Name: פרוטוקול מבוסס FACS כדי לבודד RNA מן התאים המשניים של דרוזוהילה בלוטות אביזר זכר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: למדו פרוטוקול FACS לבידוד תאים משניים מבלוטות אביזר זכר של דרוזוהילה לצורך ריצוף RNA ו-RT-qPCR. השיטה מאפשרת ניתוח תמסיתי של אוכלוסיות תאים נדירות החיוניות להצלחה רבייתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לחברי מעבדת Karch, לplateform הגנומיקה הiGE3, למתקן הליבה של המרכז האוניברסיטאי של ז'נבה, ולדר ' ז'אן-פייר אוברי-לבאיי שקבע את הפרוטוקול ל-FACS. אנו מודים ללוקה Stickley על עזרתו באמצעות להמחיש את הקריאות ב IGV. אנו מודים לעצמנו על הרשאה עדינה לשימוש חוזר בדמויות, והעורכים המבקשת מאיתנו להיות יצירתיים בכתיבה.
מחקר זה מומן על ידי מדינת ז'נבה (CI, RKM, FK), הקרן הלאומית השוויצרית למחקר (www.snf.ch) (FK ו RKM) ותרומות של קרן Claraz (FK).

1. מסילות דרוסופילה משומשים ואוסף של זכרים
<ol><li>עבור פרוטוקול זה, השתמש בזכרים המבטאים GFP ב-ה scs ולא בתאים הראשיים. כאן, מנהל התקן Abdb-GAL4 (המתואר בהתייחסות18), בשילוב עם uas-gfp (על כרומוזום 2) משמש. ניתן להשתמש גם בנהגים מתאימים אחרים. עבור בידוד של ה scs בתנאים שונים של מוטציות, לחצות את המוטציה לתוך קווים המכילים את הקו הספציפי SC-GFP.</li>
	<li>לאסוף שתי קבוצות של כ -25 בריאים, זכרים בתולה עבור כל גנוטיפ ולגילם ב 25 ° c עבור 3-4 ימים בבקבוקונים עם מזון מתוצרת הדרוזולה טרי. הערה: כגיל, מצב ההזדווגות, התזונה והסביבה החברתית כל אחד משפיעים על ביולוגיה של הרבייה, יש לעקוב אחר פרוטוקולים נוקשים כדי לשלוט בפרמטרים אלה. זכרים הבתולה התיישן במשך 3-4 ימים לאחר גולמי eclosion ב -25 ° c עם מחזור אור/12 h 12 שנים/כהות, על הארוחה הרגילה קמח-שמרים מזון, בקבוצות של 20-25 גברים במבחנה.</li>
</ol>2. הכנת פתרונות וחומרים
<ol><li>
הכינו את הפתרונות הבאים.
	<ol>
<li>הכנת סרום שיושלם בינוני (SSM): הדרוזוזה של שניידר מדיום בינוני עם 10% החום מופעל סרום בקר ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
		<li>הכינו את מחלת האנזים של 1x טריפסין (לדוגמה, טרילה אקספרס אנזים) והחנות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הכינו את הליבטים של פפאין [50 U/mL] (מאוחסן ב-20 ° c והופסדר פעם אחת בלבד).</li>
		<li>הכינו תמיסת מלח באגירה 1 x פוספט (PBS, מאוחסנת בטמפרטורת החדר).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להכין כמה טיפים להבה מעוגל pipet עבור הדיסוציאציה הפיזית של בלוטות אביזר. הערה: השתמש בעצות שמירה נמוכות לטיפול בבלוטות האבזר כשהן נוטות לדבוק בפלסטיק לא מטופל. תהליך עיגול הלהבה מקטין את הקצה הפותח ומsmoothens את קצות הקצה. זה מבטיח דיסוציאציה יעילה לאחר העיכול peptidase מבלי להגז את קרום התא.<ol>
<li>גזור 1 200 μL טיפ עם להב חד ולהעביר אותו בעדינות מעל להבה כדי לעגל את הקצה שלה כך הפתח הוא רחב יותר, אבל חלק לטיפול במהלך שלב 3.7.</li>
		<li>צמצם את הפתיחה של עצות מרובות של 1,000 μL על-ידי העברת הקצה בסמוך ללהבה במשך פחות משנייה אחת. סובב את הקצה במקצת כדי למנוע התכה או סתימת. מיין את העצות שעשויות להיות צר יותר לרוחב. זה יכול להיעשות על ידי עיתוי מהירות השאיפה. נסה לנתק מדגם בקנה מידה קטן של AGs כדי לבדוק את היעילות של עצות הצרה ביותר. הערה: עצות אלה קריטיות לעצבנות מכנית (שלבים 5.2 ו-5.3). איכות להבה מעוגל pipet טיפים לאפשר דיסוציאציה מלאה תוך שמירה על הכדאיות התא. ככזה, טיפים אלה נשטפים ביסודיות עם מים בסוף ההליך לשימוש חוזר. הדבר מאפשר את הדיסוציאציה ליום יום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. חיתוך בלוטות אביזר
<ol><li>הכניסו 20 ל -25 מדרוזופילה . בקערת זכוכית על הקרח</li>
	<li>. בסדר. להוריד את מערכת הרבייה שלה לנקות את הצמד בלוטת אביזר מכל הרקמות האחרות מלבד צינור הפליטה. הערה: הסר את האשכים מכיוון שהזרע המשוחרר יכול ליצור גושים ולהפריע לתהליך הדיסוציאציה. הסר את הנורה הפליטה, מה שהופך את הטיפול קשה כאשר הוא צף.</li>
