Name: אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: למדו שיטה חישובית להנדסת אשכולות DNA מלאכותיים מ-miRNAs לטיפול גנטי בגליובלסטומה. הפרוטוקול מאפשר מודולציה סימולטנית של מיקרו-RNAs מרובים בתאים אוקריוטיים ללא צעדי שיבוט מולקולריים מורכבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לחברי המעבדה הארווי קושינג נוירו אונקולוגיה לתמיכה וביקורת בונה. עבודה זו נתמכת על ידי NINDS מענקים K12NS80223 ו K08NS101091 ל P. P.

1. אפיון מירכי הקשורים פונקציונלית בגלינובלסטומה
<ol><li>ניתוח של ביטוי נרחב miRNA הדיפרנציאלי במוח גלנובלסטומה
	<ol>
<li>ראשית, בדוק את מירנאס החוצה. באופן משמעותי ביותר בגידול ניתן להשיג זאת באמצעות לפחות שלוש שיטות שונות:<ol>
<li>שלי הגנום אטלס הסרטן, נמצא ב https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, עבור רצף נתונים11.</li>
			<li>לבצע ניתוח microarray מתוך מדגם פעיל חדש12.</li>
			<li>השתמש בערכות נתונים שפורסמו בעבר13. הערה: באיזו שיטה נבחר, הפלט מספק קבוצה גורפת של miRNAs אשר הביטוי הוא מתאם סטטיסטית (או ישירות או הפוך) עם ביולוגיה של הגידול. קבוצה ראשונית זו מהווה את מאגר miRNAs שנותחו עוד לזיהוי קבוצת משנה של miRNAs המציגה את השיוך התפקודי הקפדני ביותר על-ידי ביצוע ניתוח דינמי יותר של שינויי ביטויים, כפי שמתואר להלן.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח ביטוי מיוחד לתנאי miRNA
	<ol>
<li>אינדוקציה של בידול התא:<ol>
<li>השתמש במנות פלסטיק מצופות מראש ללייזין (PDL) כדי להעדיף את היווצרות התרבות המונאולייר. עבור ציפוי צלחת, לפזר PDL במים בריכוז של 100 μg/mL. השתמש 1 mL של פתרון לכל 25 ס"מ על פני שטח2 . לשטוף 2x עם PBS 6 h לאחר היישום של פתרון PDL.</li>
			<li>צלחת בתאי גזע עצביים האדם בכמויות שוות (100,000 תאים/5 mL) או בינונית תא גזע (נוירובלית בינונית + B27 + 20 ng/mL EGF/FGF), בידול astrocytic (DMEM דיום + 10% FGF), או מדיום בידול עצבי (נוירובסיס בינונית + B27 תוספת, + 2 חומצות μM retinoic)14. הפרוטוקול עבור אוליגודנדרוציטים בידול דורש תוספת IGF-1 (200 ng/mL) לאחר הסרת egf/fgf14,15.</li>
			<li>לאחר ציפוי תא, מקום בחממה לשבוע 1 ב 37 ° c, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הוצאת רנ א:<ol>
<li>לאחר 7 ימים, להסיר את התאים מהאינקובטור ולהסיר את המדיום.</li>
			<li>שטוף את התאים עם PBS (5 מ"ל). לאחר מכן, להוסיף 1 מ ל של מגיב לפירוק (ראה טבלת חומרים) כדי lyse את התאים ומגרד את התאים לתוך 1.5 mL microfuge הצינור באמצעות מגרד התא. שמור את הצינורות המכילים את התאים למטה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות.</li>
			<li>המשך לבידוד RNA מוחלט בעקבות הוראות היצרן.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניתוח ביטוי miRNA:<ol>
<li>לכמת את הביטוי הדיפרנציאלי של miRNAs ספציפיים שזוהו בשלב 1.1 בקרב שלושת דפוסי הבידול על ידי ה-PCR בזמן אמת, באמצעות בדיקה TaqMan ובעקבות פרוטוקולי היצרן עבור תמלול והגברה PCR ( איור 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>אימות מושבות miRNA על ידי אתגרים ספציפיים למתח
	<ol>
<li>תרבות G34 גלנובלסטומה בתאי גזע בינונית נוירובסיס + B27 תוספת + 20 ng/mL EGF/FGF. התחל עם 1 x 106 תאים 5 מ ל ב 25 ס מ2 בקבוקון מצורף נמוך.</li>
		<li>החל 48 h לאחר ציפוי, להוסיף ריכוזי ההכפלה של הסוכן temozolomide al, הסוכנת של DNA (TMZ) כל 5 ימים, כדלקמן:<ol>
<li>התחל עם 5 μM במשך 5 ימים. לאחר 5 ימים, להסיר את המדיום ולהחליף עם מדיום טרי ללא temozolomide, כדי לאפשר לתאים ששרדו להתאושש. לאחר 48 h, להוסיף 10 μM TMZ ו הדגירה עבור עוד 5 ימים.</li>
			<li>חזור על שלב 1.3.2.1, הכפלת TMZ הריכוז בכל פעם, עד ריכוז של לפחות 100 μM הגיע ותאים להיות עמידים בפני הסם10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בניסוי מקבילי, מקרין G34 תאים כדלקמן:<ol>
<li>החל 48 h לאחר ציפוי 1 x 106 תאים ב 5 מ ל ב 25 ס מ2 בקבוקון מצורף נמוך, הפעלת תאים עם 2 Gy של אנרגיה (כל הקרנת מתן לפליטת פוטון הוא מקובל). החזר את התאים אל החממה ואל תפריע. לאחר 48 h, להקרין את התאים שוב עם 2 Gy של אנרגיה נוספת.</li>
