Name: Obtention של ענק Unilamellar היברידית ושלפוחיות על ידי אלקטרוונטור ומדידה של תכונות מכניות שלהם על ידי שאיפה מיקרופיפטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: למד כיצד למדוד תכונות מכניות של קרומי שפופרות ענקיות חד-שכבתיות באמצעות טכניקת שאיפת מיקרופיפטה. שיטה זו מאפשרת הערכת גמישות ויציבות הקרום בניסוי בודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים בהכרת תודה את ה-ANR לקבלת תמיכה כספית (ANR Sysa).

<ol><li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li>
<li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li>
<li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+vesicles+from+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li>
<li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+polymer%2Flipid+vesicles%3A+state+of+the+art+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li>
<li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+Hybrid+Lipid%2FPolymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li>
<li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+De+Physique%22%5BJournal%5D)">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li>
<li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li>
<li>Rodríguez-García, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions+of+the+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+A%3A+Physicochemical+and+Engineering+Aspects%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li>
<li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+omega%22%5BJournal%5D)">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li>
<li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer%2Flipid+hybrid+unilamellar+vesicles+%28GHUVs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li>
<li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+properties+of+lipid+bilayers%3A+theory+and+possible+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+%28GHUVs%29+does+not+systematically+lead+to+%26%2334%3Bintermediate%27%27+membrane+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li>
<li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L%CE%B1+and+L%CE%B1-Gel+Coexistence+Regimes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li>
<li>Longo, M. L., Ly, H. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLongo%2C+ML+%22Methods+in+Membrane+Lipids%22">Methods in Membrane Lipids</a>. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).</li>
<li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles%3A+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae%2C+but+with+mechanical+stability+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li>
<li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li>
<li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+behavior+of+membranes+with+sterols%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li>
<li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity%2C+Stability%2C+and+Area%2FMolecule%3A%E2%80%89+A+Micropipet+Aspiration+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:  A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li>
<li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

ציפוי המיקרופיפטה הוא אחת הנקודות המרכזיות להשגת מדידות אמינות. יש למנוע הדבקה של שלפוחית המנוע למיקרו-פיפטה, וציפוי משמש לרוב בספרות17,18,19,20,21, עם bsa, β-קזאין או סורפסיל. פרטים על תהליך הציפוי מוזכרים לעתים נדירות.
התפרקות BSA צריך להתבצע לפחות 4 שעות תחת עצבנות על מנת להשיג פתרון טוב. עם זאת, השלב הסינון עדיין נדרש כדי להסיר ...