	<li>עם מלקחיים, אביזר העברת בלוטות לצלחת זכוכית מלא SSM בטמפרטורת החדר. חזור על שלבים 3.2-3.3 20 פעמים כדי לקבל אצווה של 20 זוגות של בלוטות ב SSM. הערה: שלבים אלה יהיו מושגת בתוך 15 עד 20 דקות. AGs צריך להיראות בריא, ואת התנועות הפריסטלטיות של שכבת השריר סביב בלוטות צריך להיות גלוי. ניתן לפקח על GFP בעזרת מיקרוסקופ פלורסנט.</li>
	<li>העבר בלוטות אביזר ל 1x PBS עבור 1-2 דקות לשטוף בטמפרטורת החדר. הערה: עבור דיסוציאציה טובה יותר, זה הכרחי לשטוף את הבלוטות עם PBS. עם זאת, משך שלב זה צריך להיות מוגבל כמו התאים להראות סימנים של לחץ ב-PBS; תאים משניים הנתק ב-PBS להתנפח במהירות ולמות.</li>
	<li>לדלל 20 μl פפאין [50 U/mL] לתוך 180 μl של 1x טריפסין אנזים להשיג את פתרון הדיסוציאציה (כדי לשנות את גודל למעלה או למטה לשמור 9 μl של אנזים טריפסין ו 1 μl של פפאין עבור כל זכר). עם מלקחיים, להעביר בלוטות אביזר לפתרון זה.</li>
	<li>לבודד את הקצה של בלוטות אביזר (המכיל תאים משניים) מהחלק האבובי. השתמש מלקחיים עדינים לצבוט בחוזקה באמצע האונה הבלוטות לחתוך עם קצה חדה של מלקחיים שנייה. הסר את החלק הטוב ביותר של בלוטות אביזר ואת צינור הפליטה כדי לשפר את הדיסוציאציה ולהפחית את זמן מיון התא. הערה: מנתח את החלק המרוחק מ 20 זוגות של בלוטות ייקח 15 עד 20 דקות והעיכול על ידי הפמיסים יהיה ובכך להתחיל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר כל העצות בלוטת כבר גזור, להעביר אותם לתוך צינור 1.5 mL באמצעות מיוחד 200 μL מחמד טיפ מוכן בשלב 2.2.1. זה צריך להיות רחב, מעוגל ורטוב לפני הטיפול בלוטות. הערה: כדי לקבל את רקמת בלוטת אביזר, טיפים תמיד צריך להיות מראש רטוב עם הפתרון המתאים (טריפסין אנזים או SSM, לשמור על שפופרת אחת של כל אחד למטרה זו). לשטוף בזהירות את הטיפים בין דגימות כדי למנוע זיהום.</li>
</ol>4. עיכול רקמות
<ol><li>מניחים את המיקרו צינור ב 37 ° צ' שייקר עבור 60 דקות, נדנדה ב 1,000 rpm. הערה: זמן העצבנות והעיכול הם קריטיים לדיסוציאציה מוצלחת. העיכול קצר או חסר תנועה ייתן את הדיסוציאציה המסכנה, כנראה משום ששכבת השריר החיצונית ונוזל הזרע הפנימי בחומר צמיגי מגינים על תאי בלוטת האביזרים.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ ל SSM בטמפרטורת החדר כדי לעצור את העיכול ולהמשיך מיד לשלב 5.</li>
</ol>5. דיסוציאציה מכנית של תאים
<ol><li>באמצעות מעוגל רחב 1,000 μL קצה, מראש רטוב עם SSM, להעביר את המדגם לצלחת 24. ניטור הזריחה GFP תחת המיקרוסקופ: עצות בלוטת רוב צריך להיראות שלמים וכמה SC יש להתנתק.</li>
	<li>באמצעות קצה מעוגל קצר pipet שנוצר בשלב 2.2.2, pipet למעלה ולמטה 3 כדי 5 פעמים כדי לשבש את רקמת בלוטת אביזר. הערה: צג הקרינה הפלואורסצנטית כדי לוודא שתיקוני רקמות גדולים שבורים. חזור על השלב 5.2 אם אין זה כך.</li>
	<li>באמצעות קצה מאוד צר מעוגל pipet (שנוצר בשלב 2.2.2), pipet למעלה ולמטה 1-2 פעמים. הערה: רק תאים בודדים צריכים להיות גלויים לאחר שלב 5.3. מומלץ להשתמש בלוחות של 24 שעות מכיוון שהם מאפשרים ניטור קל של התהליך. כאשר מספר דגימות עובדו ונתן תוצאה משביעת רצון (תאים משניים בריאים מראה מושלמת שאינו מתאים), שלבי הפיליטוף יבוצעו במיקרו-צינורית.</li>
	<li>המתן לפחות 15 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב בתחתית הבאר ולהסיר את עודפי SSM כדי להקטין את זמן המיון. הערה: מתן תאים להתיישב הוכיחה מעולה על שיטות חלופיות כמו צנטריפוגה, ומאפשר בדיקה חזותית אחרונה של תאים בדיוק לפני FACS.</li>
	<li>Pipet התאים לתוך נקי 1.5 mL ובריכה דגימות זהות (שתי אצוות של 20 זכרים עבור כל תנאי). לשטוף בארות עם SSM לשחזר את התאים האחרונים, ו ללטף אותם לתוך הצינור (להשתמש באמצעי אחסון קטן).</li>
	<li>ב 1.5 מיקרוצינוריות mL, להוסיף 300 μL של פתרון לליזה תאים 1 μL של פרוטטינואז K [50 μg/μL] (פתרונות המסופקים בערכת הטיהור של RNA, ראה שלב 7). הכן שתי שפופרות לכל מדגם (אחד עבור MCs ואחד עבור ה scs).</li>
</ol>6. FACS (מיון תאים מופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית)
<ol><li>הוסף מסמן הכדאיות לכל דוגמה להיות ממוין כמה דקות לפני מיון (0.3 mM Draq7). זהירות: יש לטפל בDraq7 בזהירות.</li>
	<li>
