Name: ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: למדו פרוטוקול משופץ לבידוד וניתוח מטבוליזם של תאי גזע המטופאות ממח עצם מוריני. השיטה מאפשרת מדידה מדויקת של נשימת מיטוכונדריה וגליקוליזה בתאים עדינים ונדירים אלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מהווה חלק בתמיכת המימון של המכון הלאומי לבריאות (HL131645, CA016058), קרן סנט בלדריק וקרן פליטוניה.

פרוטוקול זה אושר על ידי הילדים ברחבי המדינה טיפול בבעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC).
הערה: הפרוטוקול מתואר בסדר כרונולוגי המתפרס במשך יומיים. השתמש ריאגנטים טרי כפי שמתואר בפרוטוקול להלן.
1. הכנת ריאגנטים ביום שלפני השיטת הזמן
<ol><li>
. מימה את מחסנית החיישנים
	<ol>
<li>דגירה 5 מ ל של הכייל (לוח חומרים) ב2 37 מעלות צלזיוס בחממה במשך הלילה.</li>
		<li>פתח את ערכת שיטת השטף (טבלת חומרים) והפרד את מחסנית החיישן (ירוק; למעלה) מלוח כלי השירות (שקוף; למטה). הבא, למקם את מחסנית חיישן הפוך וצמוד לצלחת השירות.</li>
		<li>באמצעות מים סטריליים, למלא את הבארות של צלחת השירות (200 μL) ואת התאים סביב הבארות (400 μL).</li>
		<li>לטבול את מחסנית חיישן לתוך צלחת השירות וודא כי החיישנים מכוסים לחלוטין על ידי מים. ברז 3x כדי למנוע את היווצרות של בועות.</li>
		<li>מניחים את המחסנית מתחת לצלחת כלי השירות בחממה בלתי-משותפת של2 37 ° c. כדי למנוע אידוי של המים, ודא כי החממה מחולל כראוי. מניחים גביע פתוח המכיל את H2O כאמצעי זהירות נוסף ליד צלחת כלי הדיו, במיוחד אם משתמשים בתנור רגיל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
. הכן את צלחת השיטת ההכנה
	<ol>
<li>לחטא את פני השטח של הקבינט אבטחה טיחות מחלקה 2 באמצעות 70% אתנול. . פתח את לוחית הכיסוי מתחת למכסה המנוע</li>
		<li>הוסף 40 μL של מסחרית זמין 0.01% (w/v) הפתרון פולי-L-ליזין (PLL) לכל הטוב של צלחת שיטת הנתונים מתחת למכסה המנוע.</li>
		<li>כסו את צלחת המערכת עם המכסה המסופק בערכה. מודקת את הלוחית הסגורה בטמפרטורת החדר (RT) מתחת למכסה המנוע במשך 1 h. הערה: המטרה של הדגירה היא לתת PLL לחלוק את פני השטח של צלחת השיטת כדי להקל על הדבקה של תאים ההשעיה על פני השטח של צלחת השיטת.</li>
		<li>לאחר 1 h הדגירה של צלחת השיטת, להסיר את הפתרון העודף עם מייבש ואקום סטרילי מבוסס ואוויר יבש היטב מתחת למכסה המנוע. הערה: זה לוקח ~ 30-60 דקות לאוויר יבש את הבארות של צלחת השיטה בעקבות הסרת PLL מוגזם באמצעות מייבש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. יום השיטת הזמן
<ol><li>הכן את מיכל הדיו.
	<ol>
<li>הרם את מחסנית החיישן. מניחים אותו הפוך במכסה התרבותי של הרקמה ולהשליך את המים מן הצלחת כלי השירות.</li>
		<li>למלא את הצלחת השירות בארות עם 200 μL של טרום מחומם.</li>
		<li>ממלאים את התאים סביב הבארות עם 400 μL של כאשר.</li>
		<li>לטבול את מחסנית חיישן לתוך צלחת כלי השירות, וודא כי החיישנים מכוסים לחלוטין על ידי מכייל. ברז 3x כדי למנוע את היווצרות של בועות.</li>
		<li>באמצעות מחסנית חיישן מתחת לצלחת השירות בתוך מיכל שאינו CO2 37 ° c בחממה עבור 45-60 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>לקצור מח עצם ממורין.