שלפוחיות ענק שהתקבלו מ פוספוליפידים (ליפוזומים) כבר בשימוש נרחב מאז שנות ה-70 כמו קרום התא הבסיסי מודל1. בסוף שנות ה-90, מורפולוגיות ומורסיידים שהתקבלו מהרכבה עצמית של סופולימרים, ששמו פולימזומים בהתייחס לאנלוגיות השומנים שלהם2,3, הופיע במהירות כחלופה מעניינת ליפוזומים בעלי יציבות מכנית חלשה ופונקציונליות כימית מודולרית מודולרי. עם זאת, הדמות התאית שלהם הוא מוגבל למדי לעומת ליפוזומים מאז האחרון מורכב פוספוליפידים, המרכיב העיקרי של קרום התא. יתר על כן, חדירות הממברנה הנמוכות שלהם יכול להיות בעיה בכמה יישומים כמו משלוח סמים שבו הפצת מבוקרת של מינים באמצעות קרום נדרש. לאחרונה, האגודה של פוספוליפידים עם בלוק סופולימרים לעצב היברידית פולימר-ליפיד ושלפוחיות וממברנות כבר הנושא של מספר גדל והולך של לימודים4,5. הרעיון המרכזי הוא לעצב ישויות שלשלב את היתרונות של כל רכיב (ביו-פונקציונליות וחדירות של bilayers השומנים עם היציבות המכנית ורב-תכליתיות כימית של ממברנות פולימר), אשר ניתן לנצל ביישומים שונים: מבוקר וממוקד התרופה מסירה, זיהוי ביולוגי בתוך ביוחיישנים לאבחון, ממברנות פונקציונלי עבור תאים מלאכותיים, פיתוח של ביו בהשראת מיקרו/ננו-soa.
כיום, קהילות מדעיות שונות (ביו-כימאים, כימאים, ביוסיסטים, פיזיקאלית-כימאים, ביולוגים) יש עניין הולך וגובר בפיתוח של מודל קרום התא מתקדם יותר. כאן, המטרה שלנו היא להציג, כפי שניתן מפורט ככל האפשר, הקיימות מתודולוגיות (אלקטרופיטיות, שאיפה מיקרופיפטה) כדי להשיג ולאפיין את התכונות המכאניות של שלפוחיות ענק והאחרונה "מתקדמים" ממברנה קרום התא מודלים היברידי פולימר שומנים ענק שלפוחיות4,5.
המטרה של שיטות אלה היא להשיג מדידה אמינה של האזור בכיפוף וכיפוף מודולים של קרום, כמו גם מתח הפירוק שלהם ואת המתח. אחת הטכניקות הנפוצות ביותר למדוד קשיחות כיפוף של שלפוחית שלפוחית ענק הוא ניתוח תנודות6,7, מבוסס על מיקרוסקופ וידאו ישיר תצפית; אבל זה דורש תנודות גדולות בקרום הממברנה, והוא לא מתקבל באופן שיטתי על קרומים עבים (למשל פלזומים). מודול השטח ניתן לניסויים בשיטת לאנגיור בלופ, אך לרוב על מונאולייר8. טכניקת השאיפה של המיקרופיפטה מאפשרת את המדידה של שני המודולקים על ידי היווצרות unilamellar שלפוחית לפוחית ענק (בוס) בניסוי אחד.
השיטה הבאה מתאימה לכל המולקולות האמפיפיטיות או קרו מסוגלות ליצור בילאיירס וכתוצאה מכך, שלפוחיות על ידי מערך אלקטרוריות. זה דורש אופי נוזלי של הביאייר בטמפרטורה של היווצרות החשמל.

<table><tbody><tr><td>ציוד וחומרים נדרשים לתכנון מיקרופיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט נימי זכוכית</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td>קוטר חיצוני ופנימי של 1 מ"מ ו-0.58 מ"מ בהתאמה.</td></tr><tr><td>נימה התקינה</td> את <td>Sutter Instrument Co.</td><td>FB255B</td><td>2.5 מ"מ * 2.5 מ"מ קופסה נימה</td></tr><tr><td>בוערת / חום Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>דגם P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>NARISHGE Co.</td><td>MF-900</td><td>מצויד בשתי מטרות (10x ו-32x)</td></tr><tr><td>חומרים לציפוי קצות פיפטה עם BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>מזרק חד פעמי 1 מ"ל Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>מזרק חד פעמי 10 מ"ל Luer Tip</td><td>Codan</td><td>626616</td><td></td></tr><tr><td>מזרק חד פעמי 5 מ"ל Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תאית אצטט חד פעמי</td><td>Cluzeau Info Labo</td><td>L5003SPA</td><td>גודל נקבוביות: 0.22&micro; מ', קוטר: 25 מ"מ</td></tr><tr><td>צינורות נימי סיליקה התמזגו גמישים</td><td>Polymicro Technologies.</td><td>TSP530660</td><td>קוטר פנימי 536&micro; m, קוטר חיצוני 660&micro; m,</td></tr> <tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 500 ומיקרו; L luer Lock GASTIGHT</td><td>Hamilton Syringe Company</td><td>1750</td><td></td></tr><tr><td>מערבל סיבובי מבחנה</td><td>Labinco</td><td>28210109</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולציה הגדרה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסילה אופטית אלומיניום, אורך 1000 מ"מ, חוטי M4, סדרת X48</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שולחן אופטי משוכך</td><td>ניופורט</td><td></td><td>משמש כתמיכה במיקרוסקופ למניעת רעידות חיצוניות.</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP 2</td><td>יחידת המודול (יחידת מנוע לתנועת X, Y ו-Z) מותקנת על המיקרוסקופ ההפוך באמצעות מתאם.</td></tr><tr><td>מיקרומטר</td><td>Mitutoyo Corporation</td><td>350-354-10</td><td>ראש מיקרומטר LCD דיגימטי 25,4 מ"מ טווח 0,001 מ"מ</td></tr><tr><td>מאגר מים פרספקס (100 מ"ל)</td>מיקרוסקופ קונפוקלי <td>הפוך TCS SP5 תוצרת</td><td></td><td></td>בית</tr><tr><td>(DMI6000) מצויד בסורק תהודה ומטרת טבילה במים (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td>מנשא מסילה <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X48 80 מ"מ אורך, עם חוט 1/4-20, 8-32 ו-4-40 ניופורט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומרים להכנת תמיסת סוכרוז ואמפיפיל<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank"> 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</a></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>22711.244</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810146C</td><td>Rhodamine מתויג ליפיד</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Electroformation הגדרה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L זכוכית נימי טבעות</td><td>Hirschmann</td><td>9600110</td><td></td></tr><tr><td>חד פעמי 1 מ"ל מזרק Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>H גריז</td><td>Apiezon</td><td>Apiezon H גריז</td><td>ללא סיליקון</td></tr><tr><td>אינדיום תחמוצת פח מצופה זכוכית שקופיות</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' 703184</td><td></td></tr><tr><td>מחט</td><td>Terumo</td><td>AN2138R1</td><td>0.8 x 38 מ"מ</td></tr><tr><td>אוהם מטר (מולטימטר)</td><td>Voltcraft</td><td>VC140</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>VWR</td><td>28676.297</td><td></td></tr><tr><td>מחולל מתח</td><td>Keysight</td><td>33210A</td><td></td></tr></tbody></table>