מיון אוכלוסיה הומוגנית של תאים משניים חיים (GFP-חיוביים, Draq7-שלילי תאים). במיקרו-צינורית אחרת, מיון אוכלוסיה של תאים ראשיים (קטן יותר, GFP-שלילי, Draq7-שלילי תאים). השתמש באסטרטגיית הפעולה הבאה של ה-FACS: הערה: הגדר את הלחץ של סדרן התא ב 25 PSI ולעבור תאים באמצעות זרבובית 100 יקרומטר. שיעור המיון הוא סביב 2,000 תאים/s.<ol>
<li>הוצא את הפסולת ובחר את התאים הכולל בהתבסס על FSC-להאס-אס (איור 2E) כדי להוציא את הפסולת.</li>
		<li>אל תכלול תאים מתים. לרגש Draq7 עם לייזר ננומטר 640 ולאסוף הפליטה הנפלטת עם מסנן לעבור הלהקה 795/70. שער Draq7 התאים החיוביים (איור 2F).</li>
		<li>הסרת כפולים באמצעות מסירה כפולה על האס. אס. אס לעומת אס. אס. אס. ו. FSC-A לעומת FSC-H (איור 2H). הערה: אל תכלול את התא doublets באמצעות המשך כפול, כדי להפחית את זיהום התא הראשי.</li>
		<li>מיין ~ 550 GFP-חיוביים תאים לתוך מיקרוצינורית 1.5 mL עם מאגר לוליזיס ו פרוטטינואז K. אוכלוסייה זו נחשבת לתאים משניים (SC, איור 2G). לרגש GFP ב 488 ננומטר ולאסוף את הזריחה הנפלטת עם מסנן לעבור הלהקה 526/52.</li>
		<li>מיון ~ 1,000 GFP שליליים תאים, הומוגנית קטן בגודל, לתוך מיקרוtube 1.5 mL עם מאגר לוליזיס ו פרוטטינואז K. אוכלוסייה זו נחשבת התאים העיקריים (MC, איור 2G).</li>
		<li>. וורטקס כל הדגימות הערה: מ 40 גברים (~ 40 x 80 SC = 3,200 תאים משניים), 600 ל800 חי התאים המשניים מתקבלים (סביב 20-25% אחזור). הפסק למיין סביב 550 SC ו 1,000 MC כדי לנרמל דגימות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. הוצאת רנ א
הערה: השתמשנו באפיטרה לטיהור של רנ א להפקת RNA, עם העיבודים הבאים. ערכות אחרות עשוי לשמש כל עוד התשואה גבוהה מספיק כדי להכין ספריה עבור רצף מ ~ 500 תאים (2 ng RNAs היה בשימוש כאן).
<ol><li>חום דגימות ב 65 ° c עבור 15 דקות ומערבולת כל 5 דקות כדי להשלים את הליזה התא.</li>
	<li>הניחו דגימות על הקרח במשך 5 דקות. בצע את ההמלצות של היצרן עבור חומצות גרעין משקעים (חלקים "המשקעים של חומצות גרעין סה כ" ו "הסרת דנ א מזהם ההכנות הכולל חומצות גרעין").</li>
	<li>השעיה גלולה RNA ב 10 μL של מאגר האטה חינם RNase.</li>
	<li>הוספת מעכב RNase (אופציונלי).</li>
	<li>דגימות מהחנות ב-80 ° c.</li>
</ol>8. איכות בקרת RNA כמות, איכות וספציפיות
<ol><li>הערכת איכות וריכוז RNA. בשל אמצעי האחסון הקטן והריכוז, השתמש ב-RNA 6000 פיקו צ'יפס כאן. באיכות טובה RNA מוגדר לא מושפל, גלוי כמו בסיס נמוך עם פסגות חדות המתאימות rRNAs.</li>
	<li>
RT-qPCR כדי לשלוט בזהות של תאים ממוינים
	<ol>
<li>לבצע תמלול הפוכה עם 2 ng של RNAs הכולל באמצעות החוקרים אקראיים כמו התחל. לבצע RT ב-RNA תא משני ו-RNA התא הראשי. הערה: cDNAs יכול להיות מדולל, מצוטט, ונשאר קפוא לשימוש מאוחר יותר.</li>
		<li>לבצע בזמן אמת PCR כמותי באמצעות זוגות פריימר מתאים כדי לכמת שירות הגנים (אלפא-טובולין, 18S rRNA), תאים משניים ספציפיים הגנים (מס א, Rab19, עבד-B) ואת התא הראשי ספציפי גן (מין פפטיד).</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. רצף (cDNA הכנה, רצף וניתוח נתונים)
<ol><li>השתמש ב-2 ng של RNAs כולל כדי לסנתז cDNAs עם צבעי יסוד פולידט. השתמש בטכנולוגיה חכמה יותר כדי להגביר את ההגברה.</li>
	<li>השתמש בערכת XT של Nextera כדי להכין את הספריה.</li>
	<li>רצף באמצעות ריבוב, 100 נוקלאוטידים בודד קריאות ברצף (למרות 50 נוקלאוטידים קריאות מתאימות לרוב המטרות) כדי להניב סביב 30,000,000 קורא עבור כל מדגם.</li>
</ol>10. ניתוח נתונים
<ol><li>. רוץ.</li>
	<li>השתמש בתנינים הכוכב כדי למפות את הקריאות ב-UCSC dm6 Drosophila התייחסות הגנום וליצור קבצי. bam. השתמש במציג גנומיקה אינטגרטיבית (IGV) כדי להמחיש קריאות בדפדפן הגנום.</li>
	<li>השתמש ב-HTSeq כדי לבצע ספירות גנים.</li>
	<li>השתמש בשיטה ממוצע חתוך של M-values (TMM) כדי לנרמל ספירות גנים22. השתמש ב-edgeR כדי לבצע ניתוח סטטיסטי של ביטוי דיפרנציאלי, מחלקות MA ו-PCA.</li>
	<li>לניתוח וסטטיסטיקה של ביטויים גנטיים, השתמש במודל ליניארי כללי, הסבירות F-test עם שיעור זיהוי שווא (רוזוולט) ובנימיני & הוכברג תיקון (BH).</li>
</ol>

