000016 1/4 אינץ' 5/16 אינץ'.</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-171-219</td><td></td></tr><tr><td>סן-גוביין ACF000025 5/16 אינץ' 5/8 אינץ'.</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-171-226</td><td></td></tr><tr><td>סן-גוביין ACF00003 1/16 אינץ' 3/16 אינץ</td>'<td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-171-209</td><td></td></tr><tr><td>סן-גוביין ACF00005 1/16 אינץ' 3/32 אינץ'.</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-171-210</td><td></td></tr><tr><td>סן-גוביין ACF00009 5/32 אינץ' 7/32 אינץ'.</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-171-213</td><td></td></tr><tr><td>תוסף הקלטה באורך Sarcomere</td><td>IonOptix</td><td>SARACQ</td><td></td></tr><tr><td>T / C Adson רקמות ניתוח פלאטי מלקחיים 4.75 אינץ'</td> <td>אמזון</td><td>B00JDWRBGC</td><td></td></tr><tr><td>VETUS פינצטה קצה מעוקל אנטי סטטי</td><td>אמזון</td><td>B07QMZC94J</td><td></td></tr><tr><td>Vistek 3200 פלטפורמת בידוד רטט מוטי</td><td>IonOptix</td><td>ISO100</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

היכולת לבודד מיציטים לב מבוגרים התיר לחוקרים ללמוד מגוון של פתווגיות לב ברמת התא הבודד. בעוד ההתקדמות בצבעי סידן רגישים הרשו את ההקלטה האופטית חזק של הדינמיקה בודד של התאים הסידן, הקלטה של אותות חזקים חלבון טראנסממברנלי מתח אופטי נשאר קשה. לטעון, זה בגלל יחס נמוך יחיד לרעש, פוטורעילות, והלבנת של צבעים הפוטנציאל המסורתי. לכן, בודד תא מדידות מזמן כבר מוגבל לטכניקת מהדק תיקון אשר בעוד התקן הזהב, הוא דורש מבחינה טכנית ותפוקה נמוכה. עם זאת, עם התפתחות של צבעים בעלי פוטנציאל הרומן, גדול, תגובות אופטיות מהירות שינויים במתח ניתן להשיג עם מעט ללא רעילות והלבנת. פרוטוקול זה מתאר בפרוטרוט כיצד לבודד תאי מבוגר מסתורי שבו ניתן להשתמש עבור קיצור הסלולר, סידן, ומדידות מתח אופטי. באופן ספציפי, הפרוטוקול מתאר כיצד להשתמש בצבע סידן מומטרי, צבע סידן בעלי עירור יחיד, צבע מתח יחיד עירור. ניתן להשתמש בגישה זו כדי להעריך את הקרדיולוקסיניטי והפרעות קצב של גורמים כימיים שונים. בעוד פוטורעילות היא עדיין בעיה ברמת התא בודד, מתודולוגיה נדונה על איך להקטין אותו.