obtention של ענק unilamellar היברידית ושלפוחיות על ידי אלקטרוונטור ומדידה של תכונות מכניות שלהם על ידי שאיפה מיקרופיפטה

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

שלפוחיות ענק שהתקבלו מפוספוליפידים וסופולימרים יכולים להיות מנוצלים ביישומים שונים: מסירה מבוקרת וממוקדת של תרופות, זיהוי ביולוגי בתוך הביו-חיישנים לאבחון, ממברנות פונקציונליים לתאים מלאכותיים, ופיתוח של ביו-כורים מיקרו/ננו-בהשראת. בכל היישומים הללו, האפיון של תכונות הממברנה שלהם הוא בעל חשיבות בסיסית. בין טכניקות האפיון הקיימות, שאיפה של מיקרופיפטה, חלוץ על ידי ה-אוונס, מאפשר את המדידה של תכונות מכניות של הממברנה כגון מודול האזור, כיפוף מודול הלחץ ומתח. כאן, אנו מציגים את כל המתודולוגיות והליכים מפורטים כדי להשיג שלפוחיות ענק מתוך הסרט הדק של השומנים או קופולימר (או שניהם), הייצור ועל פני השטח של מיקרופיפטות, ואת ההליך שאיפה המוביל למדידה של כל הפרמטרים שהוזכרו קודם לכן.

עם הפרוטוקול הנ ל, למדנו שונים unilamellar שלפוחית לפוחית סינתטי (בוס), שהתקבל מ פוספוליפיד: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-גלידו-3-פוספהולין (popc), משולש קופולימר: פולי (ethyleneoxide)-b-פולי (diמתיל siloxane)-b-פולי (ethyleneoxide) (peo12-b-pdms43-b-peo12) מסונתז במחקר הקודם13, ו diblock קוולר פולי (diמתיל siloxane)-ב-פולי ( ethyleneoxide) (PDMS27-ב-peo17</su...

מטרת הפרוטוקול היא למדוד באופן אמין תכונות מכניות של ממברנה של שלפוחיות ענק על ידי שאיפה מיקרופיפטה.