	<ol>
<li>כדי להכיל מספר משכפל ביולוגי מספיק, תכנן להשתמש ב-HSPCs הנגזר מעכבר אחד לכל היותר בלוח השימוש. הערה: זו שיטת האיסוף מח עצם מספק ~ 50,000 ל80000 LSK HSPCs מכל עכבר. פרוטוקול זה כדי למדוד השטף החילוץ ממוטב עבור ~ 70,000 LSK HSPCs לכל טוב של 96 היטב צלחת.</li>
		<li>עכברים המתת חסד באמצעות שיתוף מנת יתר של2 ו צוואר הרחם, בעקבות שיטות IACUC מקומיות מאושרות.</li>
		<li>לחטא את פני השטח של כלים מבתר ואת הספסל באמצעות 70% אתנול.</li>
		<li>עבור כל עכבר, למלא מראש צלחת פטרי אחת עם מלוחים 1 x פוספט באגירה (PBS) המכיל 2% חום בלתי פעיל מופעל סרום העובר (FBS) ב RT. הערה: אין להשתמש ב-PBS מקורר כפי שהוא ייצור גושים בשלבים הבאים.</li>
		<li>תרסיס 70% אתנול (v/v) על העכבר כולו מורדמים. לבודד את כל העצמות, כולל גפיים העליון והתחתון, היפ עצמות, עצם החזה, צלעות, ושדרה, מהעכבר17,18. משוך החוצה חומר לבן מחוט השדרה של העכבר כפי שהוא יכול לזהם תאים LSK. הצב את כל העצמות ב-1x PBS (+ 2% FBS), כאשר הם נאספים, בצלחת פטרי עד לשימוש נוסף.</li>
		<li>היפוך צינור חרוט 50 mL (חדש בכל פעם) ולהשתמש בו כדי קצוצות עצמות שקוע ב-1x PBS (+ 2% fbs) בצלחת פטרי.</li>
		<li>באמצעות הצנרת 10 מ ל, פיפטה למעלה ולמטה (~ 10x) כדי לרוקן בצורה אחידה את התאים מעצמות, לאחר ריסוק עצמות.</li>
		<li>מניחים מסננת של תא 40 יקרומטר בשפופרת מלאה של 50 mL. טרום להרטיב את פני השטח של מסננת ידי העברת 1 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS).</li>
		<li>מח עצם קציר-השעיית התא נגזר משלב 2.2.7 ולהעביר אותו דרך משטח רטוב מראש של מסננת התא כדי להסיר פסולת עצם.</li>
		<li>חזור על שלבים 2.2.6 דרך 2.2.9 עד כל חומרי העצם להפוך לבן כסמן כי רוב התאים מח עצם נאספים 50 mL חרוט. הערה: זה לעתים קרובות לוקח 2 50 mL שפופרות חרוט לכל העכבר כדי לאסוף את כל מח עצם נגזר התאים.</li>
		<li>צנטריפוגה 50 מ"ל צינורות חרוטי המכילים מח עצם-תאים נגזר עבור 5 דקות ב 500 x g ו RT.</li>
		<li>. הסר את הסופרנטאנט להשעות את מח העצם-תאים נגזר (לשלב את התוכן של שניהם 50 mL) ב 5 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) כאמצעי אחסון סופי לשמור על תאים ב RT.</li>
	</ol></li>
	<li>. בסדר.