איור 1מראה את מנגנון. הלנגדורף החמצן נמצא במאגר. המים של הח-HB הפתרון הקולגן הוא מאגר מזרק באמצע 60 mL. הקו המגנטיות מחובר למאגר הריק ממזרק 60 mL. לאחר בידוד מוצלח, רוב התאים צריכים להיות בצורת מוט ומלא. תחת מטרה של 40 x, רוב מיוציטים היו צריכים להיות ברורים לעין. איור 1ב, ג מראה דוגמאות של מיציטים עכברים בריאים. לאחר מבודד, תאים יכולים להיות מתורבתים עד 4 ימים תוך שמירה על שלהם תכונות חשמל ומורפולוגיה.
כדי למדוד צימוד התכווצות עירור, התאים מוצבים לאחר מכן בתא מחומם לוהט. מכיוון שתאי הציטים רגישים לשינויים בטמפרטורה, חשוב לאפשר לכיסויים להחליק ב -15 דקות בחדר לפני ההקלטה. עבור הקלטות הפלואורסצנטית, אורך הגל נוצר על ידי נורה 75 W קסנון-arc. נורות קסנון לייצר ספקטרום אור המחקה אור שמש טבעי. עוצמת האור ואורך הגל נשלטים על ידי מפרידי דחיסות נייטרלית/פליטת פליטה. האור העירור עובר במטרה להיות היציט. אורך הגל של הפליטה נאסף לאחר מכן על-ידי צינור פוטוסולפי. באמצעות המערכת המתוארת כאן, יש לשנות את העירור ואת מסנני הפליטה באופן ידני.
קיצור מצד שני מתקבל על ידי טעינה מצמידים חיישן המכשיר. מדידת בזמן אמת עד 1,000 פעמים בשנייה, תוכנת הרכישה מבצעת ממוצע של הקווים בתוך תחום של עניין כדי ליצור דפוס שנפתרה היטב. לאחר מכן מחושבת התמרת פורייה מהירה (FFT). השיא בטווח האנרגיה מייצג את המרווח הממוצע של סרקומר. לאחר מכן, שינויים בריווח סרקומר במהלך התנועה מותווים ולאחר מכן כימות.
איור 2 מראה סידן וקיצור עקבות שנרשמו מתוך C57/B6 העכבר מיציט טעון עם צבע הסידן fura-2. פרוטוקול התנועה מהווה שינוי בפרוטוקולי התנועה שתוארו בעבר10,11. עכבר בריא תאי צריך להיות מסוגל להיות הקצב בקצב הלב שלהם במנוחה 10 Hz. איור 3 הוא כימות של נתונים ensembled ממוצעים שהתקבלו מ C57/B6 עכברים ו הטרנסגניים שלהם (TG) החברים שהיה מוטציה נקודה הציג לתוך ערוץ אשלגן. שימו לב שאין הבדל בין הקבוצות למעט זמן ההרפיה בתנועה של 10 הרץ.
בניגוד fura-2 שהוא צבע עירור כפול, לצבוע מתח ו fluo-4 הם צבעים בעלי אורך גל יחיד עירור אשר עירור/פליטה לעבוד עם הריגוש FITC רגיל ספקטרום פליטה (494/506 nm). לכן, הקלטות של סידן ו סרקומר קיצור או מתח סרקומר קיצור ניתן להשיג באמצעות מסנן זה להגדיר.
איור 4הופעות מעקב מתח הוקלט מתוך עכבר C57/B6 בקצב של 10 Hz. לעומת איתותי סידן, בודד מעקב אחר מתח התא הם קטנים משרעת צריך לאחר עיבוד כדי לקבל אות שמיש. איור 4ב מראה הפוטנציאל פעולה ENSEMBLED ממוצעים (AP) עשוי מנקודת גישה באיור 4א. איור 4ג, D מציג AP ensembled ממוצע לאחר מעבר נמוך באטרסוורת ' או Savitzky-golay מסנן דיגיטלי הוחל. יש לנקוט טיפול בעת סינון האות כאשר לא לעוות את הנתונים האמיתיים. שימו לב להבדלים העדינים בצורת נקודות גישה באיור 4ב-D.
איור 5 מראה עקבות שנרשמו בקצב מיוציטים בשנת 1 הרץ. בנוסף לאות המתח הנמוך מאות הסידן, גם התכווצות קינטיקה שונה. זה בגלל הסידן צבע סידן מאגר בעוד צבעי מתח לא.
כמו עם הסידן חולף (איור 3), מיציטים הפגינו התנועה שינויים תלויים הפעולה האופטית שלהם הזמן הפוטנציאלי (apd) כמו גם (איור 6). בעוד העקבות fura-2 היו ensembled ממוצעים לפני לכמת, עקבות המתח סוננו עם מסנן החלקה פולינומיאלית Savitzky-Golay (רוחב 5, סדר 2) לפני היותו ensembled ממוצע וכימות.
ככמת באיור 6 ואיור 7, בנוסף הפגנת שינויים המושרה ב-apd, הם גם הפגינו הארכה התרופה המושרה של AP. ב -4 Hz, המצור תלוי בריכוז של הזרם החולף החוצה (אניto) עם 4-פמפרידין הביא להארכה של apd.