Obtention של ענק Unilamellar היברידית ושלפוחיות על ידי אלקטרוונטור ומדידה של תכונות מכניות שלהם על ידי שאיפה מיקרופיפטה

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

פרוטוקול זה מאפשר מדידה אמינה של תכונות מכניות קרום של ורירית שומנים פולימרית סינתטית ואמתית באמצעות טכניקת שאיפה micropipette. זוהי הטכניקה היחידה המאפשרת גמישות קרום וחוסר יציבות להיות מתוח להיות מוערך בניסויים בודדים. פרוטוקול זה כרוך בסדרה של הליכים מהכנה קשה להערכה המכנית.חשוב מאוד להיות סבלניים ולפתור בעיות טכניות כפי שהם מתעוררים. הדמיה על טכניקות אלה היא קריטית להבנת כיצד לטפל כראוי את פני השטח נימי וכיצד לבצע את הצעד prestress חובה. מראה את הווסקל ללא פגמים.הליך ההדגמה יהיה מרטין Fauquignon, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה עובד על הפיתוח של ורי השומנים פולימר היברידית. לפני תחילת ההליך למקם נימים micropipette זכוכית קרה אנכית לתוך המחזיקים. ומנמיכים את המחזיקים עד שהטיפים שקועים בתספורת אלבומין בסרום גלוקוז טרי מוכנה בן לילה.למחרת בבוקר הפתרון היה צריך לעלות על סנטימטר אחד לתוך הטיפים על ידי פעולה נימי. בעזרת מזרק זכוכית 500 מיקרוליטר, המצויד בנימים גמישים של סיליקה מותכת, ממלאים כל פיפטה בתתבנת הגלוקוז. לאחר מכן שאף את הפתרון מכל פיפטה, לפני מילוי פיפטות עם פתרון גלוקוז טרי מספר פעמים עד כל הסרום כפי שהוסר.כדי להכין תא אלקטרופורמציה, ראשית לנקות ITO מחליק עם ממס אורגני מתאים, ולזהות את המשטח מוליך עם Ohmeter. חבר חוטי חשמל לצד ה מוליך של כל שקופית עם סרט דבק. טובלים נימי אחד בתסכום אמפיבי עד לכ-5 מיקרוליטרים של הפתרון נאסף על ידי פעולה נימית.מניחים את נימי טעון במגע עם מרכז צלחת ITO זכוכית אחת בעדינות להפיץ את הפתרון על פני השקופית. כאשר הממס התאדה לחלוטין, להחיל את הפתרון פעמיים נוספות כפי שהוכח רק. לפני הוספת שכבה של שומן ללא סיליקון משני צידי המרחב O-ring שנפתח סביב שטח התצהיר.לאחר מכן, מניחים את הפנים מוליך של צלחת זכוכית ITO שנייה על החלק העליון של המרחב, וממקמים את תא האלקטרופורמציה תחת ואקום במשך 3 שעות כדי להסיר כל עקבות של ממס אורגני. לקבלת האלקטרופורמציה של וריקלים יונימלריים ענקיים, חבר את החוטים החשמליים לגנרטור. הגדר את תדר הגנרטור ל-10 הרץ, ואת משרעת ל-2 וולט, שיא לשיא.כאשר המתח נקבע, השתמש במזרק המצויד במחט בקוטר פנימי של 0.8 מילימטר כדי להזריק מיליליטר אחד של תוסף סוכרוז טוחנת 0.1 לתא, ולהשאיר את התא מתחת למתח ולתדירות המוחלים למשך 75 דקות. בסוף האלקטרופורמציה, כבה את הגנרטור. ולהשתמש במזרק מיליליטר אחד כדי לשאוף נפח קטן של פתרון עד בועת אוויר מיוצר בתוך התא.להטות את התא מעט כדי להזיז את הבועה לתוך התא, ולעזור veים להתנתק מפני השטח של השקופית. ושאוף את כל נפח הפתרון למזרק. לאחר מכן, להעביר את הפתרון קשה לתוך צינור פלסטיק מיליליטר אחד.כדי להקים את החומרים עבור micromanipulation, שאף כדי ליצור זרימת מים, מיכל של מים טהורים, למחזיק אחד. והקש קלות תוך כדי הרמת הטנק כדי לחסל את כל בועות האוויר, וליצור לחץ חיובי. ממלאים נימי מצופה בסרום בתספורת גלוקוז טרי עד שנוצרת טיפה בקצה.