			<li>חזור על השלב 1.3.3.1 4x עד סך של 10 Gy של אנרגיה מנוהל.</li>
			<li>להחזיר את התאים לחממה ולתת להם להתאושש בינוני טרי לפחות 5 ימים לפני ניתוח במורד הזרם.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לאחר אינדוקציה של התנגדות, התאים lyse באמצעות מגיב לפירוק לחלץ כולל RNA על פי פרוטוקול של היצרן.</li>
		<li>לנתח את הביטוי של miRNAs מסוימים שזוהו בסעיפים 1.1-1.2 כפי שמתואר בשלב 1.2.1 (איור 2).</li>
	</ol></li>
	<li>אפיון ההתכנסות הפונקציונלית של מירנאס באשכולות
	<ol>
<li>השג את המיקוד החזוי של כל miRNAs מוגדר בסעיפים 1.2-1.3 המתקבלים באמצעות Mirnas כלים חיזוי היעד. הערה: אנחנו בדרך כלל האתר TargetScan, כפי שאלגוריתם שלה מתעדכן מדי פעם16. כלים נוספים לחיזוי הם מירנדה17, mirdb18, ו דיאנה-mirdb19. כל התוכניות הללו הן יישומים מבוססי אינטרנט ללא תשלום.<ol>
<li>מהעמוד הקדמי של Targetscan, בחר באפשרות miRNA של עניין מהתפריט הנפתח שאוכלס מראש. לחץ על לחצן Submit .</li>
			<li>הורד את רשימת היעדים המתקבלת כגיליון אלקטרוני באמצעות הקישור לטבלת ההורדות (איור משלים 1).</li>
			<li>כדי להקטין את הסיכויים של תחזיות חיוביות שקריות, כלול רק מטרות בתוך עמודת האתרים ששומרו בניתוחי במורד הזרם. כמו כן, ניתן להשיג היתר נוסף באמצעות תוכניות חיזוי miRNA נוספות (ראה לעיל) ורק כולל מטרות המשותפות לכל האלגוריתמים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לסווג את היעד המתקבל על פי קטגוריות האונטולוגיה של גנים באמצעות ToppGene סוויטה20 כדי להעריך עבור העשרה של מסלולים המשותפים לכל mirna.<ol>
<li>הדבק את רשימת היעדים שהושגו משלב 1.4.1 בחלון "ערכת הגן הדרכה", באמצעות סמל HGNC כסוג הערך. לחץ על שלח &Gt; התחל. התוכנית תספק טבלת פלט המציגה את הקטגוריות "Go" המשמעותית ביותר עבור רשימת הגנים המוזנים (איור משלים 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>כדי לקבוע לבסוף את התרומה של כל miRNA לוויסות של מסלול משותף או תהליך הסלולר (במקרה זה, תקנה כרומטין), לבדוק כל היעד המתקבל בשלב 1.4.1 נגד הרשימה המלאה של גנים המעורבים בתהליך הסלולר הספציפי ( i.e., רגולציה כרומטין), באמצעות הפונקציה של דיאגרמת הקבוצות המסופקת באתר האינטרנט http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn. הערה: תוכנית זו מאפשרת הצטלבות של קבוצות מרובות בעת ובעונה אחת (איור 3). המטרות הייחודיות הספציפיות שסופקו על ידי כל miRNA מסומנים ונבחרו לניסויים פונקציונליים במורד הזרם.<ol>
<li>בעמוד הראשון של התוכנית, להעלות או להעתיק/להדביק את הרשימה אם היעד mRNAs עבור כל miRNA או עניין בחלונות המתאימים. שם כל רשימה עם מזהה ייחודי.</li>
			<li>לחץ על שלח. התוכנית תספק פלט חזותי של דיאגרמת חיתוך קבוצות עם מספר גנים בכל סקטור, כמו גם רשימה מלאה של mRNAs עבור כל שילובי משנה והצטלבות.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. הרכבת מודולים miRNA לתוך אשכול הטרנסגניים הפוליפוניים
<ol><li>
הכנת הגרדום הטרנסגניים על בסיס מקום האשכול מיר-17-92
	<ol>
<li>להשיג את הרצף נוקלאוטיד של האשכול מיר-17-92 מדפדפן הגנום Ensembl21. בחר את ~ 800 בסיס זוג בסיסי "רצף" המקיף את כל ששת הפינים מקודד miRNA של מקום ולפחות 200-נוקלאוטיד מאגפים רצפים הן במעלה (5 ') ו במורד הזרם (3 ') של רצף הליבה.</li>
		<li>הדבק את הרצף למעלה לכל תוכנית עריכת מילה.</li>
		<li>הגדירו את הרצף של כל אחד מששת סיכות השיער הילידים על ידי מחזורם ב-miRBase22. סמן כל אחד מרצפים אלה בטווח של רצף "הליבה" שזוהה בעבר. כל רצף בין כל צורה של סיכת מייצג רצפי מרווח, אשר חשובים לעיבוד הנכון של המשגר.</li>
		<li>הסירו את רצפי העצם המקוריים מרצף ה"ליבה", למעט 3-5 נוקלאוטידים בשני הקצוות של 5 ' ו-3 ', שישמשו כקבלה לסיכות השיער החדשות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בניית הקידוד החדש של מירגנים מרובים של בחירה
	<ol>
<li>לקבל רצפים סיכת ראש של miRNAs נועד להיות מבוטא יתר על השימוש ב-הטרנסגנים מ Mirnas. שים לב לנוקלאוטידים הספציפיים שבהם נמצאים האתרים של פצילות מיקרו-מעבד.</li>