<ol><li>Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+seminal+fluid+proteins%3A+identification+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect seminal fluid proteins: identification and function.</a> Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).</li>
<li>Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+induces+developmental+changes+in+the+insect+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract.</a> Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).</li>
<li>League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+accessory+gland+molecules+inhibit+harmonic+convergence+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti.</a> Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).</li>
<li>Degner, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+Transcripts%2C+and+Genetic+Architecture+of+Seminal+Fluid+and+Sperm+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).</li>
<li>Wedell, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+receptivity+in+butterflies+and+moths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Female receptivity in butterflies and moths.</a> Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).</li>
<li>Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+function+of+proteolysis+regulators+in+seminal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid.</a> Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).</li>
<li>Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Accessory+Gland+as+a+Model+for+Prostate+Cancer+and+Other+Pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies.</a> Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).</li>
<li>Kubli, E., Bopp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+behavior%3A+how+Sex+Peptide+flips+the+postmating+switch+of+female+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies.</a> Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).</li>
<li>Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-peptides%3A+seminal+peptides+of+the+Drosophila+male%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).</li>
<li>Liu, H., Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-peptide+is+the+molecular+basis+of+the+sperm+effect+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).</li>
<li>Ram, K. R., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+post-mating+response+in+Drosophila+melanogaster+requires+multiple+seminal+fluid+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins.</a> PLoS Genetics. 3 (12), e238(2007).</li>
<li>Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Female+Post-Mating+Response+Requires+Genes+Expressed+in+the+Secondary+Cells+of+the+Male+Accessory+Gland+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).</li>
<li>Avila, F. W., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acp36DE+is+required+for+uterine+conformational+changes+in+mated+Drosophila+females%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).</li>
<li>Adams, E. M., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+proteins+but+not+sperm+induce+morphological+changes+in+the+Drosophila+melanogaster+female+reproductive+tract+during+sperm+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage.</a> Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+interaction+between+Drosophila+sperm+and+sex+peptide+is+mediated+by+other+seminal+proteins+that+bind+only+transiently+to+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).</li>
<li>Avila, F. W., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+the+Drosophila+seminal+protein+Acp36DE+in+mated+females+enhances+its+sperm+storage+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity.</a> Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).</li>
<li>Chapman, T., Davies, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+analysis+of+the+seminal+fluid+proteins+of+male+Drosophila+melanogaster+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies.</a> Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).</li>
<li>Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+Hox+gene+Abd-B+in+the+male+accessory+gland+regulates+the+long-term+female+post-mating+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 9 (3), e1003395(2013).</li>
<li>Minami, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeodomain+protein+defective+proventriculus+is+essential+for+male+accessory+gland+development+to+enhance+fecundity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila.</a> PLoS One. 7 (3), e32302(2012).</li>
<li>Maeda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lncRNA+male-specific+abdominal+plays+a+critical+role+in+Drosophila+accessory+gland+development+and+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility.</a> PLoS Genetics. 14 (7), e1007519(2018).</li>
<li>Prince, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab-mediated+trafficking+in+the+secondary+cells+of+Drosophila+male+accessory+glands+and+its+role+in+fecundity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity.</a> Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).</li>
<li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), R25(2010).</li>
<li>Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+gentle+and+scalable+method+for+dissociation+and+fluorescent+sorting+of+imaginal+disc+cells+for+mRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing.</a> Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).</li>
<li>Corrigan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-regulated+exosomes+from+Drosophila+male+reproductive+glands+reprogram+female+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior.</a> Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).</li>
<li>Leiblich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-+and+mating-dependent+secretory+cell+growth+and+migration+in+the+Drosophila+accessory+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).</li>
<li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+conditions+sensed+by+the+reproductive+organ+during+development+optimize+male+fecundity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila.</a> Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).</li>
<li>Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-based+isolation+and+RNA+extraction+of+Secondary+Cells+from+the+Drosophila+male+Accessory+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland.</a> bioRxiv. , 630335(2019).</li>
</ol>