מוציאים את צינורות המזרק ממחזיק המתכת כדי ליצור זרימת מים קלה בקצה המחזיק, ולהפוך את נימי במהופך כדי לחבר את טיפת הגלוקוז לזרימת המים. לאחר מכן, לדפוק את נימי ואת המחזיק יחד. כדי למקם את פיפטה, הדבק שתי שקופיות זכוכית מתוך שלב אלומיניום בהתאמה אישית יחד עם שומן ואקום.ולהתקין את השקופיות על שלב מיקרוסקופ. באמצעות פיפיאט מיליליטר אחד, טופס מניסקוס בין שתי השקופיות עם 0.1 גלוקוז טוחן. מניחים את הפיפיט והמחזיק שלו על יחידת המנוע של המיקרומניפולטור.הדקו את כפתור ההידוק, ולהשתמש בג'ויסטיק של לוח הבקרה במצב גס. מנמיך את המיקרופיט ליד מניסקוס הגלוקוז. השתמש במצב עדין כדי להתאים את המיקום של הקצה למרכז המניסקוס.טובלים את הקצה בגלוקוז כדי לנקות את המשטחים החיצוניים והפנימיים שלו. לאחר מספר דקות, מוציאים את נימי המניסקוס ומחליפים את הגלוקוז במניסקוס טרי. שאפו שני מיקרוליטרים של ורי ורי ענק של יונימלר בסוקרוז טוחנת 0.1, לקצה מיקרופיפט של 20 מיליליטר.הציגו את הווסיקים לתוך המניסקוס. השתמש במיקרוסקופ כדי להתבונן בווסיקלים בתחתית תא השקופיות. כאשר הווסיקלים מנוכרים מעט, יש להחזיר את פיפט היניקה ולהתמקד בקצה הפיפטה.לאחר מכן הגדר את הגובה הבסיסי של מיכל המים ללחץ שבו תנועת החלקיקים נעצרת. הקיפו את המניסקוס בשמן מינרלי כדי למנוע אידוי. כדי לבצע ניסוי שאיפה micropipette, להוריד את קצה פיפטה לתוך המניסקוס.צור כמות קטנה של לחץ יניקה כדי לשוכם יצור. קרום הווסקל שנבחר צריך להשתנות מעט ולא צריך להציג פגמים גלויים. השתמש במיקרומניפולטור כדי להעלות את הפיפטה לרמה גבוהה יותר כדי לבודד את הווסקל שאפתן משאריות אחרות.מנמיכים את מיכל המים לכ-10 ס"מ כדי לקדם את הווסקל לפני הרמת המיכל כדי להחזיר את הלחץ לערך הראשוני. מגובה של 0.5 ס"מ, לאט לאט להקטין את לחץ היניקה עד לחץ שבו תנודות הממברנה הוא הגיע. ואז להגביר את הלחץ כדי לדמיין בבירור לשון בקצה, אורך ההקרנה של כמה מיקרון.כדי לקבוע את מודולוס כיפוף, להגדיל את לחץ היניקה, מיקרומטר אחד בכל פעם באופן צעד אחר צעד. עד 0.5 עד 0.8 מיליטון למטר הוא הגיע. מחכה חמש שניות, ומצלם תמונה של הלשון אחרי כל צעד.כדי לקבוע את מודולוס דחיסת האזור, מתח תזה ומתח ממשיכים להגביר את לחץ היניקה מ 0.5 מיליNewtons למטר עד המתח קרע הוא הגיע. בניסוי מייצג זה מודולוס דחיסת שטח זן תזה עבור POPC היו בהסכמה מושלמת עם זה צפוי מן הספרות. בטבלה זו ניתן לראות ערכים אופייניים לפולימרסומים המתקבלים.שים לב כי הקשיחות של הממברנה המתקבלת קופולימרים diblock הוא הרבה יותר גדול מאלה המתקבלים קופולימר טריבלוק. מעניין, באמצעות קופולימר דיבלוק, ניתן להשיג ענק היברידית יונימיליאר ליפיד פולימר Vesicles להפגין קשיחות חזקה יותר מזה נמדד ליפוזומים. פרוטוקול זה יכול להיות מועיל למדידת וריחיים עם פיפטה, למשל, כדי למדוד את חדירות הממברנה באמצעות הלם אסמטי.הקפד להשלים כל שלב בקפדנות ובדיוק, במיוחד בעת הגדרת חיבור הטריביון. טכניקה זו נוצל כדי להבין את המקור הפיזי של ביקוע קרום, באמצעות מדידת מתח קו בגבולות העיקריים קשה שונה.