		<li>החלף את סיכות השיער שהוסרו (שלב 2.1.4) עם רצפי סיכת ראש של miRNAs הרצוי שהתקבלו בשלב 2.2.1.</li>
		<li>הוסף רצפי הגבלה רצוי בשני האזורים האגפים של הטרנסגנים כדי להקל על שכפול משנה לתוך וקטורים מסירה של בחירה. ודא שרצפי ההגבלה שנבחרו אינם נוכחים ברצף עצמו.</li>
		<li>עבור פקדים שליליים, להשתמש 20-נוקלאוטיד רצפים מקושקשות להחליף את הטבעי 20-נוקלאוטיד רצף של כל miRNA בוגרת. צור רצפי מקושקשות אלה באמצעות כלי מקוון כגון https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אימות המבנה הדו-מימדי של הטרנסגנים
	<ol>
<li>העתק את רצף הטרנסגניים המלא לתוך תוכנת החיזוי של מבנה RNA RNAweb קפל23.</li>
		<li>באמצעות הגדרות תוכנית רגילה, לחץ על המשך.</li>
		<li>לנתח את הפלט הגרפי, במיוחד לנוכחות סיכות השיער מוגדרים היטב ונוכחות של מבני גזע כפול תקועים לפחות 11 נוקלאוטידים האבוטיים לאתר המחשוף מיקרו. כמו כן, חפשו את היעדר נקודות הסתעפות בתוך רצפי הראש (איור 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. קבלת טרנסגנים על ידי סינתזה DNA
<ol><li>לאחר העיצוב באימות סיליקו של האשכול הצ miRNA, לקבל את רצף העבודה באמצעות סינתזה DNA מספקים מסחריים24 ולהמשיך עם שיבוט במורד הזרם לתוך וקטורים ומסירה טרנסגנטית. השתמשנו וקטורים ויראליות עבור במסירה מחוץ למבחנה10 ו-adeno הקשורים וירוסים (aavs) עבור במסירה vivo גולגולתית25.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li>
<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li>
<li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer%27s+Disease%3A+A+Meta-Analysis+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767(2018).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciencesof+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li>
<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs%3A+tiny+regulators+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li>
<li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li>
<li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124%2C+%E2%88%92128%2C+and+%E2%88%92137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li>
<li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442(2019).</li>
<li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li>
<li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li>
<li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li>
<li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).</li>
<li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005(2015).</li>
<li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miRNA.org+resource%3A+targets+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li>
<li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRD%28B%29+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li>
<li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIANA-miRPath+v3.0%3A+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li>
<li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembl+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li>
<li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+from+miRNA+sequences+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li>
<li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vienna+RNA+Package+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).</li>
<li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly%3A+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).</li>
<li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li>
<li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li>
<li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li>
<li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li>
<li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).</li>
<li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li>
</ol>

