Name: המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: חקור תחבורה תאיים של אורגנלים באסטרוציטים ממקור עכברי באמצעות דימות תאים חיים. הפרוטוקול מאפשר ניתוח דינמיקת חלקיקים בזמן אמת ובמצבים פתולוגיים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DNL נתמך על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בבית הספר לרפואה בצ היל (UNC) בתור מלומד סימונס. TWR נתמך על ידי UNC הכנה גרנט ראשי 25 GM089569. העבודה באמצעות מרכז מיקרוסקופ הליבה UNC המרכז היה נתמך, בין השאר, על ידי מימון של NIH-NINDS מרכז המחקר תמיכה מענק P30 NS045892 ו NIH-מוגבלות התפתחותית מרכז מחקר התפתחותי תמיכה מענק U54 HD079124.

<ol><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+Glia%2C+the+unacknowledged+partner%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li>
<li>Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-neuron+metabolic+relationships%3A+for+better+and+for+worse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li>
<li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li>
<li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+Synapse+Formation%2C+Function%2C+and+Elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370(2015).</li>
<li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li>
<li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li>
<li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li>
<li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li>
<li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217(2015).</li>
<li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079(2013).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li>
<li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li>
<li>Cordelières, F. P. IJ KymoToolBox. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, אנו מתארים גישה ניסיונית לבטא, להמחיש, ולעקוב אחר מתויג fluorescently וחלבונים ממברנה של עניין באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות ב-high-טוהר העכבר הראשי בקליפת המין הראשונית MD. אנו גם מתווה מתודולוגיה למדידת דינמיקת חלקיקים. ויזואליזציה ישירה של חלבון ו אורגונל דינמיקה ב אסטרוציטים הראשי מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד את הרגולציה של הובלה תאיים בתאים אלה בתוך מבחנה.
המתודולוגיה להקמת העכבר MD התרבויות אסטרוציט שתוארו לעיל משלבת צעדים מפרוטוקולים אחרים שפורסמו13,...