לבסוף, יש לנקוט טיפול כדי למנוע רעילות ציטוזה. איור 8 הוא 11 האחרונים של הקלטה 20 s. מצוין על-ידי החיצים האדומים באיור 8, חשיפה ממושכת של מייציטים לאור כחול מוביל לפעילות מופעלת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60196/60196fig1a.jpg"> איור 1: לחץ מתמיד על מנגנון לנגדורף. (א) מנגנון הלנגדורף עם כל רכיב המסומן באותיות לבנות. (ב) בודדים מלשן מג-דאולי שציטים הנצפים באמצעות מטרה 10x. (ג) עכברים מבודדים שצפו במטרה של 40 x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60196/60196fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60196/60196fig2a.jpg"> איור 2: סידן מייצג ו סרקומר קיצור עקבות שנרשמו מ C57/B6 myoyctes באמצעות fura-2. סידן ו סרקומר קיצור עקבות שנרשמו ב 1, 2, 4, 10, 0.5 ו 0.75 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60196/60196fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60196/60196fig3a.jpg"> איור 3: הכמת של הקיצור סרקומר, שיא סידן, זמן הרפיה, וזמן ספיגה חוזרת נרשם מסוג C57/B6 פראי (WT) ו טרנסגניים (TG) עכברים. (א) קיצור משרה. (ב) שיא סידן. (ג) זמן הרפיה המוגדר כ 90% לחזור הבסיסית של מעקב קיצור. (ד) זמן ספיגה חוזרת המוגדר כ 90% לחזור הבסיסית של מעקב הסידן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60196/60196fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60196/60196fig4a.jpg"> איור 4: הפוטנציאל האופטי של פעולה הוקלט מ-C57/B6 בקצב העכבר ב 10 הרץ. (A) מעקב שנייהלא מסונן. (ב) Ensembled הפוטנציאל האופטי בממוצע פעולה. (ג) Ensembled ממוצעים פעולה אופטי פוטנציאל לאחר lowpass מסנן באטרסוורת ' הוחל. (D) Ensembled בממוצע פעולה אופטית לאחר מסנן החלקה פולינומיאלית של Savitzky-golay הוחל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60196/60196fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60196/60196fig5a.jpg"> איור 5: המייצג סידן, מתח, ו סרקומר קיצור עקבות שנרשמו מתוך החולדה הג-דאולי העכבר המהיר 1 הרץ. (א) סידן וסארקומיר קיצור עקבות שנרשמו ב-1 הרץ הצועד באמצעות fluo-4. (ב) מתח ושרידי סימני הקלטה שנרשמו ב-1 הרץ הצועד באמצעות צבע המתח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60196/60196fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60196/60196fig6a.jpg"> איור 6: פוטנציאל הפעולה האופטי הוקלט מתוך החולדה של הג-דאולי-ביציטים בקצב של 1, 2 ו -4 Hz. (א) מעקב מסונן שנרשםב-1 Hz. (ב) מעקב מסונן שנרשם ב-2 Hz. (ג) מעקב מסונן שנרשם ב-4 Hz. (ד) פעולה פוטנציאלית של משך 10, הנמדדת כ-10% חזרה לתוכנית הבסיסית. (ה) פעולה פוטנציאלית משך זמן 50, שנמדד כ 50% לחזור לתוכנית הבסיסית. (ו) פעולה פוטנציאלית משך זמן 90, שנמדד כ90% חזרה לתוכנית הבסיסית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60196/60196fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60196/60196fig7a.jpg"> איור 7: ההשפעות של 4-פמפרידין על שבג-דאולי העכבר האופטי פעולה פוטנציאל הקליט 4 הרץ התנועה. (א) מEnsembledבממוצע הוקלט ב -4 Hz, ללא 4-פמפרידין בפתרון. (ב) מEnsembled בממוצע הוקלט ב-4 Hz הצועד עם 1 μm 4-פמפרידין בפתרון. (ג) מEnsembled ממוצעים הוקלטו ב -4 הרץ עם 10 μm 4-פמפרידין בפתרון. (ד) פעולה פוטנציאלית של משך 10, הנמדדת כ-10% חזרה לתוכנית הבסיסית. (ה) פעולה פוטנציאלית משך זמן 50, שנמדד כ 50% לחזור לתוכנית הבסיסית. (ו) פעולה פוטנציאלית משך זמן 90, שנמדד כ90% חזרה לתוכנית הבסיסית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60196/60196fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60196/60196fig8a.jpg"> איור 8: צבע מתח הנגרמת על ידי פוטורעילות בג-דאולי חולדה מייציטים לאחר 20 s של חשיפה רציפה אור. חיצים אדומים מצביעים. על אירועים ציטוטוקסיים <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60196/60196fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אנו מציגים את המתודולוגיה עבור בידוד של מוציטים מורטין וכיצד להשיג מתח או סימני הסידן במקביל עם הקיצור סרקומר באמצעות מכשירי האור הפלואורסצנטית עם מדידות הגיאומטריה הדיגיטלית בו.