המחברים אינם מדווחים על ניגודי אינטרסים.

פרוטוקול זה מבוסס על הרעיון כי במקום לתפקד בבידוד, miRNAs הם רלוונטיים ביולוגית על ידי עבודה בקבוצות, וקבוצות אלה נקבעים באמצעות ההקשרים הסלולריים הספציפיים26. כדי להצדיק גישה זו מנקודת מבט טרנסלתית, פרוטוקול המשך טיפול המאפשר בילוי של דפוס זה multi-miRNA בתאים/רקמות הוא הציג. זה אפשרי על ידי ניצול של ביוגנזה פשוטה יחסית של miRNAs, לפיו ההכרה של סיכת הראש האופיינית Mirnas על ידי מעבד הוא הכרחי ומספיק עבור עיבוד הנכון Mirnas27. במקביל, זו דרישה מינימלית מאפשר להשתמש הגרדום ה...

mirnas מציעים הזדמנות ללא תחרות לפיתוח של גישה טיפולית רחבה למחלות רבות1,2,3, כולל סרטן4,5. זה מבוסס על מספר תכונות ייחודיות של מולקולות ביולוגיות אלה, כולל גודל קטן שלהם6, biogenesis פשוט7, ונטייה טבעית לתפקד באסוציאציה8. מחלות רבות מתאפיינות בביטויים ספציפיים של ביטוי miRNA, אשר לעתים קרובות להתכנס על התקנה של פונקציות ביולוגיות מורכבות9. מטרת שיטה זו היא הראשונה להגדיר אסטרטגיה כדי לזהות קבוצות של miRNAs הקשורים בסינרגיה לפונקציות סלולריות ספציפיות. כתוצאה מכך, הוא מספק אסטרטגיה להקמת מחדש של שילובים כאלה של miRNA במחקרים ויישומים במורד הזרם.
שיטה זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של miRNAs מרובים בבת אחת, מינוף על המיקוד הסימולטני שלהם של מספר רב של mRNAs, ובכך ללכוד את הנופים המורכבים של מחלות. גישה זו הועסק לאחרונה כדי להגדיר קבוצה של שלושה miRNAs כי 1) הם בו מוסתות בו בסרטן המוח 2) להראות דפוס חזק ביטוי שיתוף במהלך בידול עצבי, כמו גם בתגובה ללחץ גנוטוקסיידי קרינה או . סוכן די. אנ. איי קומבינטורית re-ביטוי של מודול זה של שלושה miRNAs על ידי שיטת האשכול המתואר להלן תוצאות הפרעה עמוקה עם הביולוגיה של תאים סרטניים ניתן להשתמש בקלות כאסטרטגיה ריפוי גנטי למחקרים פרה-קליניים10. פרוטוקול זה עשוי להיות מעניין במיוחד לאלה המעורבים במחקר miRNA ויישומים הטרנסלבותית שלה.

