הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

זה קריטי לשלב ביעילות יעילות לכידה עם תצפית דינמית של תמונת תא חי כדי להבין את ההשפעה של אינטראקציה בין תאים לתאים על התנהגויות תאים. צינור זה יכול ללכוד ביעילות רבה תאים בודדים מרובים בתא גדול יותר, ולספק בסיס תרבויות מספיק, למעקב דינמי של התנהגויות אינטראקציה מרובות של תא יחיד. התחל בהכנת התקן PDMS.

מניחים תבנית רקיק בצלחת השקילה עם 100 microliters של טריכלורוסילאן ב desiccator ולהחיל ואקום במשך 15 דקות. עצרו את הוואקום ומליחים את תבנית הוופלים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. מערבבים את בסיס PDMS ואת סוכן ריפוי PDMS ביחס של עשר לאחד, ולאחר מכן לשפוך סך של 20 גרם של התערובת על עובש רקיק בצלחת 15 ס"מ.

מניחים את המנה 15 ס"מ לתוך desiccator ולהחיל ואקום במשך 1 וחצי דקות. לאחר מכן להסיר את המנה מן היודש ולחסל בועות אוויר שיורית PDMS עם גז חנקן. לרפא את PDMS על ידי הנחת המנה בתנור ב 65 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עד ארבע שעות.

בסיום, הסר את העותק המשוכפל של PDMS מתבנית הוופלים ולחץ על משקע של 1.5 מילימטר ושקע של 0.5 מילימטר ב- PDMS. נקה את העותק המשוכפל של PDMS ואת משטח השקופית באמצעות סרט נשלף. טפל במשטח עם פלזמת חמצן.

לאחר מכן, ליישר באופן ידני את העותק המשוכפל PDMS עם השקופית ולהביא אותם במגע אחד עם השני. השאירו את מגלשת ה-PDMS בתנור של 65 מעלות ליום אחד. למחרת, לטבול את התקן PDMS במיכל מלא PBS.

מניחים אותו לתוך desiccator, ולהחיל ואקום במשך 15 דקות. להעביר את המכשיר למכסה המנוע של תא תרבות ולעקר אותו עם אור UV במשך 30 דקות. החלף את מאגר התקן PDMS במדיום והדקר אותו בארבע מעלות צלזיוס ליום אחד.

כאשר התאים להשיג 70 עד 80%confluency, להסיר את מדיום התרבות בעדינות לשטוף אותם שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של PBS. הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום DMEM/F-12 המכיל צבע פלואורסצנטי מיקרומולרי אחד לתאי WNT5B sh4 ו-pLKO-GFP, והדגירה אותם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, לשטוף בעדינות את התאים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של PBS סטרילי, להסיר את PBS, ולהוסיף שני מיליליטר של 0.25%Trypsin-EDTA.

דגירה התאים במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בעדינות הקש על צלחת התרבות כדי לקדם את ניתוק התא. הוסף ארבעה מיליליטר של DMEM / F-12 בינוני כדי לפזר WNT5B sh4 ו pLKO-GFP תאים, להעביר את התאים לתוך צינור 15 מיליליטר צנטריפוגה אותם ב 300 xg במשך שלוש דקות. הסר את העל-טבעי והשהה בעדינות את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום DMEM/F-12.

הכינו מיליליטר אחד של השעיית תאים בריכוז של שלוש פעמים עשר עד חמישית תאים למיליליטר ולשמור אותו על קרח כדי למנוע צבירת תאים. חבר את צינור הפוליטטרהפלואורואתילן בין שקע ההתקן למשאבת המזרק. הסר את המדיום, והוסף מיקרוליטר אחד של מתלי התא המוכנים לתוך התוך ההתקן PDMS.

לאחר מכן, לטעון את מתלי התא לתוך המכשיר באמצעות משאבת מזרק בקצב זרימה של 0.3 microliters לדקה. הוסף מיקרוליטר אחד של מדיום DMEM/F-12 לתוך התוך ההתקן ולאחר מכן טען את המדיום לתוך ההתקן באמצעות משאבת מזרק. טען 0.3 מיקרוליטרים של מדיום DMEM/F12 לתוך המכשיר עם משאבת המזרק בקצב זרימה של 10 מיקרוליטרים לדקה.

לאחר התאים נטענים, להסיר את הצינור, ולאטום את inlet ושקע עם סרט פוליאולפין כדי ליצור מערכת תרבות סגורה. העבר את התקן PDMS לצלחת תרבות של 10 ס"מ והוסף 10 מיליליטר של PBS סטרילי סביב המכשיר כדי למנוע אידוי של מדיום. מעבירים את צלחת התרבות לאנקובטור לתרבות משולשת של תאים בודדים.

להתקן PDMS מבנה בן שלוש שכבות עם אתר לכידה המתחבר לתא התרבות ולערוץ המעקף. ההבדל בהתנגדות לזרימה בין תא התרבות לערוץ המעקף מאפשר לתא לזרום לתוך תנוחת הלכידה, מה שגורם לתא הבא לעבור דרך ערוץ העקיפה לאתר הלכידה הבא. שלב הרפלוקס משמש לשחרור התא מאתר הלכידה ולשליחתו לתא התרבות.

יעילות לכידת התאים של פרוטוקול זה הוערכה בשלושה סוגי תאים שונים. תאי אנדותל לימפוטיים אנושיים, או LECs, קרצינומה של תאי קשקש אוראלי אנושי T2.6 תאים המבטאים WNT5B ספציפי סיכת ראש קצרה RNA, ותאי בקרה וקטוריים pLKO-GFP. יעילות הלכידה החד-תאית של שלושת התאים שהודגמה הייתה כ- 71% עבור ה- LECs, 74% עבור תאי WNT5B sh4 ו- 78% עבור תאי pLKO-GFP.

יעילות הלכידה המשולשת של תא יחיד הייתה 48%%שיטה זו יכולה לשמש עבור תרבויות מרובות של תאים אנדותל לימפתיים ותאי סרטן מימיים, והתרבות והמורפולוגיה של התא ניתן לראות תחת מיקרוסקופ. חשוב לוודא כי מתלי התא המוכנים כוללים צבירות תאים מינימליות, מכיוון שצבירה של תאים לא רק מפחיתה את יעילות הזוגיות הבודדת, אלא גם יכולה לסתום את ערוצי המיקרו. אינטראקציה בין תאים בודדים ממלאת תפקיד חשוב בשליטה על אופני פעולה של תאים.

השיטה שלנו יכולה לספק כלי יעיל שיסייע לחוקרים לחקור אינטראקציה בין תאים ברמת תא יחיד, מה שעלול להוביל לגילוי מנגנונים חדשים שלא ניתן להשיג בקלות ממחקרים מבוססי אוכלוסייה.