	<ol>
<li>הוסף 5 מ ל של צפיפות בינונית (כלומר, פיקדול) ל-15 מ"ל לצינור חרוט. ואז לאט להוסיף 5 מ ל של ההשעיה תא מח העצם. ודא שתאים נשארים כשכבה מעל למדיום מעבר הצבע של הדחיסות.</li>
		<li>צנטריפוגה עבור 30 דקות ב 500 x g ו RT. . אל תשתמש בבלם בצנטריפוגה ודא שצנטריפוגה נמצאת בהאצה הנמוכה ביותר האפשרית (לדוגמה, 1 האצה ו-0 האטה).</li>
		<li>לקצור את הממשק האמצעי של תאים מונונוכטיים (צבע לבן) לאחר צנטריפוגה לתוך צינור חדש 15 מ ל חרוט.</li>
		<li>לשטוף את התאים, שנקטפו מתוך צפיפות בינונית הדרגתי, עם 5 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS). צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. . הסר את הסופרנטאנט</li>
		<li>חזור על שלב ה2.3.4.</li>
		<li>השהה מחדש את תוכן התא של הצינור ב-300 μL של 1x PBS (+ 2% FBS). מחבר 10 μL של השעיית תא עבור שליטה בלתי מוכתמת או צבע יחיד בצינור FACS.</li>
	</ol></li>
	<li>. מתאי מח עצם מורקיים
	<ol>
<li>הפוך קוקטייל של ביוטין-נוגדנים על-ידי ערבוב 3 μL לכל מדגם של הנוגדנים הבאים: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. הוסף 15 μL של קוקטייל הנוגדן biotin כדי 300 μL של תאים במח העצם מונונולי. הערה: כל נוגדן משמש ב1:100 דילול.</li>
		<li>מודלת תאים עם קוקטייל biotin-נוגדן במשך 30 דקות ב -4 ° צ' עם עצבנות כדי למנוע תאים בתחתית הצינור.</li>
		<li>הוסף 10 מ ל של מקורר 1 x PBS (+ 2% FBS) לתאים מעורבבים עם קוקטייל biotin-נוגדן.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינור עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-400 μL של 1x PBS (+ 2% FBS). מחלקים 10 μL עבור streptavidin-בקרת צבע אחת.</li>
		<li>בקצרה מערבולת נגד biotin מיקרוחרוזים (טבלת חומרים) לפני השימוש. הוסף 80 μL של מיקרוחרוזים לכל דגימת תא (של 400 μL). מערבבים היטב ומשלבים במשך 20 דקות נוספות ב -4 ° c, עם עצבנות.</li>
		<li>הוסף 10 מ"ל של מקורר 1 x PBS (+ 2% FBS) לתאים. צנטריפוגה את הצינור עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c.</li>
		<li>השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-1 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS). החנות ב -4 ° c בעת הגדרת יחידת הפרדה מגנטית.</li>
		<li>הצב עמודה (טבלה של חומרים) בשדה המגנטי של מפריד התא בסיוע מגנטי (מקינטוש) ב -4 ° c. הכן את הטור להפרדה מגנטית על ידי שטיפה עם 3 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) תחת זרם הכבידה ב 4 ° c.</li>
		<li>הוסף את ההשעיה של התא משלב 2.4.7 לעמודה שלפני הרטוב ב-4 ° c. הניחו לתאים לעבור דרך הטור ב-4 ° c ולאסוף קולחים בשפופרת חרוט של 15 מ ל. הערה: השבר עם תאים בלתי מסומנים בקולחים כגון זה מייצג את תאי השושלת המועשרת שליליים.</li>
		<li>שטוף עמודה עם 3 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) ב -4 ° c. חזור על 3x. לאסוף את הזרימה ולשמור אותו ב 4 ° c. לספור את התאים הקיימא על ידי טריקון כחול הדרה באמצעות הומוציטומטר.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינור החרוט 15 מ"ל המכיל את הזרימה עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט השהה תאים מחדש ב-0.5 mL של 1x PBS (+ 2% FBS) והעבר את התוכן לשפופרת של FACS.</li>
		<li>הוסף 24 μL של קוקטייל הנוגדן LSK לכל 107 תאים. קוקטייל הנוגדן מכיל ריכוז שווה של 450-streptavidin נוגדן, PE-CY7-Sca1 נוגדן, ו-APC-c-Kit נוגדן.</li>
		<li>דגירה של 1 h ב 4 ° צ' עם עצבנות מתחת לחשיכה (מכוסה ברדיד פח).</li>