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

אי ספיקת לב היא סיבת המוות המובילה עבור גברים ונשים כאחד בעולם. ראיות חדשות מצביעות על שינוי בחילוף החומרים הלב מערכתי לתרום הפתולוגיה של אי ספיקת לב. לזהות במהירות אילו מטבוליטים משפיעים על צימוד התכווצות ציריות הוא עדיין אתגר.הגישה המסורתית של בידוד מיוציט לב מעכבר בוגר הוא תהליך זמן רב ומאתגר. השיטה החדשנית במאמר זה הופכת תהליך מחמיר ליעיל וקל יותר לביצוע. כמו כן, באמצעות בדיקה פלואורסצנטי, אנו יכולים לבצע הערכות פנוטיפיות רבות של איך כימיקלים יכולים לגרום רעילות לב או תפקוד לקוי ברמה התאית.על ידי זיהוי אילו מולקולות לשנות את תפקוד מיוציט, טיפולים חדשים ניתן לזהות לטיפול של אי ספיקת לב. באמצעות עכברים מהו מהודרים, אנו יכולים לחקור גנים שונים כדי לקבוע אילו יכולים למנוע ולתרום לאי ספיקת הלב. מידע זה יהיה חיוני בריפוי עתידי של אי ספיקת לב.הדגמת ההליך תהיה מתיו קלוס ותלמיד שריאס Suresh. כדי להתחיל, להפשיר את פתרון למינין עובד על קרח. באמצעות פיפטה P1000, שאפו 200 מיקרוליטרים של למינין וגרור בעדינות את קצה הפיפט לאורך קצה אחד של הכיסויים העוקרים כדי לאפשר לפעולה נימית לשלוף כמות זעירה של למינין להקלה על חיבור כיסוי לצלחת שש בארות.לאחר מכן לגרש את למינין הנותר במרכז הכיסוי בתנועה מעגלית. מורחים את טיפת למינין על פני הכיסוי. מניחים את הכיסויים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות עד 24 שעות לפני הבידוד.כדי לבודד מיוציטים מלב מוכן ב- KHB-HB קר, מניחים את המדגם תחת מיקרוסקופ סטריאו. כדי למנוע emboli, ראש cannula aortic על ידי שקוע אותו בפתרון KHB-HB ושימוש מזרק 20 מיליליטר כדי לכפות את הפתרון דרך. ודא שהלב שקוע והקנולה מוקרבת לפני כריתת הלב.עם 5 מדפים, לאכלס את הלב. אשר מיקום תקין של ה cannula על ידי לדמיין את קצה ה Cannula כ מילימטר אחד מעל החדרת עזר לתוך החדר. ואז להתחיל את הזרימה של KHB-HB על ידי סיבוב stopcock על Langendorf.חבר את ה Cannula ל Langendorf כדי לבלבל את הלב במשך חמש דקות. לאחר מכן, סובב את ה- stopcock כדי להעביר את התבלין ממאגר KHB-HB למאגר מאגר העיכול. לאחר חיץ העיכול מגיע ללב, להגדיר שעון קצב.לאסוף את perfusate בסקולר סטרילי 100 מיליליטר. מלאו מחדש את מאגר מאגר העיכול לפי הצורך עם התפנית עד שפג תוקפו של זמן העיכול. לאחר העיכול, בסקילר סטרילי של 100 מיליליטר, מפרידים את תאי הלב עם מלקחיים ומספריים של איריס.מניחים כל תא לתוך באר נפרדת של צלחת שש בארות. יוצקים חמישה מיליליטר של תותב קולגן לתוך כל באר. מיד להשתמש במספריים כדי לטחון את רקמת הלב לגושים של כמטר מעוקב אחד.באמצעות פיפטה העברה סטרילית, בעדינות triturate רקמת הלב טחון עם חיץ העיכול. לאחר נתחי הרקמה הופכים לבנים ונוצות, מניחים את הצלחת תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לבחון את התאים. אם מספר התאים קיימא גדול מ 80%להמשיך לסנן את התאים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר באמצעות מסננת תאים 100 מיקרון.אם מספר התאים בני-קיימא קטן מ- 80%check הזמן שנדרש לבדיקה. אם זמן ההתכה הוא מעל חמש דקות, נסה לב אחר. אם לא, תזהה חריצי קולגן חדשים דרך תוכנית הדגימה של הקולגנס.לאחר מכן, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 215 פעמים g במשך שתי דקות. גלולה צריך להיות קומפקטי ולא רופף. אם גלולה הוא רופף, ההכנה מכילה תאים מתים רבים.במכסה המנוע של תרבות הרקמות, תן שימוש חוזר לכדור הקומפקטי ב-10 מיליליטר של חיץ עצירה. גלולה התאים שוב על ידי צנטריפוגה ב 215 פעמים g במשך שתי דקות. תן שימוש חוזר בתאים בחמישה מיליליטר של חיץ ציפוי.בצע ספירת תאים על מונה ציטו והתאם את עוצמת הקול של מאגר הציפוי כדי להגיע לריכוז מיוציט סופי של פעמיים 10 לארבעת התאים למיליליטר. עכשיו הסירו את הכיסויים מצופים הלמינין מהאינקובטור. שאף את טיפת למינין אם קיים.צלחת 200 מיקרוליטרים של השעיית מיוציט על כל כיסוי. מניחים את הכיסויים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 21% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שעתיים כדי לאפשר התקשרות. לאחר שעתיים, מוציאים את הכיסויים ושופסים את התאים הלא מחוברים.