למחברים אין כל חשיפה.

שיטות לדיסוציאציה של תא מרקמת דרוזוהילה כמו דיסקים מתוארים כמתואר כבר23. הניסיונות שלנו פשוט להשתמש בהליכים אלה על בלוטות האביזר נכשלו, מעודדים אותנו לפתח את הפרוטוקול החדש. העיכול הפרוטאז והטריטורציה המכנית היו צעדים קריטיים שאנחנו בצרות ירו להצלחת ההליך, ואנו מניחים הערות רבות בסעיפים 2 כדי 5 כדי לסייע בניסויים כדי להשיג תוצאות משביעות רצון. כדי שהדיסוציאציה תצליח, הפטיות חייבות להגיע לתאי בלוטת האביזרים, אשר מוגנים על ידי הנוזל הזרע הצמיגי של לומן ואת שכבת השריר סביב בלוטת. מנתח את החל...

איברים מורכב מסוגי תאים מרובים, כל אחד עם פונקציות דיסקרטית ולפעמים לבטא קבוצות שונות בהרבה של גנים. כדי לקבל הבנה מדויקת של אופן הפעולה של איבר, זה לעתים קרובות קריטי ללמוד כל סוג תא שונה שיוצר את האיבר הזה. אחת השיטות הראשיות המשמשות לחקר הפונקציה האפשרית היא ניתוח להמרה. שיטה רבת עוצמה זו מספקת תמונה של הביטוי הגנטי בתא, כדי לחשוף תהליכים ומסלולים פעילים. עם זאת, סוג זה של ניתוח קשה לעתים קרובות עבור אוכלוסיות תאים נדירים שיש לטהר מתאים השכנה הרבה יותר שופע. לדוגמה, בלוטת העזר הגברית דרוזוהילה היא איבר שנוצר בעיקר משני סוגי תאי הפרשה. ככל שהנדירים יותר מבין שני סוגי התא מורכב רק 4% מהתאים של בלוטה זו, השימוש בניתוח מסוג תא מסוים לא היה בשימוש כדי לעזור לקבוע את הפונקציה של תאים אלה.
בלוטות האביזרים (AGs) הם איברים של מערכת הרבייה הגברית בחרקים. הם אחראים לייצור של רוב החלבונים של נוזל הזרע (חלבונים נוזלי הזרע (SFPs) ו בלוטת אביזר חלבונים (ACPs)). חלק אלה SFPs ידועים כדי לזרז את התגובות הפיסיולוגיים והתנהגותיים בנשים מזדווג, שנקרא בדרך כלל תגובה לאחר ההזדווגות (PMR). חלק מה ' כוללים: ביוץ מוגבר וקצב הנחת ביצים, אחסון ושחרור של זרע, שינוי בתזונה נשית וירידה בקבלה נשית לגברים מחזרים משניים1,2. כמו חרקים המשפיעים על סוגיות חברתיות גדולות רבות מבריאות האדם (כמו וקטורים עבור מחלות קטלניות) לחקלאות (חרקים יכולים להיות מזיקים, אך הם קריטיים להאבקה ולאיכות הקרקע), הבנת שעתוק חרקים הוא תחום חשוב של מחקר. המחקר של AGs ו-ACPs כבר מתקדמים באופן משמעותי עם האורגניזם מודל Drosophila ילה מלאנוגסטר. מחקרים אלה הדגישו את התפקיד של AGs וחלק מהחלבונים הבודדים שהם מייצרים ביצירת pmr, להשפיע על העבודה במינים אחרים כמו aedes המחלה וקטור aמצרים3,4, וחרקים אחרים1 ,5. יתר על כן, כמו AGs להפריש את המרכיבים של נוזל הזרע1,6 הם נחשבים לעתים קרובות כאנלוגי פונקציונלי של בלוטת הערמונית היונקים הזרע. פונקציה זו דומה בשילוב עם דמיון מולקולרי בין שני סוגי הרקמה, עשו את AGs מודל עבור בלוטת הערמונית זבובים7.
בתוך מעשה זכר, יש שתי אונות של בלוטות אביזר. כל אונה ניתן לראות כמו מבנה סאק כמו שק העשוי מונאולייר של תאים הפרשה סביב לומן מרכזי, עטוף על ידי שרירים חלקים. כפי שהוזכר לעיל, יש שני מורפולוגית, פיתוח מבחינה מנטלית ופונקציונלית הסוד סוגי תאים ממציא בלוטה זו: התאים העיקריים בצורת מצולע (לפצות ~ 96% של התאים), והגדול, תאים משניים עגולים (SC) (ממציא את ה הנותרים 4% של תאים, או כ 40 תאים לכל אונה). זה הוכח כי שני סוגי התא לייצר סטים שונים של ACPs כדי לגרום ולתחזק את PMR. רוב הנתונים שהושגו עד היום להדגיש את התפקיד של חלבון יחיד מפעילה את רוב ההתנהגויות האופייניות של PMR. חלבון זה, פפטיד המין, הוא קטן, 36 הפפטיד חומצות אמינו המופרש על ידי התאים העיקריים8,9,10. למרות פפטיד מין נראה לשחק תפקיד מרכזי pmr, acps אחרים, המיוצר על ידי שני התאים העיקריים והמשני, הוכחו גם להשפיע על היבטים שונים של pmr11,12,13,14 ,15,16,17. לדוגמה, בהתבסס על הידע הנוכחי שלנו, ה scs, דרך החלבונים שהם מייצרים, נראה צורך לנצח של איתות SP לאחר היום הראשון18.
לאור הנדירות של ה scs (רק 80 תאים לזכר), כל הידע שלנו על התאים האלה ואת החלבונים שהם מייצרים מגיע גנטיקה וגישות המועמדים. עד כה, רק רשימה קטנה יחסית של גנים הוכח להיות מוגדר SC. רשימה זו כוללת את החלבון הביאואואמין הפגום הבלוטות (dve)19, האינקרונה מס ' 20, Rab6, 7, 11 ו 1921, CG1656 ו CG1757511, 15,21 והומבוקס מקדם התמלול הבטן-b (עבד-ב)18. בעבר, הצגנו כי מוטציה לקויה הן הביטוי של עבד-B ו- lncRNA מס בתאים משניים (מעבדה-6cocuD1 מוטציה) מקצר את אורך pmr מ ~ 10 ימים רק יום אחד12 , מיכל בן 18 , 20. הפנוטיפ הזה נראה כתוצאה מאחסון לא תקין של SP במערכת הרבייה הנשית12,18,20. במישור הסלולר, התאים המשניים של המוטציות האלה מראים מורפולוגיה לא נורמלית, ומאבדים את המבנה האופייני שלהם במבנים שלהם18,20,21. באמצעות קו זה מוטציה, בעבר ניסינו לזהות גנים המעורבים בפונקציה SC על ידי השוואת הפרופילים הטרנססקריפט של AGs שלמים מסוג פראי או בלוטות אביזר מוטציה12. כמו כן, מעבדות אחרות הראו כי מספר SC, מורפולוגיה ומין תוכן וולאואר תלוי בתזונה גברית, סטטוס ההזדווגות וגיל21,25,26.
למרות התקדמות חיובית נעשתה באמצעות גישות אלה, מלאה SC ההמרה היה רחוק מושגת. האטימות של תאים אלה באיבר זה הפכה את זה קשה להתקדם עוד יותר בתאי סוג פראי. לבדיקת ביטוי גנים, שינויים בתאים אלה לאחר גירויים סביבתיים מסוימים יהיה אפילו קשה יותר. כך, שיטה לבידוד וטיהור SC RNA כי היה מהיר ופשוט מספיק כדי לבצע תחת רקעים גנטיים שונים ותנאים סביבתיים היה צורך.
הגנים של עבד-B ו- מס ' מס ' דורשים משפר ספציפי של 1.1 kb ממתחם דרוזוהילה בבית החזה (המכונה D1 משפר) על ביטויו בה scs18,20. משפר זה בעבר נעשה שימוש כדי ליצור מנהל התקן GAL4 , כאשר משויך UAS-gfp, הוא מסוגל לנהוג ביטוי gfp חזק במיוחד ב ה scs. לפיכך, השתמשנו בשורה זו כבסיס לפרוטוקול FACS לבידוד תאים אלה מסוג פראי וממעבדה-6cocuD1 AGs). כמו המעבדה -6cocuD1 מוטציה ה scs להציג מורפולוגיה סלולרית שונים, אנו מראים כי פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לבודד תאים לקביעת ההמרה שלהם מסוג זה תא נדיר תחת תנאים שונים בהרבה.

