פרוטוקול הקפאה-מתישה לעיבוד כפות העכבר כדי להעריך מסלולים מולקולריים של דלקת רקמות במודל דלקת מפרקים קולגן המושרה

ההערכה של פרופילים מולקולריים ברקמות מקומיות היא צעד קריטי להבנת מנגנון הפעולה של תרופות פעילות כפי שהם מוערכים במודלים פרה-קליניים רלוונטיים למחלות. בתחום חקר דלקת פרקים, סביבת העניין של הרקמה המקומית היא המפרקים נושאי המשקל הקטנים המורכבים מתערובת מורכבת של עצם, סחוס, שרירים ותאי חיסון. כאן אנו מתארים שיטה אמינה וחזקה לשיבוש מכני ו/או עיסת סביבת רקמות מורכבת זו בסביבה מבוקרת קריוגנית.

שיטה זו יכולה לשמש לאחר מכן כדי ליצור במורד הזרם proteomic ו מאמצי פרופיל שעתוק להקמת חתימות מולקולריות של מחלה ממקור מדגם אחיד אחד. שיטה זו מייצרת אבקה הומוגנית שלא כמו טכניקות ישנות רבות אחרות. בנוסף, הליך בידוד הטמפרטורה הישן מאפשר בידוד של רנ"א באיכות גבוהה.

שיטה זו יכולה לשמש לאחר מכן ליצירת פרופיל פרוטומי ותעתיק במורד הזרם המאפשר אפיון מולקולרי של מסלולי המחלה הרלוונטיים של עניין. שיטה זו יכולה לספק תובנות לכל תחום מחקר הנגזר חתימות מולקולריות מרקמות. השיטה יכולה להיות מורחבת לכל מערכת רקמות מורכבת שיש לה צפוף וקשה לניתק מרכיבים.

למרות שלא הערכנו עד לנקודה זו, אנו יכולים לראות יישום פוטנציאלי לרקמות סחוס צפופות כמו אוזניים או עצמות. האופי הקריטי של העברת האבקה לצינורות לשקילה הוא משהו שלוקח תרגול. אם לוקחים יותר מדי זמן, האבקה תתחיל להפשיר ותהפוך לאמורפית.

חשוב להגביל את מספר הדגימות ל- 10 עד 15 עד שתרגיש בנוח עם ההליך. ביום עיבוד הרקמות, prechill כל המכשירים הדרושים על קרח יבש במשך מינימום של 10 דקות. ללבוש כפפות תרמיות כדי למנוע פגיעה על ידי הקור הקיצוני.

לאחר מכן, להעביר כל כף העכבר מוכן לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר נפרד מיד הצמד להקפיא חנקן נוזלי. אחסן את הכפות הקפואות ב-80 מעלות צלזיוס שליליות. כאשר מוכן להמשיך, למלא טחנת מקפיא עם חנקן נוזלי ולתת לו לצייד לפחות 10 דקות.

מניחים את המדגם לא מעבד על קרח יבש ולשמור אותו שם כדי למנוע הקפאת / הפשרה מחזורים. ואז להעביר כפה אחורית אחת לתוך בקבוקון טחינה פוליקרבונט גדול מקורר מראש עם תקע פלדה התחתון. הכנס את משפיע הפלדה המצונן מראש וסגור את בקבוקון שחיקת הפוליקרבונט עם תקע הפלדה העליון המצונן מראש.

מעבירים את בקבוקוני שחיקת הפוליקרבונט הגדולים עם הדגימות לטחנת המקפיא שמולאה מראש וסגרו את המכסה עם אבזם הגומי שנמצא בחזית המכשיר. תן לדגימות להתקרר בחנקן הנוזלי לדקה אחת. לאחר מכן, הגדר את טחנת המקפיא לתוכנית דקה אחת עם 10 מחזורים לשנייה.