Astrocytes הם התאים השופעים ביותר במערכת העצבים המרכזית למבוגרים, שם הם מבצעים ייחודי התפתחותית פונקציות הומסטטיות1. Astrocytes לווסת את ההתפתחות הסינפטית באמצעות מגע ישיר עם מסופים טרום ו פוסט סינפטית במסגרת סינפטה משולש, אשר מכיל קולטני הנוירוטרנסמיטר, מובילים, תא מולקולות הדבקה המקלים על היווצרות סינפסה והתקשורת האסטרוציטותא2. בנוסף, האסטרוציטים באופן פעיל לשלוט שידור סינפטית ולמנוע מפני הזדקנות העצבים העצבית על ידי הסרה מהירה של נוירוטרנסמיטרים מתוך שסוע סינפטית, מיחזור נוירוטרנסמיטורים, והשתתפות בגיזום סינפטית3 , ד , מיכל 5 , 6. כדי לאפשר אלה פונקציות אינטראקטיביות מאוד, האסטרוציטים לתקשר בינם לבין עצמם, עם תאים גליה אחרים, עם נוירונים באמצעות חלבונים ממברנה מיוחדים, כולל מולקולות הדבקה התא, aquפורטל, ערוצי יונים, מובילי הנוירוטרנסמיטר ומולקולות של צומת הפער. Astrocytes פעיל לשנות את רמות פני השטח של חלבונים אלה בתגובה תנודות בסביבה הפנים והחילוץ שלהם7. יתר על כן, שינויים ברמות והפצה של המיטו, טיפות ליפיד, ו degradative ומיחזור אורגלים לווסת את אספקת האנרגיה, זמינות מטבוליט, ותהליכי סליקה סלולריים החיוניים לפונקציה אסטרוציט ו ישרדות.
השינויים הדינאמיים בחלבון ממברנה ובסחר בנשים ומיצוב באסטרוציטים מקדמים את הפונקציה מתואמת של חלבונים ומתאמים מוטוריים המעודדים תנועתיות מטענים8,9. באופן דומה, רמות פני השטח של חלבונים ממברנה מאופנן דרך הפנמה ומיחזור אירועים10. אלה מטענים מועברים באמצעות רשת מורכבת של actin, microtubules, ואולי ביניים רצועות שירים8. מחקרים המבוססים על כתמים immunofluorescence של הקצה מחייב חלבון 1 (EB1), אשר מצטבר על מיקרוכדורית הגוברת ומסתיים, מציע כי בצרורות אסטרוציטים של microtubules מקרין החוצה מתוך החוצה ולהאריך את קצה הפלוס שלהם לכיוון מפריפריה11. עם זאת, בדיקה מקיפה של הארגון וקוטביות של microtubules ואלמנטים ציטולדים אחרים באמצעות הדמיה תא חי עדיין חסר. בעוד רבים של המנגנונים המשמשים את הדינמיקה של אורגלים וחלבונים ממברנה נחקרו בהרחבה בנוירונים וסוגי תאים אחרים, תנועתיות מטענים ב אסטרוציטים הוא פחות טוב מובן. רוב הידע הנוכחי שלנו על שינויים חלבון ו אורגונל התפלגות ב אסטרוציטים מבוסס על מסורתי נוגדן מבוסס תיוג של הכנה קבועה, אשר מונע בדיקה מרחבית וזמני מדויק של דינמיקה מטענים7, . שתיים עשרה
כאן, אנו מתארים שיטה לתייג חלבונים הממברנה ואורגלים עבור הדמיה חיה בתרבויות גבוהה העכבר הראשי אסטרוציט הטוהר. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מספקים דוגמאות שבו אנו מעקב אחר הלוקליזציה הדינמי של חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-מתויגים חלבונים ממברנה ב astrocytes הטרנסתאי, כולל הפער הפערים חלבון קונשין 43 (Cx43-GFP) ואת חומצת האמינו המתומנת טרנספורטר 1 (EAAT1-GFP). אנו גם לתאר את השימוש של החללית הניאון ac, בדיקה כדי להמחיש אורגלות חומצי ולעקוב אחר הדינמיקה שלהם הסחר בחיים astrocytes. בסופו של דבר, אנו להדגים כיצד לנתח את הנתונים לשגות זמן כדי לחלץ ולהעריך את הפרמטרים התחבורה עבור cargos בודדים.