<table><tbody><tr><td>24 בארות צלחת תרבית רקמות</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דו-עיני לדיסקציה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>משקפת עם מקור אור ל-GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Draq7 0.3 מ"מ</td><td>BioStatus</td><td>DR71000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-צינורות פלסטיק 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td>לדיסקציה עדינה</tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>מושבת בחום לפני השימוש</td></tr><tr><td>כלי זכוכית לדיסקציה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דלי</td><td></td><td></td><td></td>קרח</tr><tr><td>ImProm-II מערכת תמלול הפוך</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור RNA MasterPure</td><td>Epicentre</td><td>MCR85102</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT kit</td><td>illumina</td><td></td><td><a href="https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html</a></td></tr><tr><td>P1000</td><td>גילסון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td></td><td></td><td>50U/mL מלאי</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>תוצרת בית</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים</td><td></td><td></td><td></td>PolydT</tr><tr><td>פריימרים</td><td></td><td></td><td></td>הקסמרים אקראיים</tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>אג'ילנט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שניידר' s Drosophila בינוני</td><td>Gibco</td><td>21720-001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת סינתזה cDNA של SMARTer</td><td>Takara</td><td></td><td><a href="https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits">https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits</a></td></tr><tr><td>SYBR בחר תערובת מאסטר עבור CFX</td><td>מיושם ביוסיסטמס</td><td>4472942</td><td></td></tr><tr><td>שייקר תרמו</td><td>האנגג'ואו Allsheng חדירות</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 1250 &mu; L טיפ בוגר</td><td>Starlab</td><td>S1161-1820</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 200 &mu; L קצה משופע</td><td>Starlab</td><td>S1161-1800</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE אקספרס אנזים</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול מבוסס facs כדי לבודד rna מן התאים המשניים של דרוזוהילה בלוטות אביזר זכר

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

כדי להבין את הפונקציה של איבר, לעתים קרובות שימושי להבין את התפקיד של אוכלוסיית התאים המכוננת שלה. למרבה הצער, הנדירות של אוכלוסיות תאים בודדות מקשה בדרך כלל להשיג מספיק חומר למחקרים מולקולריים. לדוגמה, בלוטת האביזרים של מערכת הרבייה הגברית של דרוזוהילה מכילה שני סוגי תאי הפרשה נפרדים. התאים העיקריים לפצות 96% של התאים הפרשה של בלוטת, בעוד התאים המשניים (SC) לפצות את הנותרים 4% של תאים (כ 80 תאים לזכר). למרות ששני סוגי התא לייצר רכיבים חשובים של נוזל הזרע, רק כמה גנים ידועים להיות ספציפיים ה scs. הנדירות של ה scs יש, עד כה, מפריע ניתוח הטרנססקריפט המחקר של סוג תא חשוב זה. כאן, מוצגת שיטה המאפשרת טיהור של ה scs עבור החילוץ RNA ורצפי. הפרוטוקול מורכב בלוטות הניתוח הראשון מפני זבובים המבטא כתבת GFP ספציפיים SC ולאחר מכן לאשר את הבלוטות הללו לעיכול פרוטאז ודיסוציאציה מכנית כדי להשיג תאים בודדים. בעקבות שלבים אלה, בודדים, חיים, מסומנים GFP תאים ממוינים באמצעות מסדר פלורסנט המופעל התא (FACS) לטיהור RNA. הליך זה התשואות RNAs ספציפי SC מ ~ 40 גברים לכל תנאי עבור במורד RT-qPCR ו/או רצפי RNA במהלך יום אחד. המהירות והפשטות של ההליך מאפשר הטרנססקריפט של זבובים שונים רבים, מתוך גנוטיפים שונים או תנאים סביבתיים, להיקבע בפרק זמן קצר.