		<li>הוסף 3 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS) לצינור FACS. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x ו 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט</li>
		<li>השעיה מחדש של תאים מתויג באמצעות נוגדן 1 מ ל של 1x PBS (+ 2% FBS). הוסף 1 μL של 1 מ"ג/mL propidium יודיד להשעיה התא ממש לפני מיון.</li>
		<li>מסנן תוכן של צינור facs באמצעות מסננת 40 יקרומטר ימינה לפני מיון תאים lsk.</li>
		<li>לאסוף תאים LSK, באמצעות מיון FACS, לתוך צינור 1.5 mL המכיל 0.5 mL של מדיה מלאה בתוספת של 2 מ"מ גלוטמין, 3 מ"ג/mL גלוקוז, 1 מ"מ פירובט, 1x הטרובטין (TPO), הגורם הראשון של תא גזע (SCF), 0.5 x פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 7.4 pH</li>
	</ol></li>
</ol>3. נשימה מיטוכונדריאלי וגליקולזיס אסאמר של LSK HSPCs
<ol><li>
לאחר זריעה של LSK
	<ol>
<li>התאים צנטריפוגה LSK משלב 2.4.17 עבור 5 דקות ב 500 x ו RT. לבטל את הסופרנטאנט.</li>
		<li>השהה את התאים מחדש במדיה מלאה לריכוז סופי של לפחות 70,000 תאים/40 μL.</li>
		<li>תוכן הזרעים של 40 μL מדיה (המכיל 70,000 תאים) בצלחת מצופה PLL 8-באר משלב 1.2.4. . השאר את כל הבארות הפינתיות ריקות</li>
		<li>צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 450 x ו RT. . אל תחיל את הבלמים ודא כי תאים מחוברים לתחתית היטב באמצעות המיקרוסקופ הפוך.</li>
		<li>הוסף 135 μL של מדיה מלאה לתאים בכל באר עבור אמצעי אחסון סופי של 175 μL. הוסף 175 μL של מדיה מלאה לשתי פינות הלוחית כחללים ריקים.</li>
		<li>מודטת התאים בחממה שאינה CO2 עבור 2 h ב 37 ° c.</li>
		<li>הגדר תוכנית להוסיף תרופות לכל טוב של צלחת הבאר במנתח באמצעות מדד המתואר בטבלה 2 (מבחן מיטוכונדריאלי) ושולחן 3 (מבחן הלחץ של גליקוליזיס). הערה: בזמן שתאים מודלים, הפעל את המכשיר וודא שהוא נמצא ב-37 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מבחן מצוקה מיטוכונדריאלי
	<ol>
<li>להכין 45 μM פתרונות מניות של oligomycin, 50 μM קרבקסיל ציאניד 4-(טריפלורנומטוקסיק) פנילהידרזיט (FCCP) ו -25 μM פתרונות מניות של rotenone/antimycin A. כדי להכין 45 μM oligomycin מניות פתרון, לפזר את התוכן של הנרתיק הזמין מסחרית ב 280 μL של המדיה המלאה. כדי להכין פתרון מניות 50 μM FCCP, לפזר את התוכן של הנרתיק הזמין מסחרית ב 288 μL של המדיה המלאה. כדי להכין 25 μM rotenone/antimycin פתרון מניות, לפזר את התוכן של הכיס הזמין מסחרית ב 216 μL של המדיה המלאה.</li>
		<li>קח את מחסנית חיישן בצלחת השירות מתוך החממה ולטעון את היציאות שלה (A, B, ו-C) כך שכל טוב יהיה ריכוז סופי של 2 μM oligomycin, 1.5 μM FCCP, ו 0.5 μM של rotenone/antimycin A לפי הצורך, בעקבות דילול מדדים המתוארים בטבלה 4 (עבור שיעור צריכת החמצן)</li>
		<li>הסר את המכסה מן המחסנית חיישן התאספו לוחית השירות ומניחים אותו על מגש המכשיר. הפעל את הכיול שייקח 20 דקות.</li>
		<li>לאחר הכיול, הסר את צלחת כלי השירות והחלף אותו בצלחת היישום המכילה תאי LSK, הנמצאים כעת בתחתית הבאר.</li>
		<li>לחץ על המשך כדי להפעיל את התוכנית המתוארת בטבלה 2. לאחר סיום התוכנית, לאחזר את הנתונים ולנתח אותם באמצעות תוכנת שולחן העבודה Wave. הערה: הנתונים שנוצרו מתוך השטף מקבל מוסר ניתן להתוות באמצעות העלילה נקודה מתוכנת גל שולחן העבודה או מיוצא לתוכנית סטטיסטיקות מבוססות-אינטרנט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מבחן הדחק גליקוליזה
	<ol>
<li>מהווים גלוקוז ב 300 μL (100 mM), oligomycin ב 288 μL (50 μM), 2-D גלוקוז (2-DG) ב 300 μL (500 mM) של מדיה שלמה מתוך הנרתיק הזמין מסחרית.</li>