לחץ על כפתור הריצה והמתן עד שטחנת המקפיא תשלים את המחזור שלה. לאחר מכן, לפתוח את המכסה של טחנת המקפיא ולה להוציא את בקבוקון שחיקה פוליקרבונט גדול. מניחים את בקבוקון השחזה לתוך מחלץ ולהסיר את תקע הפלדה העליון על ידי הצבת לחץ כלפי מטה על הידית השחורה עד תקע הפלדה מחליק מתוך צינור פוליקרבונט.

מעבירים את בקבוקון הטחינה שנפתח לקרח יבש ולהשתמש במקלות מצוננים מראש כדי להסיר את משפיע הפלדה. מעבירים את האבקה הקפואה לצינור חרוט מצונן מראש של 50 מיליליטר. לשקול בין 30 ל 50 מיליגרם של האבקה הקפואה לתוך צינור microcentrifuge שכבתי 1.5 מיליליטר עבור מיצוי RNA ובין 100 ל 200 מיליגרם עבור מיצוי חלבון.

לאחסן את הדגימות מרוסקות ב 80 מעלות צלזיוס שלילי ולהמשיך בידודי RNA וחלבונים בתוך 24 שעות. ראשית, להוסיף 10 microliters של בטא-mercaptoethanol עבור כל מיליליטר של מאגר RLT. לחשב את הנפח של מאגר RLT המתאים ליחס של 23.3 מיליליטר למיליגרם של רקמה ולהוסיף את הנפח המתאים של מאגר RLT עם בטא-mercaptoethanol לצינור עם אבקה קפואה.

Vortex המדגם ב 3, 000 סל"ד במשך 10 שניות. השתמש pipetter מיליליטר אחד כדי pipette למעלה ולמטה במרץ 10 פעמים מערבולת המדגם שוב ב 3, 000 סל"ד במשך 20 שניות. צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים g במשך שתי דקות ולהעביר 700 microliters של supernatant לצינור טרי.

הוסף 700 microliters של 70%אתנול לצינור זה לטעון 700 microliters של המדגם על עמוד טיהור RNA. צנטריפוגה הצינור במהירות של לפחות 10,000 פעמים g במשך 30 שניות. השלך את הזרימה דרך לטעון את החלק הנותר של המדגם על העמוד RNeasy צנטריפוגה הצינור שוב במהירות של לפחות 10, 000 פעמים g במשך 30 שניות.

השלך את הזרימה דרך ולשטוף את העמודה על ידי הוספת 700 microliters של חיץ RW1 וצנטריפוגה לפחות את המהירות של 10, 000 פעמים g במשך 30 שניות. אם ביצוע אפשרות DNAse עיכול, 350 microliters של RW1 מתווסף לפני טיפול DNAse. ולאחר טיפול DNAse, 350 microliters נוספים של RW1 מתווסף.

לאחר מכן לשטוף את העמודה פעמיים על ידי הוספת 500 microliters של חיץ RPE וצנטריפוגה במהירות של לפחות 10, 000 פעמים g במשך 30 שניות הקפדה להשליך את הזרימה דרך בכל פעם. לאחר מכן, לייבש את הטור על ידי צנטריפוגה אותו במהירות של לפחות 10, 000 פעמים g במשך שתי דקות. אלוט RNA על ידי הוספת 50 microliters של מים צנטריפוגה במהירות של לפחות 10, 000 פעמים g במשך שתי דקות.

לאסוף את הזרימה דרך ולהעביר אותו לצינור חדש 1.5 מיליליטר. לקבוע את כמות RNA באמצעות שיטת הבחירה של החוקר ולאחסן ב שלילי 80 מעלות צלזיוס לפני ניתוח נוסף. לדלל את פתרון מלאי תות התא 10X לפתרון מלאי תזה תא 1X עם מים כיתה תרבות התא.

מחדש את קוקטייל מעכב פרוטאז להגדיר אחד עם מיליליטר אחד של מים כדי להפוך את מלאי מעכבי פרוטאז 100X. הוסף 100 מיליליטר של מעכב פרוטאז ל 9.9 מיליליטר של מאגר תות שדה תא 1X כדי להשיג פתרון מלאי סופי 1X. הוסף ארבעה microliters של חיץ תות שדה קר קרח עבור כל מיליגרם של אבקת רקמות ולהוסיף אחד חמישה מילימטר נירוסטה חרוז לצינור.