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר לאחד הניסויים לבודד תאים משניים מתוך בלוטות אביזר זכר דרוזוהילה ולחלץ את ה-RNA שלהם במהלך יום אחד (איור 1).
אנו משתמשים במבנה עבד-B-GAL4 18 כדי לסמן תאים משניים (SC) אבל לא התאים העיקריים (MC) עם gfp (איור 2א). מטרה אחת של הליך זה היא להשיג את סוג פראי transcript של ה scs (פראי סוג נכתב...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתק ולמיין אוכלוסיית תאים מסוימת של בלוטות אביזר זכר Drosophila ילה (תאים משניים) עבור רצפי RNA ו-RT-qpcr. בידוד התא מושגת באמצעות הטיהור של FACS של התאים המשניים של GFP-ביטוי לאחר תהליך מרובה שלב-דיסוציאציה המחייב ניתוח, העיכול הפרוטסיס ופיזור מכני.

פרוטוקול מבוסס FACS כדי לבודד RNA מן התאים המשניים של דרוזוהילה בלוטות אביזר זכר

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

שיטה זו מאפשרת ניתוח תעתיק של אוכלוסיית תאים נדירה מבלוטת האביזר הגברית Drosophila, הנקראת התאים המשניים, והיא חושפת גנים המקחיים אותם להצלחת הרבייה. במהלך יום אחד, טכניקה זו מאפשרת מיון של תאים משניים מגנוטיפ שונה ואת החילוץ של RNA הכולל עבור רצף qPCR או RNA הבאים. לפעמים פרויקטים מוגבלים על ידי נדירות של חומר התחלתי.שיטה זו יכולה לספק את הבסיס לקבוצות אחרות המתמודדות עם אתגר העבודה עם אוכלוסיית תאים נדירה. מכיוון שההליך צריך לצבור 40 בלוטות, חשוב לתרגל את הניתוחים. הכנת טיפים pipette תוצרת בית חשוב גם, ולכן אתה צריך לדמיין את זה על הווידאו איך לעשות את זה ולהתכונן מראש.לפני תחילת ההליך, לחתוך ולהביים עגול, רחב, 200-microliter טיפים לטיפול בבלוטות, ולהעביר את פתיחת קצה של 1,000-microliter טיפים מרובים ליד להבה במשך פחות משנייה אחת כדי לצמצם את הפתחים. לאחר מכן, מיין את הטיפים שהשתנו מצמצום לרחב יותר בהתבסס על מהירות השאיפה שלהם. עבור ניתוח בלוטת אביזר, מניחים 20 עד 25 זכר Drosophila בצלחת זכוכית על קרח, ולהשתמש מלקחיים מיקרוסקופ ניתוח כדי להסיר את מערכת הרבייה של זבוב זכר אחד.נקה את זוג בלוטת האביזר מכל הרקמות האחרות, כולל האשכים ונורה שפיכה, ולהעביר את בלוטות האביזר לצלחת זכוכית המכילה מדיום בתוספת סרום בטמפרטורת החדר. כאשר 20 זוגות של בלוטות עזר נאספו, לשטוף את הבלוטות בצלחת של PBS במשך 1 עד 2 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הכביסה, להעביר את הבלוטות לפתרון דיסוציאציה מוכן טרי, ולהשתמש מטליות חדות תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי לצבוט בחוזקה את אמצע האונה הבלוטות.באמצעות זוג שני של מלקחיים, לחתוך את הרקמה עם הקצה החד כדי להפריד את האזור הפרוקסימלי של בלוטת האביזר ואת צינור השפיכה מחלק הבלוטה המכיל תאים משניים. חותכים את הבלוטות, כך peptidases יכול להגיע לתאים כי הם מוגנים אחרת על ידי שכבת השריר החיצוני ועל ידי נוזל הזרע צמיג בלומן של הבלוטה. לאחר מכן, השתמשו בקצה פיפטה טרום רטוב, מעוגל להבה, רחב, 200 מיקרוליטר כדי להעביר את הבלוטות לצינור 1.5 מיליליטר.לעיכול רקמות, מניחים את הצינור בשייקר 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ב 1, 000 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, לעצור את העיכול עם מיליליטר אחד של מדיום בתוספת סרום, ולהשתמש מראש רטוב, להבה מעוגל, רחב, 1, 000 מיקרוליטר פיפטה קצה להעביר את הדגימות לצלחת 24 היטב. בדוק את התאים לביטוי GFP שלהם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.רוב קצות הבלוטה צריך להיראות שלם, וכמה תאים משניים צריך להיות מנותק. השתמש מעוגל, צר, 1, 000 מיקרוליטר פיפט קצה כדי triturate בעדינות את התאים שלוש עד חמש פעמים כדי לשבש את רקמת בלוטת האביזר. לאחר מכן, השתמשו בטיפ פיפיאט צר מאוד, מעוגל, 1,000 מיקרוליטר פעם עד פעמיים כדי להפוך את התאים לאינדיבידואליים.אפשר לתאים להתיישב במשך 15 דקות. ודא כי התאים נראים בריאים מתחת למיקרוסקופ, ולהסיר את המדיום העודף. לאחר מכן, להעביר את התאים לתוך צינור חדש 1.5 מיליליטר, ולשטוף את בארות עם מדיום טרי כדי לשחזר את כל התאים הנותרים.ניתן להשתמש בבניין Abd-B-GAL4 בניסויים אלה כדי לסמן תאים משניים אך לא ראשיים עם GFP. במחקר זה, שני סוגי התאים היו ממוינים מסוג פראי ובלוטות אביזר מוטציה iab-6cocuD1. מוטציה D1 זה חסר את הביטוי של תעתיקי עבד-B ו- MSA, המשפיעים על התפתחות תאים משניים, מורפולוגיה ותפקוד.לאחר דיסוציאציה של תאים, FACS משמש לבחירת תאים חיים בהתבסס על DRAQ7, ורמת פלואורסצנטיות GFP משמשת לבידוד תאים משניים ותאים ראשיים. RNA מופק מכל אוכלוסיית תאים ומותאם לשני ננוגרם לדגימה עבור RT-qPCR ותרשים עוקבים. כימות הביטוי של גנים ספציפיים על ידי PCR כמותי בזמן אמת על תמציות תאים ראשיים ומשניים מסוג בר מגלה כי גנים התא המשני Rab19 ו MSA מזוהים רק תמציות תא משני, בעוד פפטיד מין הגן התא הראשי מזוהה רק מדגימות תאים ראשיים.ניתוח רכיבים עיקריים על נתוני רצף RNA של שלושה סוגים פראיים ושלושה שכפולים מוטנטים מגלה כי סוג הבר משכפל את שני הצבירים הקרובים זה לזה ורחוקים מדגימות המוטנטים. הדמיה של קריאות המיושרות לגנים מסוימים מראה כי גנים של משק בית כגון actin 5C, והגנים המשניים הספציפיים לתאים Rab19 ו- Dve באים לידי ביטוי בשני הגנוטיפים. עבור MSA, לעומת זאת, הביטוי החזק של הגן שנצפה בזבובים מסוג בר הולך לאיבוד בזנים המוטנטים.השגת מספיק תאים משניים ניתויים חיים חשוב עבור הליך מוצלח. לכן, לאמת את פרוטוקול הניתוח והדיסוציאציה בניסוי בקנה מידה קטן. שיטה זו מאפשרת מיון של שני סוג התאים של בלוטת האביזר ממספר קטן של זבובים, ומאפשרת לחקור כיצד תאים אלה מגיבים בתעתיק לתנאים גנטיים או סביבתיים מרובים.הצלחה רבייה גברית ידוע להיות מושפע על ידי דברים רבים, כולל גנוטיפ, גיל, מצב הזדווגות. הקלות של שיטה זו אמורה לאפשר לנו לחקור כיצד גורמים אלה משפיעים על שעתוק בלוטת האביזר.