<table><tbody><tr><td>0.4% טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז&nbsp;</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70058</td><td></td></tr><tr><td>0.45 ומיקרו; יחידת סינון סטרילית</td><td>M Merck Millipore</td><td>SLH033RS</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>עכברים אתימיים (FoxN1 nu/nu)</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תוסף&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים, 16 ס"מ</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>צזיום 137 irradiator&nbsp;</td>מתקן הליבה של <td>JL Sheperd and Associates</td><td>(בית הספר לרפואה של הרווארד)</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>439142-4L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s מי מלח חוצץ פוספט&nbsp;</td><td>ג'יבקו</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y תמיסה&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td>תמיסת פורמלין <td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr> תוסף תזונה <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המטוקסילין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1051750500</td><td></td></tr><tr><td>תאים דמויי גזע של גליומה ראשונית אנושית (GBM62)</td><td></td><td></td><td>מסופק על ידי ד"ר א. א. צ'יוקה (בריגהם ונשים) s בית חולים, בוסטון, מסצ'וסטס)</td></tr><tr><td>תאים דמויי גזע של גליומה ראשונית אנושית (MGG4)</td><td></td><td></td><td>מסופק על ידי ד"ר הירואקי ווקימוטו (בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בוסטון, מסצ'וסטס)</td></tr><tr><td>וקטור לנטי-ויראלי pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td><td>System Biosciences</td><td>CD511B-1</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה מקוררת</td><td>אפנדורף</td><td>דגם מס' 5424 R, מס' קט' 5404000138</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4112APG</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene צינורות צנטריפוגה תחתונים עגולים פוליקרבונט במהירות גבוהה&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>תאי אב עצביים (NPC)</td><td></td><td></td><td>מסופק על ידי ד"ר ג'ייקוב גודלבסקי (בריגהם ונשים s בית חולים, בוסטון, מסצ'וסטס)</td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon eclipse Ti מערכת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ממונעת</td><td>Nikon, Japan</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CLS6571-960EA</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פטרי-מנות 94/16&nbsp;</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>פולי-די-ליזין&nbsp;</td><td>סיגמא- אולדריץ'</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>EGF אנושי רקומביננטי&nbsp;</td><td>פפרוטק&nbsp;</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי FGF-בסיסי&nbsp;</td><td>פפרוטק&nbsp;</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>Gibco</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ערכת רנ"א מיני-פרפ</td><td>Direct-zol</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>S1000 מחזור תרמי&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו רדיאטור מונחה תמונה לבעלי חיים קטנים&nbsp;</td><td>Xstrahal Life Sciences, מתקן הליבה הבריטי</td><td>(מכון הסרטן דנה-פרבר, בוסטון, מסצ'וסטס)</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX+ אולטרה-צנטריפוגה&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>75000100</tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A1110501-StepOne</td><td></td></tr><tr><td>מערכת PCR בזמן אמת</td><td>יישומית ביו-סיסטמס&nbsp;</td><td></td><td></td>4376357</tr><tr><td>ארון הבטיחות הביולוגית SterilGARD&nbsp;</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>T98-G</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA ערכת שעתוק הפוך&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Temozolomide</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek טמפרטורת חיתוך אופטימלית&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9636948</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנט טריזול&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>מגיב ליזה</td></tr><tr><td>U251-MG</td><td>סוג אמריקאי קולקטי תרבות</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>U87-MG&nbsp;</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>ViraPower Lentivector Expression System&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>K4970-00</td><td></td></tr><tr><td>מים, HPLC כיתה</td><td>פישר</td><td>W54</td><td></td></tr><tr><td>קסילן&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון של mirnas הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

הרלוונטיות הביולוגית של microRNAs (miRNAs) בבריאות ובמחלות מסתמך באופן משמעותי על שילובים ספציפיים של מירנאס רבים בו בו במקום הפעולה של Mirnas יחיד. האפיון של אלה מודולים miRNAs ספציפיים הוא צעד בסיסי למקסם את השימוש בהם בטיפול. זה רלוונטי מאוד כי התכונות הקומבינטורית שלהם יכול להיות מנוצל כמעט. המתואר כאן היא שיטה להגדיר חתימה ספציפית miRNA רלוונטי השליטה של כרומטין repressors הכרומטוגניים ב glioblastoma. הגישה הראשונה מגדירה קבוצה כללית של miRNAs כי הם הפונים בגידולים בהשוואה לרקמות נורמלי. הניתוח מעודן עוד יותר על-ידי תנאי תרבות דיפרנציאלים, והבקיע קבוצת משנה של miRNAs אשר מבוטאים בו במהלך מדינות סלולר ספציפיות. בסופו של דבר, miRNAs כי לספק מסננים אלה משולבים לתוך הטרנסגנים מלאכותיים polycistronic, אשר מבוסס על פיגום של הגנים הקיימים מירונה אשכולות, לאחר מכן משמש ביטוי יתר של אלה מודולים Mirnas לתוך מקבל תאים.

שיטה זו אפשרה אפיון של מודול של שלושה miRNAs כי הם בעקביות מוסדר בגידולים במוח, אשר מבוטא במיוחד במהלך בידול עצבי (איור 1) ומעורב בתגובת הישרדות הגידול לאחר (איור 2). הדבר מתבצע על-ידי ויסות מסלול דכאואני כרומטין מורכב. תבנית הביטוי המשותף הציעה פעילות סינגיסטית חזקה בקרב שלושת מירנאס (איור 3). כתוצאה מכך, ניצול הגודל הקטן והביוגנזה הפשוטה של miRNAs, החלק השני של פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לעצב trans...

המתואר כאן הוא פרוטוקול לאפיון מודולים של miRNAs ביולוגית מירסטים וההרכבה שלהם לתוך טרנסגנים קצרים, אשר מאפשר ביטוי יתר בו של טיפול גנטי יישומים.

אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

פרוטוקול זה מאפשר אפנון בו זמנית של מיקרו RNAs רבים בתאים אוקריוטיים ומבוסס על שיטה פשוטה וגמישה מאוד הממזערת את שלבי השיבוט המולקולרי. טכניקה זו יש השלכות על המחקר של אינטראקציות פונקציונליות מיקרו RNA במבחנה, אבל יותר חשוב זה מספק פלטפורמה לשימוש יעיל יותר של מיקרו RNAs בטיפול. פיתחנו והשתמשנו בו בעיקר בהקשר של סרטן המוח, אבל זה חל על כל המחלות שבהן מעורבים שינויים מרובים של ביטוי גנים.בדקנו את הגנים הטרנסיים המלאכותיים שלנו במודלים אחרים כגון קווי סרטן השד ובלוטת התריס המראים את הרבייה של טכניקה זו. ידע בסיסי בביואינפורמטיקה וביולוגיה מיקרו-רנ"א מועיל לפרוטוקול זה, אך אינו הכרחי. גישה ביואינפורמטית חשובה כדי להגדיר שילובי מיקרו RNA רלוונטיים ואת TRK-11, בעוד היכרות עם עיבוד מיקרו RNA מדיד חשוב להבין כיצד אלה מיקרו RNAs שונים ניתן להרכיב לתוך אשכולות DNA מלאכותיים שניתן לעבד בהצלחה פעם אחת יציב לתאים הספציפיים.כדי לצפות את המנה, ראשית להמיס פולי-D-ליסין במים בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר. יוצקים את הפתרון לתוך המנה בכמות של מיליליטר אחד של פתרון לכל 25 ס"מ רבועים פני השטח. מערבלים את המנה כדי לוודא כיסוי של המנה כולה.לאחר שש שעות שאפו את תותב הפולי-די-ליזין ושטוף פעמיים עם PBS. תאי גזע עצביים אנושיים בכמות של 100, 000 תאים לכל חמישה מיליליטר של המדיום, או בתאי גזע בינוניים, מדיום בידול אסטרוציטי או מדיום בידול עצבי. לאחר ציפוי התא, מניחים את המנה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך שבוע ולהמשיך לבצע ניתוח ביטוי מיקרו RNA על פי כתב היד.לתרבות GBM-34 תאים דמויי גזע גליובלסטומה, להתחיל עם אחד 10 לתאים החמישי וחמישה מיליליטר של מדיום נוירובסאלי בבקבוקון חיבור נמוך 25 ס"מ מרובע. מניחים את הבקבוק באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. 48 שעות לאחר ציפוי, להוסיף הכפלת ריכוזים של DNA alkylating סוכן temozolomide כל שבעה ימים.התחל עם תוספת של חמישה micromolar TMZ בתוספת בינוני חמישה מיליליטר במשך חמישה ימים. לאחר חמישה ימים, להסיר את המדיום ולהחליף עם מדיום טרי ללא temozolomide כדי לאפשר לתאים ששרדו להתאושש. לאחר 48 שעות, מוסיפים 10 טמוזלומיד מיקרומולאריים ודגירה במשך חמישה ימים נוספים.חזור על הטיפול temozolomide הכפלה עד ריכוז של לפחות 100 micromolar הוא הגיע ותאים להיות עמידים לתרופה. לאחר אינדוקציה של התנגדות, לשקר תאים באמצעות 1 מיליליטר של ליסיס reagent. לחלץ RNA הכולל ולנתח את הביטוי של RNAs מיקרו ספציפי על פי כתב היד.כדי להשיג את היעד החזוי של כל מיקרו RNA שהוגדר בעבר, השתמש בכלי חיזוי מיקוד מיקרו RNA. מהעמוד הראשון של TargetScan, בחר את המיקרו רנ"א המעניין מהתפריט הנפתח המאוכלס מראש. לחץ על לחצן שלח.הורד את רשימת היעדים המתקבלת כגיליון אלקטרוני באמצעות הקישור לטבלת ההורדות. כדי להקטין את הסיכויים לתחזיות חיוביות שגויות, כלול רק יעדים בתוך העמודה אתרים שמורים וניתוח במורד הזרם. תוכניות חיזוי מיקרו-רנ"א נוספות מקבלות מחמירות נוספות וכוללות רק יעדים המשותפים לכל האלגוריתמים.לאחר מכן, פתח את סוויטת ToppGene 20. כדי להעריך להעשרת מסלולים המשותפים לכל מיקרו רנ"א, הדבק את רשימת המטרות המתקבלות בחלון ערכות הגנים המתאמן. לחץ על סמל HGNC כסוג הערך.