<table><tbody><tr><td>2.5% טריפסין (10x)</td> <td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-203-637</td><td>Sorvall ST8 צנטריפוגה</td></tr><tr><td>תרבית תאים בדרגת שיבוט מים</td><td>Gen</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ תרבית תאים</td><td>Zeiss</td><td>WSN-AXIOVERT A1</td><td>Vert.A1 היקף הפוך, מיקרוסקופ תרבית רקמה הפוך עם יכולות</td></tr> <tr><td>פלואורסצנטיותציטוזין ארבינוזיד</td><td>סיגמא</td><td>C1768-100MG</td> <td>(AraC) ממיסים אבקה ליופילית במים סטריליים בדרגת תרבית תאים ליצירת מלאי של 10 מ"מ, ממיסים והקפאה לאחסון לטווח ארוך</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td>ממיסים אבקה ליופילית במים נטולי יונים לריכוז מקסימלי של 20 מ"ג/מ"ל, חום או סוניקט לפי הצורך. יש להשתמש ב-300 ננומטר לצביעה נגדית.</td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Stemi 305</td></tr><tr><td>מספריים מנתחים</td><td>FST</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gen Clone</td><td>25-500</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>מזל תאומים</td><td>100-106</td><td>פיג'י מושבת בחום</td></tr><tr><td>(פיג'י היא רק תמונה J)</td><td>NIH</td><td>גרסת 1.52i</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה עם קצה דק</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>סגנון #5</td></tr><tr><td>מקור אור פלואורסצנטי</td><td>Excelitas</td><td>012-63000</td><td>X-Cite 120Q</td></tr><tr><td>GFAP נוגדן</td><td>איתות תאים</td><td>3670S</td><td>GFAP (GA5) נוגדן חד שבטי עכבר</td></tr> כלים <tr><td>תחתונים זכוכית</td><td>תאגיד מטק</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>צלחת 35 מ"מ | מס' 1.5 כיסוי | קוטר זכוכית 14 מ"מ | מלקחיים לא מצופים</td></tr><tr>של<td>Graefe</td><td>F.S.T</td><td>11054-10</td><td>מלקחיים של איריס Graefe עם קצוות מעוקלים</td></tr><tr><td>צבע פלואורסצנטי ירוק שמכתים תאים חומציים (אנדוזומים וליזוזומים מאוחרים)</td><td>Life Technologies</td><td>L7526</td><td>LysoTracker ירוק DND 26. מומס מראש ב-DMSOS לתמיסת מלאי של 1 מ"מ. יש לדלל לריכוז העבודה הסופי במצע הגידול או במאגר הנבחר.</td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק (10x)</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td>מגנזיום וסידן</td></tr><tr><td>הדמיה</td><td>מדיה טכנולוגיות חיים</td><td>A14291DJ</td><td>תמיסת הדמיה של תאים חיים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>KymoToolBox</td><td></td><td></td><td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td></tr><tr><td>מגיב משפר ליפופקציה</td><td>Life Technologies</td><td>11514015</td><td>Plus Reagent</td></tr><tr><td>Lipofection Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15338100</td><td>Lipofectamine LTX reagent</td></tr><tr><td>חממת טלטול אורביטלית</td><td>ניו ברונסוויק סיינטיפיק</td><td>8261-30-1008</td><td>Innova 4230 , חממת טלטול מסלולית עם בקרת טמפרטורה ומהירות</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין/סטרפומיצין (100x)</td> <td>Gen Clone</td><td>25-512</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (10x)</td><td>Gen Clone</td><td>25-507x</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7405</td><td>מתמוסס ב-Tris buffer, pH 8.5, ב-1 מ"ג/מ"ל. מקפיאים לאחסון לטווח הארוך. הימנע ממחזורי הקפאה והפשרה</td></tr><tr><td>מדיום סרום מופחת</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>OPTI-MEM</td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית רקמות</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-209</td><td>75 ס"מ^2. 100% גישה לצוואר זוויתי, מכסה מסנן מאוורר הידרופובי 0.22um</td></tr><tr><td>חממת תרבית רקמות</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030285</td><td>HERAcell VIOS 160i, חממת תרבית רקמות עם בקרת טמפרטורה, לחות ו-CO2</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>8.402 גרם מומס לליטר אחד במים עם 4.829 גרם Tris HCl לייצור 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>4.829 גרם מומס לליטר אחד במים עם 8.402 גרם Tris Base לייצור 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>מערכות סינון מונעות ואקום</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-227</td><td>500 מ"ל, ממברנת PES, 0.22 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>Vannas מספריים ישר</td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr></tbody></table>