		<li>פיפטה בעדינות למעלה ולמטה (~ 10x) כדי לפתרון התרכובות. מערבולת 2-DG בערך 1 דקות כדי להבטיח פירוק הנכון לתוך התקשורת.</li>
		<li>הסר את מחסנית החיישן מהאינקובטור. טעינת יציאות A עד C בעקבות דילול מדדים המתוארים בטבלה 5 כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מ"מ גלוקוז, 2 μm oligomycin, ו 50 mM 2-DG.</li>
		<li>חזור על שלבים ה3.2.3 וה3.2.4.</li>
		<li>לחץ על המשך כדי להפעיל את התוכנית המתוארת בטבלה 3. לאחר סיום התוכנית, לאחזר את הנתונים ולנתח אותם באמצעות תוכנת שולחן העבודה Wave.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+origin%2C+development%2C+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+diet%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li>
<li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+change%3A+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li>
<li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125(2016).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li>
<li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+Mitochondria%2C+Metabolism%2C+and+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li>
<li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901(2015).</li>
<li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li>
<li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li>
<li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li>
<li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li>
<li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis%3A+therapeutic+targets+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility%3A+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li>
<li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li>
<li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism%3A+Culprits+or+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li>
<li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li>
<li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li>
<li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, אנו להדגים את הבידוד של כמות מקסימלית של האוכלוסייה הטהורה מורצק LSK הקיימא, כמו גם את המדידה של גליקוליזיס שלהם ואת הנשימה מיטוכונדריאלי עם מנתח השטף של מסחטות. באופן ספציפי, הפרוטוקול גובר על הנושאים הטכניים הבאים לשימוש ב-LSK HSPCs: i) התדר הנמוך של LSK HSPCs במוח עצם מוריין14, ii) פעילות מטבולית נמוכה בסיס של Lsk hspcs26, iii) שבריאת lsk hspcs27, ו-IV) ללא הדבקות של lsk hspcs לכלי התרבות15. בנוסף, יש לנו אופטימיזציה ש...

כיוון שתוחלת החיים של כדוריות הדם הבוגרות ביותר קצרה, הומאוסטזיס של דם נשענת על התחדשות עצמית והבחנה של אוכלוסייה ארוכת חיים אך נדירה של תאי גזע המטקיים (HSPCs)1. HSPCs הם השקט, אבל הם מהירים להתרבות ולעבור בידול על הגירוי כדי לקיים את הדרישות של מערכת הדם. כמו כל מדינה סלולרית HSPC דורש דרישה bioenergetic ייחודית, שינויים מטבולית הם מנהלי מפתח של החלטות הגורל HSPC. לכן, אובדן הפלסטיות המטבולית, על ידי שינוי שיווי המשקל בין שקט, התחדשות עצמית, והבידול של HSPCs, לעתים קרובות מוביל הפרעות myelo או lympho ההתרבות. יחד, ההבנה של רגולציה המטבולית של הפיתוח hspc הוא קריטי לחשוף מנגנונים בבסיס ממאירות המטקולוגי2,3,4,5.