obtention-giant-unilamellar-hybrid-vesicles-electroformation

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

בנייה מחדש של חלבונים בממברנה פונקציונליים ליפוזומים ענקים של הרכב מוגדר היא גישה רב עוצמה בשילוב עם electrophysiology תיקון מהדק. עם זאת, ייצור liposome ענק קונבנציונלי עשוי להיות בקנה אחד עם יציבות חלבון. אנו מתארים פרוטוקולים לייצור ליפוזומים ענקים משומנים טהורים או ליפוזומים קטן המכיל תעלות יונים.

הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית ​​עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

הכינון מחדש של החלבון הטרנסממברני, KvAP, לתוך שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) הוא הוכיח לשתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation, ונפיחות בסיוע ג '. בשני השיטות, שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה החלבון הם התמזגו יחד כדי ליצור GUVs כי אז יכול להיות שנחקר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

אנו מתארים פרוטוקול להכנת שכבות דו-שכבתיות ליפידים נתמכות ואפיונו באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי וספקטרוסקופיית כוח.

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

ניסויים שלב מופרדים unilamellar ענק שלפוחית (כשמרוגזים) לעתים קרובות להזניח את התנאים פיזיולוגית. עבודה זו מציג גישות לחקר השפעת מליחות גבוהה מאגר על נוזל-נוזל שלב ההפרדה בין האנשים שנגדם ל טעונה כפונקציה של טרנס-הממברנה לפתרון האסימטריה ואת הטמפרטורה.

שלב התנהגות של שלפוחית טעונה בתנאים פתרון סימטרי אסימטרי במעקב עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

חלבונים רבים בתא לחוש, זירוז עקמומיות ממברנה. אנו מתארים שיטה למשוך ממברנה צינוריות מן השומנים שלפוחית את האינטראקציה של חלבונים או כל מולקולה עקמומיות-פעיל עם ממברנות מעוקל חוץ גופית בתוך.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

אנו מציגים טכניקה עבור המיקרומניפולציה ללא מגע של שלפוחית, באמצעות מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות. Microinjection של פתרון יון סידן, באזור שלפוחית השומנים ענק, מנוצל כדי לשפץ ממברנה השומנים, וכתוצאה מכך הייצור של בליטות צינורי ממברנה.

ממברנה שיפוץ של שלפוחית ענקית בתגובה מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

מאמר זה מציג שיטה להכנת שלפוחיות ענק חד-תכליתיות (cGUVs) בעלות מבנה שלפוחית בתוך שלפוחית, עם מוליכות חשמלית מותאמת אישית באזורים פנימיים, טבעתיים וחיצוניים. אלקטרופורמציה מסנתזת GUVs פשוטים, שהופכים לסטומטוציטים ו-cGUVs באמצעות הלם אוסמוטי, ומספקים מודל רב ערך לחקר הביופיזיקה של תאים גרעיניים.

סינתזה של שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות: מודל ביומימטי של תאים גרעיניים

מדריך זה למתחילים מציג פרוטוקול כללי להכנת שלפוחיות ענק חד-פעמיות (GUVs) באמצעות שיטת העברת טיפות, דן בשלבים הקריטיים ומספק תובנות שיעזרו להתאמות אפשריות הנדרשות ליישומים שונים, כולל ביולוגיה סינתטית ומיקרו-רובוטיקה.

שימוש בשיטת העברת טיפות להכנה אמינה של שלפוחיות יונילמלריות ענקיות

למד כיצד למדוד תכונות מכניות של קרומי שפופרות ענקיות חד-שכבתיות באמצעות טכניקת שאיפת מיקרופיפטה. שיטה זו מאפשרת הערכת גמישות ויציבות הקרום בניסוי בודד.

Obtention של ענק Unilamellar היברידית ושלפוחיות על ידי אלקטרוונטור ומדידה של תכונות מכניות שלהם על ידי שאיפה מיקרופיפטה

גלה סרטונים נוספים