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes הם בין סוגי התאים הנפוצים ביותר במוח המבוגר, שם הם משחקים תפקידים מרכזיים בריבוי של פונקציות. כשחקן מרכזי בהומאוסטזיס המוח, האסטרוציטים לספק נוירונים עם מטבוליטים חיוניים מאגר המים, יונים, ו גלוטמט. מרכיב אינטגרלי של "tri-פרטיטה" סינפט, אסטרוציטים הם גם קריטיים היווצרות, גיזום, תחזוקה, ואפנון של הסינפסות. כדי להפעיל פונקציות אינטראקטיביות מאוד אלה, אסטרוציטים לתקשר בינם לבין עצמם עם תאים גליה אחרים, נוירונים, המוח ולוח הסביבה באמצעות המון חלבונים ממברנה מיוחדים הכוללים תא מולקולות הדבקה, אקואפונס, ערוצי יונים, מובילי נוירוטרנסמיטר ומולקולות של צומת הפער. כדי לתמוך השטף הדינמי הזה, astrocytes, כמו נוירונים, להסתמך על תחבורה מתואמת היטב ויעיל הובלה תאיים. בניגוד לנוירונים, שם הסחר התאיים היתה מבוססת בהרחבה, הובלה microtubule דורית מבוסס אסטרוציטים כבר נחקרו פחות. עם זאת, הסחר exo-ו endocytic של ממברנות התא חלבונים והתחבורה התאיים ארגונית הובלה בביולוגיה נורמלית, תהליכים אלה מושפעים לעתים קרובות במחלה או בתגובה לפציעה. כאן אנו מציגים פרוטוקול ישיר לתרבות האסטרוציטים באיכות גבוהה, כדי לסמן חלבונים אסטרוציטוטיים התווית והאורגלים של עניין, ולהקליט את הדינמיקה התחבורה התאיים שלהם באמצעות הזמן לשגות במיקרוסקופ קונפוקלית. כמו כן, אנו מדגימים כיצד לחלץ ולכמת את פרמטרי התחבורה הרלוונטיים מהסרטים הנרכשים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה (כגון, ImageJ/פיג'י) תוספים.

הפרוטוקול להקמת העכבר הראשי MD אסטרוציטים המתואר לעיל צריך להניב התשואה, תרבויות באיכות גבוהה. למרות שתרבויות מכילות בתחילה שילוב של אסטרוציטים, פיברותקיעות, ותאים גליאל אחרים, כולל מיקרוגלייה ו oligodendrocytes הפוך (איור 1Bi,בוולוף; ראשי חץ אדומים), תוספת arac אל התרבות המעורבת בין DIV5-DIV7 ממזער התפשטות תאי הזיהום הללו. הטיפול המשולב arac ולרעוד מבוסס האסטרטגיה טיהור מעשיר את הטוהר של התרבויות אסטרוציט (איור 1bii) על פרוטוקו...

כאן אנו מתארים בשיטת הדמיה לחיות מחוץ לתמונה כדי להמחיש הובלה תאיים של אורגלים וסחר של חלבונים קרום פלזמה ב astrocytes מורטין. פרוטוקול זה מציג גם מתודולוגיה לניתוח תמונה כדי לקבוע מסלולים להובלת מטענים וקינטיקה.