מערבולת הצינור ב 3, 000 סל"ד במשך 60 שניות. מעבירים את הצינור לקרח רטוב וממשיכים לדגימה הבאה. בנוסף, החוקרים עשויים למצוא כי הצבת התיבה אנכית יכול להקל טוב יותר ערבוב עם חרוז.

לאחר שעה אחת, צנטריפוגה הצינורות ב 10, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מעבירים את העל-טבעיים לצינור טרי ומוודאים להימנע משכבת השומן בחלק העליון. לקבוע את ריכוז החלבון הכולל.

Aliquot כל מדגם לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולאחסן אותם שלילי 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לבצע ניתוח נוסף. במחקר זה, שיטת עיסת קריוגניים משמשת לעיבוד כפות מורין על מנת לשפר את התשואה והאיכות של RNA או חלבון המופקים מהרקמות ולאפשר ניתוח של פרופילים מולקולריים הקשורים לתגובות דלקתיות. הדמיה ייצוגית של תמונת ג'ל מראה את ה-RNA המופק מכפות קדמיות של עכברי CIA.

28S rRNA ו 18S rRNA להקות עולה כי כל הדגימות יש כמות מספקת של RNA שלם. חלקת פיזור מייצגת של ריכוזי החלבון הכוללים המבוססים על ניתוח חלבון BCA מוצגת כאן. ריכוזי החלבון הכוללים מעכברים נאיביים, עכברי CIA או עכברי CIA תחת טיפולים שונים דומים בין קבוצות.

ניתוחי Luminex נערכים לאחר מכן כדי לקבוע את הריכוזים של ציטוקיני דלקתיים כימוקין בתמצית החלבון. חלקת פיזור מייצגת של ריכוזי ציטוקינות וכמוקינות מנורמלות מגלה כי בהשוואה לעכברים נאיביים, מספר ציטוקינות מוגבהות בעכברי CIA וטיפול בנוגדן אנטי IL17A מעכב באופן משמעותי את הייצור של מספר ציטוקינות. ניתוח Microarray מבוצע כדי להעריך שינויים transcriptome ב-CIA ואפקטים הקשורים לטיפול.

עלילה מייצגת של מפת חום של גנים גדלה באופן משמעותי בעכברים של ה-CIA בהשוואה לעכברים נאיביים מוצגת כאן. בעת ביצוע הליך זה, זה קריטי עבור החוקרים כדי למזער את הזמן כי הצינור והאבקה נשמרים מתוך קרח יבש. זה עוזר למנוע הפשרה של האבקה ובעיות הבאות RNA מושפל וחלבון.

האיכות הגבוהה של החתימות המולקולריות הנוצרות על ידי טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את הפרופיל הייחודי שהטיפולי מקנה ומאפשרת עוד יותר את הבידול של מנגנונים שניתן להשתמש בהם לטיפול במצבים דלקתיים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחלץ מספר רקמות צפופות כמו אוזניים ועצמות כדי להעריך עוד יותר חתימות מולקולריות ברקמות אלה של עניין. הבנת האופן שבו טיפולית לווסת את החתימות המולקולריות של המחלה מאפשרת לנו להעריך טוב יותר אילו מסלולי איתות ספציפיים מווסתים.

ואולי אפילו יותר חשוב, מה המסלולים אינם מוסדרים עם המנגנון הטיפולי להיות מוערך. כאשר עובדים עם חנקן נוזלי וקרח יבש, חובה להשתמש בציוד מגן אישי כולל כפפות מדורגות כראוי ומגני פנים. חשיפה של העור במשך יותר מכמה שניות עלולה לגרום לכוויות חמורות.

כאשר עובדים עם כמויות גדולות של קרח יבש, חשוב לעבוד באזור מאוורר היטב כמו קרח יבש משחרר פחמן דו חמצני.