לחץ על שלח והתחל. התוכנית מספקת טבלת פלט המציגה את קטגוריות GO המשמעותיות ביותר עבור רשימת הגנים שהוזנה. כדי לבסס סוף סוף את התרומה של כל מיקרו רנ"א לוויסות של מסלול משותף או תהליך תאי, פתח את פונקציית דיאגרמת ה- venn המסופקת באתר הביואינפורמטיקה והגנומיקה האבולוציונית.בדוק כל יעד שהושג מול הרשימה המלאה של הגנים המעורבים בתהליך התאי הספציפי. אם RNAs שליח היעד עבור כל RNAs מיקרו של עניין נמצאים בחלונות המתאימים, להעלות של העתק-להדביק את הרשימה. תן שם לכל רשימה עם מזהה ייחודי.לחץ על שלח. התוכנית מספקת פלט חזותי של דיאגרמת חיתוך קבוצות עם מספר גנים בכל מגזר, כמו גם רשימה מלאה של RNAs שליח עבור כל קבוצת משנה ושילובי הצטלבות. כדי לקבץ את המיקרו-RNAs שנבחרו לגן טרנס פונקציונלי, השג פיגום מהופנט המבוסס על לוקוס האשכול miR-17-92.השג את רצף הנוקלאוטיד מדפדפן הגנום ההרכב. בחר את רצף הליבה של 800 זוג הבסיסים המקיף את כל ששת סיכות השיער המיקרו-רנ"א המקודדות של הלוקוס ולפחות 200 רצפי אגף נוקלאוטידים הן במעלה הזרם והן במורד הזרם של רצף הליבה. הדבק את הרצף בכל תוכנית לעריכת מילים.הגדר את הרצף של כל אחד מששת סיכות השיער המקוריות על-ידי אחזורן בבסיס miR. סמן כל אחד מהרצפים האלה בטווח של רצף ליבה שזוהה בעבר. כל הרצפים בין כל סיכת ראש מייצגים רצפי רווחים.לאחר מכן, להשיג את רצפי סיכת ראש של מיקרו RNAs שנועדו להיות מעל לידי ביטוי בגן טרנס מבסיס miR. שימו לב היטב לנוקלאוטידים הספציפיים שבאתרים של מחשוף מעבד מיקרו. מחק את רצפי סיכות הראש המקוריים מרצף הליבה למעט שלושה עד חמישה נוקלאוטידים הן בחמשת הקצוות והן בקצוות של כל סיכת ראש אשר ישמשו כמקבל עבור סיכות הראש החדשות.הדבק את רצפי סיכות הראש של המיקרו RNAs הרצויים כדי להחליף את סיכות הראש שנמחקו בעבר. הוסף רצפי הגבלה רצויים בשני אזורי האגף של הגן הטרנסי כדי להקל על שיבוט משנה לווקטורים של מסירה לפי בחירה. ודא כי רצפי ההגבלה שנבחרו אינם קיימים בתוך הרצף עצמו.כדי לאמת את המבנה הדו מימדי של הגן הטרנס, העתק את הרצף המהונדס המלא לתוך RNA מבנה מבנה תוכנה RNA Webfold. בחר הגדרות תוכנית רגילות ולחץ על המשך. לנתח את הפלט הגרפי, במיוחד עבור נוכחות של סיכות שיער מוגדרות היטב בנוכחות מבני גזע תקועים כפולים כי הם לפחות 11 נוקלאוטידים proximal לאתר מחשוף מעבד מיקרו.כמו כן, חפשו את היעדר נקודות הסתעפות בתוך רצפי סיכות הראש. בשלב זה, הגן הטרנסי מוכן להיות מיוצר על ידי סינתזת גנים ומשכפל לווקטורים הרצויים. שיטה זו אפשרה אפיון של מודול של שלושה מיקרו RNAs כי הם באופן עקבי למטה מוסדר בגידולים במוח, אשר באים לידי ביטוי במיוחד במהלך בידול עצבי.דפוסי ביטוי שותף של מודולי מיקרו רנ"א במהלך הלחץ הגנוטוקסי אושרו והציעו פעילות סינרגטית חזקה בין שלושת המיקרו RNAs האלה. הגן הטרנסי המעוצב יכול בו זמנית לסכם את הביטוי של שלושת המיקרו RNAs בתאי גליובלסטומה, הן במבחנה והן במבחנה, עם הפרעה משמעותית בביולוגיה של הגידול והבטחת יכולת תרגום. בנוסף, האשכול הטרנסגני היה גם פונקציונלי במודל סרטן השד.הדרישות הקריטיות של פרוטוקול זה הן שמירה על הגודל המקורי של מחשוף המעבד בגן הטרנס. וודאו שמבנה לולאת הגזע של סיכות ראש מיקרו רנ"א כימריות נשמר. בשיטה זו, אנו יכולים לרכז מספר רב של גנים מיקרו RNA פעיל ביולוגית לתוך רצפי DNA קצרים מאוד אשר יכול ממש להיות מותאם באופן מוחץ לתוך כל וקטורים משלוח לשימוש ריפוי גנטי.שיטה זו היא אידיאלית כדי ללמוד את האינטראקציה הפונקציונלית בין מיקרו RNAs שונים להפריע מסלולים סלולריים multifactorial מורכבים אשר אחרת ידרוש שילובי תרופות מרובים.