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לחקור את תנועתיות לוקליזציה של organelles אסטרוציטים או חלבונים תחת סביבות חוץ תאיות מבוקרות מצבי מחלה קלה. שלא כמו ההכנות הקבועות של MHA, המספקות תמונות בודדות של לוקליזציה של חלבונים ואברונים, טכניקת ההדמיה החיה שלנו יכולה לשמש לניתוח דינמיקת חלקיקים באסטרוציטים חיים בודדים. יום לפני אסטרוציטים זרעי transfection בצפיפות המתאימה להדמיה ב 24 עד 48 שעות לאחר transfection.מדללים את רגנט ליפוקציה במדיום סרום מופחת לריכוז הניסוי המתאים. לדלל חמישה מיקרוגרם של DNA טוהר גבוה ב 250 microliters של מדיום סרום מופחת ולהוסיף חמישה microliters של reagent משפר lipofection לצינור. מערבבים את רגנט lipofection עם נפח שווה של תערובת משפר lipofection DNA להדגיר את הפתרון במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, להסיר את supernatant מתרבות האסטרוציטים ולהוסיף 100 microliters של תערובת transfection dropwise לתאים. לאחר שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, להחליף את קומפלקס transfection עם נפח מתאים של תרבות אסטרוציטים בינוני ולהחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך 24 עד 72 שעות נוספות. 30 דקות לפני ההדמיה, לדלל בדיקה תיוג lysosomal מתאים ב 200 microliters של מדיום תרבות אסטרוציטים לריכוז עבודה של micromolar אחד ולתייג את האסטרוציטים עם בדיקה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם בינוני תרבות אסטרוציטים חם ולהחליף את לשטוף עם מדיום הדמיה. מיד לאחר תיוג הגשוש, מניחים את מיכל תרבות האסטרוציטים במתאם המתאים בשלב המיקרוסקופ ובשימוש באור פלואורסצנטי של EBI, מאתרים את התאים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים או בדיקה. השתמש במצלמה הדיגיטלית כדי לכוונן את תאורת הדגימה הפלואורסצננטית כדי להמחיש את התאים הנבחרים ולהתאים את המוקד ולהגדיל את התצוגה לתא בודד.לאחר מכן השתמש בפונקציות זום והתמקדות מוגדרת כדי להשיג סידרת זמן-lapse אחת של מחסנית Z בתדירות של מסגרת אחת כל שתי שניות עבור מרווחי זמן הנעים בין 300 ל- 500 שניות. שמור וייצא את התמונות לשגות בזמן כקבצי מחסנית AVI או TIFF. כדי לנתח את התמונות לשגות בזמן, פתחו את רצף התמונות של זמן ההפוגה ב- ImageJ או בפיג'י ולהשתמש בכלי פיצול ערוץ כדי לפצל את הערוצים.בתדמית הערוץ הירוק של שמונה סיביות, השתמש בכלי קו מקופל כדי לעקוב אחר קו לאורך מסלולי החלקיקים באמצעות אותה מוסכמה כיוונית רצויה עבור כל הסרטים, כך שהקוטביות עקבית בתוך כל התאים הנחקרים. לחץ פעמיים על הכלי קו כדי להתאים את רוחב הקו כדי להתאים את עובי המסלול ולהפעיל את המאקרו צייר Kymo של תוסף תיבת כלים Kymo באמצעות רוחב קו של 10. תופיע בקשה המבקשת לכייל את התמונה בזמן ובמקום.לאחר כיול, קימוגרפים ייווצרו ו ניתן לשמור אותם כקבצי TIFF. כדי להקצות מסלולי חלקיקים, השתמש בכלי קו מקופל כדי לעקוב באופן ידני אחר כל חלקיק בקימוגרף למשך כל תקופת הרכישה ולהשתמש במנהל החזר ההשקעות כדי לתעד כל מסלול חלקיקים כאזור מעניין. שמור את כל אזורי העניין לכל וידאו לשגות זמן לניתוח נוסף ולהפעיל את המאקרו לנתח Kymo של תוסף תיבת כלים Kymo.ייפתח חלון המבקש להגדיר את הכיוון החיצוני של תנועת החלקיקים מגרעין תא העניין מהתפריט הנפתח. יש להגדיר את מהירות המגבלה בהתאם לרגישות התוכנה לכל מטען מעניין ויש להתאים את רוחב הקו כך שיתאימו לעובי של כל מסלול חלקיקי. רשום את כל הנתונים ואת יומן קואורדינטות אקסטרפולציה צריך להיות לחישוב של הפרמטרים השונים הובלת מטען.לחץ על אישור. הנתונים המחושבים עבור הרצועות הבודדות יאגרו לאחר מכן לכל קימוגרף ויישמרו בקבצי טקסט הספציפיים לכל תמונה. שילוב טיפול ציטוצינוס ערבינוסייד עם אסטרטגיית טיהור מבוססת טלטול מעשיר את טוהר תרבויות האסטרוציטים על פני פרוטוקולים מסורתיים הכוללים את צעד הטיהור בלבד.transfection מבוסס Lipofection מאפשר ביטוי חולף של חלבונים ברמות אופטימליות עבור הדמיה של תאים חיים מבלי לגרום רעילות או להשפיע על הכדאיות אסטרוציטים. באופן דומה, השימוש בבדיקה פלואורסצנטית מאפשר תיוג מהיר ויעיל של אורגנים אנדוליזומליים חומציים למעקב אחר דינמיקת אורגנל ואסטרוציטים. ניתן להשתמש בנתונים של זמן לשגות מההדמיה כדי ליצור קימוגרפים העקובים אחר תנועת המטען בזמן ו בחלל.בקימוגרף אלה, תנועת אנטרוגרד של המטען המצוין מיוצגת על ידי מסלולים עם מדרונות שליליים, בעוד תנועה מדרדרת מיוצגת על ידי מסלולים עם מדרונות חיוביים. מעולםים נייחים מופיעים כמסלולים אנכיים. בניתוח זה, כימות השטף של מטען מסוים דרך אזור של האסטרוציטים חשף הבדלים באחוז החלקיקים המודאליים בקרב מטענים אשר עשויים להיות מייצגים את תנועתיות קו הבסיס הרגיל שלהם באזור האסטרוציטים שבתוכם נרכשו הסרטים.המיפוי המדויק של השינוי במיקום X, Y לאורך ציר הזמן המלא עבור כל חלקיק המתקבל מהקימוגרף יכול לשמש גם להערכת פרמטרי תנועה אחרים, כגון מהירות מטען ואורך ריצה. מכיוון שפרוטוקול זה דורש תרבויות אסטרוציטים באיכות גבוהה ותיוג מטען יעיל, יש להתאים את זמן הדגירה והרכישה של ה-transfection עבור כל פלסמיד או מטען של עניין. פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לאפיין אירועי תחבורה אסטרוציטים בתגובה לנזק לתאים, רעילות, מוטציות פתוגניות, פעילות סינפטית, או שינויים בסביבה החוץ תאית.