הוסיפו שני מיליליטר של תרבות ותרבות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עד ארבעה ימים. ראשית, הסר את רכיב A ורכיב B מהערכות הפוטנציאליות של הממברנה. בצינור חרוט 15 מיליליטר, לשלב 50 microliters של רכיב B וחמישה microliters של רכיב A כדי ליצור תערובת צבע מתח.וורטקס לערבב. הוסף 10 מיליליטר של ציפוי מדיה לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל את תערובת צבע המתח כדי ליצור את תערובת צבע פוטנציאלי קרום. שוב, מערבולת לערבב.ואז להסיר צלחת אחת שש בארות של מיוציטים מהאינקובטור. שאף את התקשורת. מוסיפים 800 מיקרוליטרים של תערובת הצבע הפוטנציאלית של הממברנה לכל באר.מכסים את הצלחת בנייר כסף ומשאירים את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר מכן, שאפו את תערובת המדיה לצבוע מכל באר והוסיפו מיליליטר אחד של הפתרון של טירודה שונה לכל באר. מכסים בנייר כסף.הפעל את הציוד בסדר של מיקרוסקופ, מנורת קשת, HyperSwitch, מערכת ממשק פלואורסצנטי, ספק כוח MyoCam, ממריץ שדה, ומחשב. ודא שערכות מסנן פליטת העירור מתאימות לצבע ההדמיה. לדוגמה, fura-2 הוא נרגש ב 340 ננומטר ו 380 ננומטר של אור.הוא פולט 510 ננומטר של אור. Fluo-4 וצבע קרום המתח נרגשים ב 485 ננומטר של אור פולטים ב 520 ננומטר של אור. ראש מערכת ההקלטה על ידי הפעלת ואקום, פתיחה מלאה של מהדק הצינור, בעדינות צולל כל מזרק 60 מיליליטר עם הפתרון של טירוד בסעפת.להקלטות סידן, השתמש בתסמת תקן של טירודה. להקלטות מתח, השתמש בתסרון של טירוד שהשתנה. הפעל את תנור הקו.לשמור על הטמפרטורה כך perfusate בתא הוא ב 36 פלוס או מינוס מעלות צלזיוס אחת לפחות 15 דקות. לאחר מכן, פתח את תוכנת הרכישה. ודאו שהפרמטרים מוגדרים לצבע ההדמיה הנכון.תכבה את המריצה. בחושך, להסיר את נייר הכסף מן הצלחת שש בארות ולה מניחים כיסוי בתא ההליכה. מניחים את הלוח תחת מיקרוסקופ ולהתמקד מיוציטים באמצעות המטרה 10X.לאחר ההתמקדות, להתחיל לצעוד על ידי שדה מגרה אחד הרץ ו 0.2 וולט. הגדל בהדרגה את המתח עד שתתקבל צעד אחד לאחד. לאחר מכן להגדיל את המתח עד 1.5 פעמים הסף הוא הגיע.עבור מהמטרה 10X למטרה 40X. התמקד בתא הבא בעקבות צעד אחד לאחד. כוונן את גווני הפלסטיק כך שרק תא אחד יהיה בשדה התצוגה.באמצעות התוכנה, למקם את האזור של תיבת עניין על סרקומרים מוגדרים היטב. הפעל את תוכנת הרכישה כדי ליזום את אור העירור. בעזרת מסנני הצפיפות הניטרלית, התאימו את הגדרת העוצמה בהתאם כדי לקבל יחס אות לרעש הולם.כאן מוצגים עקבות קיצור הסידן והסרקום הייצוגיות שנרשמו ממיוציטים של עכברים C57BL/6 באמצעות fura-2. כימות של נתונים ממוצעים של ההרכב שהתקבלו מעכברי C57BL/6 לבין חברי המלטה המהופנטים שלהם לא מראה שום הבדל בין הקבוצות למעט זמן הרפיה ב 10 צעדים הרץ. מעקב המתח נרשם מעכבר C57BL/6 myocyte עכבר בקצב של 10 הרץ היה פוסט מעובד כדי לקבל אות שמיש.ההרכב העמיד ממוצע של פוטנציאל פעולה לאחר מעבר נמוך של באטרוורת' או מסנן דיגיטלי של Savitzky-Golay שהוחל כדי להראות הבדלים עדינים בצורת פוטנציאל הפעולה. העקבות שנרשמו ממיוציטים של חולדות בקצב אחד של הרץ מראים בנוסף לכך שסימן המתח נמוך יותר מאות הסידן, גם הקינטיקה של ההתכווצות שונה. הסיבה לכך היא סידן צבעים חיץ סידן בעוד צבעי מתח לא.כמו עם סידן חולף, מיוציטים הפגינו שינויים תלויים צעדים משך הפעולה האופטית שלהם פוטנציאל. הארכה הנגרמת על ידי סמים של פוטנציאל הפעולה הוכח גם כן. 11 השניות האחרונות של הקלטה של 20 שניות הצביעו על כך שחשיפה ממושכת של מיוציטים לאור כחול מובילה לפעילות מופעלת.בעת ניסיון הליך זה, הדבר החשוב ביותר לזכור הוא להשתמש באור בעוצמה הנמוכה ביותר האפשרית, כך שאתה לא נזק myocytes. מיוציט מבודד באמצעות הגישה שלנו יכול לשמש גם עבור אימונוהיסטוכימיה או שנערך לניתוח כתם מערבי. היופי של טכניקה זו, זה מאפשר לחוקרים להעריך במהירות כיצד מגוון של מולקולות וגנים לעזור צימוד צירציה-התכווצות באמצעות מערכת אחת.