a-facs-based-protocol-to-isolate-rna-from-secondary-cells-drosophila

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה בידוד וטיהור...

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה לבידוד יחידים או...

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

תסיסנית האשכים melanogaster ניתן במהירות וביעילות מבודדים מן הזכרים הבוגרים באמצעות מחטים לנתח. בעזרת תרגול, ניתן לבודד בקלות בתוך יום או יומיים סכום של האשכים מספיק לניתוח DNA או RNA על ידי רצף תפוקה גבוהה יותר או מסורתי או בשיטות הביולוגיה המולקולרית של חלבון עבור מבחני נוגדנים או אנזים מבוססות.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

סרטון זה מתאר את הדיסקציה של בלוטות האביזרים מזבובים זכרים ומציג דוגמה שבה הבלוטה המבודדת תנותק לתרחיף של תא יחיד.

דרוזופילה דיסקציה של בלוטת האביזר הגברי: שיטה לבידוד תאים משניים

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה האמצע עד סוף שימושי למגוון מטרות. זקיקים כזה מתפתחים בתרבות, המאפשרת למניפולציות גנטיות ו / או תרופתיות כדי להיות יחד עם מבחני חוץ גופיית פיתוח והדמיה לחיות. בנוסף, זקיקים יכולים לשמש למחקרים מולקולריים, כגון בידוד mRNA וחלבון.

השירות של שלב ספציפי אמצע לסוף<em&gt; דרוזופילה</em&gt; בידוד זקיק

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

רקמות דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. כדי לבחון ביטוי גנים בסוגי תאים מסוימים מרקמה מסוימת, גרעינים יכולים להיות מתויגים גנטי ולאחר מכן מבודד באמצעות גישה המבוססת על זיקה. גרעינים בודדים יכולים לשמש עבור יישומים במורד כגון ניתוח ביטוי גנים וimmunoprecipitation הכרומטין.

בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות לניתוח ביטוי גנים

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד תרגום ספציפי לסוג התא של mRNA. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול TRAP הראשון המוקדש לבידוד mRNA באוכלוסיות תאים נדירות של עוברי דרוזופילה.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

הפרוטוקול מתאר שיטה יעילה ואמינה לכימות אורך הפולי(A) של הגן המעניין ממערכת העצבים דרוזופילה , שניתן להתאים בקלות לרקמות או סוגי תאים ממינים אחרים.

מדידת אורך זנב Poly A מזחלי דרוזופילה מוח וקו תאים

למדו פרוטוקול FACS לבידוד תאים משניים מבלוטות אביזר זכר של דרוזוהילה לצורך ריצוף RNA ו-RT-qPCR. השיטה מאפשרת ניתוח תמסיתי של אוכלוסיות תאים נדירות החיוניות להצלחה רבייתית.

פרוטוקול מבוסס FACS כדי לבודד RNA מן התאים המשניים של דרוזוהילה בלוטות אביזר זכר

גלה סרטונים נוספים