characterization-functionally-associated-mirnas-glioblastoma-their

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

כאן אנו מתארים פרוטוקול יעיל ורב-תכליתי להשראה, ניטור וניתוח גליובלסטומה חדשה (GBM) באמצעות DNA טרנספוזון המוזרק לחדרים של עכברים יילודים. תאים של האזור התת-חדרי, התופסים את הפלסמיד, הופכים, מתרבים ומייצרים גידולים בעלי מאפיינים היסטו-פתולוגיים של GBM אנושי.

Transposon מתווך האינטגרציה של פלסמיד דנ&quot;א לתוך אזור Subventricular של עכברים בילוד ליצירת מודלים חדשניים של גליובלסטומה

MicroRNAs ממלאים תפקידים מכריעים במוח ומהווים מטרות פוטנציאליות למידול ניוון עצבי. עם זאת, הפרעה ברמות ה-miRNA היא מאתגרת בשל האורך הקצר של ה-miRNA וחוסר הנגישות של רקמת המוח. סרטון זה מציג שיטה לעיצוב אנטגומיר והעברה ספציפית למוח באמצעות נוירופפטיד בעכברים.

חלופה פשוטה להזרקת stereotactic למציאה ספציפית המוח של מירנה

Neurospheres גדל כמו תרבויות 3D מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד ביולוגיה glioma. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע אימונוהיסטוכימיה תוך שמירה על המבנה התלת-ממד של glioma neurospheres באמצעות הטבעה פרפין. שיטה זו מאפשרת אפיון glioma neurosphere מאפיינים כגון stemness ובידול עצבית.

הערכה של סמנים Glioma מאת אימונוהיסטוכימיה על תרבויות Neurosphere פרפין-מוטבע Glioma תלת-ממד

miRNA הרפוי יש פוטנציאל משמעותי בוויסות התקדמות סרטן. המודגמות כאן גישות אנליטיות משמשים לצורך זיהוי הפעילות של טיפול miRNA קומבינטורית להפסקת מחזור התא, אנגיוגנזה.

ניתוח של miRNA קומבינטורית טיפולים כדי להסדיר מחזור התא, אנגיוגנזה

פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ' אזורים לא מתורגמים (3 ' UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

לייזר לחיתוך מיקרו (LMD) היא טכניקה רגישה ומאוד לגילוי שניתן להשתמש בה כדי לחשוף מסלולים כי בתווך glioma טרוגניות ופלישה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב כדי לבודד אזורים נפרדים מרקמת glioma באמצעות LMD לייזר ואחריו ניתוח טרנססקריפט.

לכידת לייזר מיקרודיסקציה של גלימה Subregions עבור אפיון מרחבית ומולקולרית של טרוגניות Intrאטומוראלי, הנחלים, ופלישה

דיסרגולציה פרוטאומית ממלאת תפקיד חשוב בהתפשטות של גליומות המסתננות באופן מפוזר, אך מספר חלבונים רלוונטיים נותרו בלתי מזוהים. עיבוד מרחבי דיגיטלי (DSP) מציע גישה יעילה בעלת תפוקה גבוהה לאפיון הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מועמדים שעשויים לתרום לפלישה ולנדידה של גליומות מסתננות.

פרופיל מרחבי דיגיטלי לאפיון המיקרו-סביבה בגליומה מסוג בוגר המסתנן באופן מפוזר

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של עריכת גנים של גנים חוזרים פלינדרומיים קצרים (CRISPR) בתפוקה גבוהה, המקובצים באופן קבוע, עבור ניתוח רשת של אשכולות מיקרו-רנ"א, המאפשרת ייצור מהיר של פאנל של קווי תאים מהונדסים גנטית הנושאים שילובי מחיקה ייחודיים של חברי אשכול miRNA בגודל של עד 35 קילו-בתים בתוך ניסוי יחיד.

כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א

מחסום הדם-מוח הוא משוכה משמעותית במתן טיפולים לגליובלסטומה, מחלה שאין לה תרופה. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמת ננו טיפולית של תחמוצת ברזל מונחית תמונה in vivo שיכולה לעקוף את המחסום הפיזיולוגי הזה בזכות גודלו ולהצטבר בגידול.

העברת ננו-חלקיקים של מטען אוליגונוקלאוטיד במודל בעלי חיים רב-צורניים מסוג גליובלסטומה

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

למדו שיטה חישובית להנדסת אשכולות DNA מלאכותיים מ-miRNAs לטיפול גנטי בגליובלסטומה. הפרוטוקול מאפשר מודולציה סימולטנית של מיקרו-RNAs מרובים בתאים אוקריוטיים ללא צעדי שיבוט מולקולריים מורכבים.

אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי

גלה סרטונים נוספים