visualizing-analyzing-intracellular-transport-organelles-other-cargos

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים כיצד למדוד ליד קרום והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי בתרבית בתוך האסטרוציטים באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופיה epifluorescence.

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

מקור: Moye, S. L., et.al.  ויזואליזציה של מורפולוגיה של אסטרוציטים באמצעות יונטופורזיס צהוב של לוציפר. J. Vis. exp. (2019).  סרטון זה מדגים את השימוש ביונטופורזיס בצבע פלואורסצנטי כדי לחקור מורפולוגיה של אסטרוציטים בפרוסות מוח קבועות. הוא מפרט את הניקוב של סומה האסטרוציטים עם אלקטרודה כדי להעביר צבע אניוני, הידרופילי לתוך הציטופלזמה תחת זרם מתח נמוך, מה שמאפשר לצבע לפזר ולתייג את הסומה והענפים. לאחר מכן משתמשים במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להמחיש את האסטרוציטים המסומנים ולספק תובנות מורפולוגיות.

הדמיה של מורפולוגיה של אסטרוציטים באמצעות יונטופורזה של צבע פלואורסצנטי בפרוסת מוח קבועה של עכבר

מקור: Creighton, B. A., et al. הדמיה וניתוח הובלה תוך-תאית של אברונים ומטענים אחרים באסטרוציטים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההדמיה של הובלת מטען תוך-תאית באסטרוציטים מתורבתים באמצעות בדיקה חומצתית פלואורסצנטית המסמנת באופן סלקטיבי שלפוחיות אנדוליזוזומליות חומציות. הדמיית זמן-lapse ורכישת Z-stack עם מיקרוסקופ קונפוקלי מאפשרים מעקב אחר מטען עם תווית פלואורסצנטית לאורך נפח התא התלת מימדי. הניתוח מבדיל בין מטען נייח למטען הנע לעבר פריפריית התא או הגרעין, ומספק תובנות לגבי דינמיקת הובלה...