optical-imaging-of-isolated-murine-ventricular-myocytes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מאמר זה מתאר טכניקה גבוהה ברזולוציה של זמן ומרחב התנועה תמונה אופטית פעולה פוטנציאל על פני השטח של Langendorff-perfused הלבבות חולדה באמצעות צבע פוטנציומטרית (di-8-ANEPPS).

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

Myocytes לב למבוגרים הם תאים ראשוניים, כי יכול להיות מבודד לבבות בעלי חיים מתורבתים במשך כמה ימים. במהלך תקופה זו תרבות העברת גנים adenoviral ניתן להשתמש בהם כדי להביע biosensors מקודדים גנטית (GEBs) או חלבונים היתוך ניאון. שתי הגישות לאפשר חקירות הסלולר באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

פרוטוקול זה מתאר הערכת אלקטרופיזיולוגיות אטריה מאתר ניצול מערכת מיפוי אופטי עם הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית רזולוציה גבוהה, כולל הקלטות כפולה של מתח הממברנה, Ca2 + חולף תחת מתוכנת גירוי דרך קטטר אלקטרודה מיוחדת.

אלקטרופיזיולוגיות להערכת אטריה מאתר עם מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (&lt;50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.

הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם

פרוטוקול זה מדגים בידוד מונחה מיקרוסקופיה וצביעה אימונופלואורסצנטית של ורידים ריאתיים מורינים. אנו מכינים דגימות רקמה המכילות את אטריום שמאל, ורידים ריאתיים, ואת הריאות המתאימות ומכתימים אותם עבור טרופונין T לב ו Connexin 43.

מיקרודיסקציה וצביעה אימונופלואורסצנטית של שרוולי שריר הלב בוורידי ריאה מורין

למד שיטה חדשנית לבידוד מיוציטים ממוח הלב בעכברים לצורך מדידה סימולטנית של מתח, סידן וקיצור סרקומרים. שיטה זו מאפשרת הערכה פנוטיפית של רעילות לבית וזיהוי מטרות טיפוליות חדשות לכשל לב.

הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית

גלה סרטונים נוספים