הדמיה של הובלה תוך-תאית של מטען באסטרוציטים מתורבתים

כאן אנו מתארים עיבוד של פרוטוקולים המשמשים כדי לגרום פלסטיות homeostatic בנוירונים לחקר הפלסטיות של קולטני G-חלבון בשילוב astrocytic. לאחרונה משמש כדי לבחון שינויים בקבוצת astrocytic אני mGluRs בעכברים לנוער, ניתן ליישם השיטה למדידת קנה מידה של GPCRs astrocytic השונות, ברקמות של עכברים בוגרים באתרו וin vivo, ולקבל הערכה טובה יותר של הרגישות של קולטני astrocytic לשינויים בפעילות עצבית.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

המאפיינים והתפקודים של אותות Ca2+ תוך-תאיים של אסטרוציטים בסטריאטום עדיין לא נחקרו במלואם. אנו מתארים שיטות לביטוי מדדי סידן מקודדים גנטית באסטרוציטים סטריאטליים באמצעות נגיפים הקשורים לאדנוטיפ 2/5 (AAV2/5), כמו גם נהלים להדמיה מהימנה של אותות Ca2+ בתוך אסטרוציטים סטריאטליים באתרם.

ההדמיה תאית Ca 2 + אותות בstriatal האסטרוציטים מעכברים בוגרים באמצעות אינדיקטורים סידן מבחינה גנטית מקודדים

אסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית משנים את תכונותיהם התפקודיות והמבניות בתגובה לגירויים מזיקים. דוח זה מציג פרוטוקול להערכת מורפולוגיה תלת מימדית של אסטרוציטים במצבי מחלה או לאחר התערבויות טיפוליות.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את הארגון של רשתות astrocytic. השיטה המתוארת ממזער הטיה לספק מדדים תיאוריים של רשתות אלה כגון ספירת תאים, גודל, שטח, מיקום בתוך גרעין. . בנוגע למקורו שקובעת עם ניתוח וקטורי.

ניתוח של גודל, צורה, כיוון של רשתות של האסטרוציטים בשילוב

קו הצינור המתואר מיועד לפילוח של נתונים מיקרוסקופ אלקטרונים הגדולים יותר מאשר ג'יגה-בתים, כדי לחלץ מורפולוגיות תא שלם. לאחר התאים משוחזרים ב-3D, תוכנה מותאמת אישית שתוכננה סביב צרכים בודדים ניתן להשתמש כדי לבצע ניתוח איכותי כמותי ישירות ב-3D, גם באמצעות מציאות וירטואלית כדי להתגבר על החסימה השקפה.

שיטה לניתוח שחזור תלת מימד ומציאות וירטואלית של תאים גליאל ונוירוונאליות

האסטרולוגים הם תאים מורכבים מורפולוגית, לידי ביטוי על ידי התהליכים המרובים שלהם בשטחים סבוך. כדי לנתח את המבנה המשוכלל שלהם, אנו מציגים פרוטוקול אמין כדי לבצע לוציפר תאיים ביוטופהורזיס צהוב בעדינות רקמה קבועה.

המחשה מורפולוגיה באמצעות לוציפר ביוטופזיס צהוב

שילוב של התמרה וקטורית נגיפית וניקוי מוח בשיטת CLARITY מאפשר לחקור מספר רב של נוירונים ואסטרוציטים בו זמנית.

חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים

פרוטוקול זה מתאר שיטות לחתך, צביעה והדמיה של מקטעי רקמה צפים בחופשיות במוח העכבר, ולאחר מכן תיאור מפורט של ניתוח נפח טריטוריית האסטרוציטים וחפיפת שטח האסטרוציטים או הריצוף.

ניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף בקטעי רקמה עבים שצפים בחופשיות

חקור תחבורה תאיים של אורגנלים באסטרוציטים ממקור עכברי באמצעות דימות תאים חיים. הפרוטוקול מאפשר ניתוח דינמיקת חלקיקים בזמן אמת ובמצבים פתולוגיים שונים.

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

גלה סרטונים נוספים