נשימה מיטוכונדריאלי וגליקולזיס מייצרים ATP כדי לנהוג בתגובות תאיים ולייצר את אבני הבניין הדרושות לסינתזה מקרומולקולה. מאז HSPCs יש מסה נמוכה מיטוכונדריאלי בהשוואה לתאים הבדיל6 והם מקיימים השקט בגומחות במח ארוי העצם, hspcs מסתמכים בעיקר על גליקוליזיס. ההפעלה של HSPCs משפר את חילוף החומרים היטוכונדריאלי שמוביל לאובדן השקט והכניסה הבאה שלהם לתוך מחזור התא. הפלסטיות המטבולית הזאת של hspcs מאפשר תחזוקה של בריכת hspc לאורך חיי מבוגרים6,7,8,9,10,11,12. לכן, זה קריטי לחקור את פעילויות חילוף החומרים שלהם, כגון שיעור צריכת החמצן (OCR; אינדקס של זירחון חמצוני) ואת שיעור חמצה מסירה (ECAR; אינדקס של גליקוליזיס) כדי לנתח את ההפעלה HSPC ואת מצב הבריאות. הן OCR ו-ECAR ניתן למדוד בו זמנית, בזמן אמת, באמצעות מנתח השטף החילוץ. עם זאת, השיטה הנוכחית דורשת מספר גדול של תאים וממוטבת עבור תאים מחסיד13. מאז HSPCs לא ניתן לבודד בכמויות גדולות מעכברים14, דורשים מיון כדי להשיג אוכלוסייה טהורה, הם תאים לא חסיד15, ואין אפשרות להיות מתורבת לילה מבלי להימנע בידול16, זה היה קשה למדוד את ה-OCR ואת ecar של hspcs. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות ללוות וידאו מבוססי הדרכות על איך למדוד נשימה מטבולית ו גליקוליזיס של כמה אלפי העצם מוריין מחמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs.

<table><tbody><tr><td>0.01% (w/v) תמיסת פולי-L-ליזין</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>המשמשת לחיבור LSK</td></tr><tr><td>40 ומיקרו; מסננת תאים m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-363-547</td><td>משמש לסינון תאים לאחר ריסוק</td></tr> עצם <tr><td>אנטי ביוטין מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td>משמש להפרדת פשתן</td></tr><tr><td>ביוטין חולדה נגד עכבר CD45R/B220 שיבוט RA3-6B2</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td>משמש להפרדת פשתן</td></tr><tr><td>ביוטין חולדה נגד עכבר CD5 שיבוט 53-7.3</td><td>BD Biosciences</td><td>553019</td><td>משמש עבור Lin- הפרדה</td></tr><tr><td>ביוטין חולדה נגד עכבר CD8a שיבוט 53-6.7</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td>משמש להפרדת קו</td></tr><tr><td>ביוטין חולדה נגד עכבר Ly-6G ו-Ly-6C שיבוט RB6-8C5</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>משמש להפרדת פשתן</td></tr><tr><td>ביוטין חולדה אנטי-עכבר TER-119/תאי אריתרואיד שיבוט TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>משמש להפרדת קו</td></tr><tr><td>CD117 (c-Kit) נוגדן חד-שבטי (2B8), APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>משמש למיון LSK</td></tr><tr><td>Falcon 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>משמש בבידוד תאים</td></tr><tr><td>Falcon 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>משמש בבידוד תאים</td></tr><tr><td>Falcon צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-11A</td><td>משמש עבור מיון LSK</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Neuromics</td><td>FBS001-HI</td><td>משמש במאגר FACS</td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td>משמש להפרדת שיפוע ficoll</td></tr><tr><td>L-glutamine 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>משמש למדיית הבדיקה</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>משמש להפרדת קו</td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) חד-שבטי נוגדן (D7), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>משמש למיון LSK</td></tr><tr><td>גורם תאי גזע עכברי (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>250-03-100UG</td><td>משמש למדיית הבדיקה</td></tr><tr><td>תרומבופויטין עכברי (TPO)</td><td>PeproTech</td><td>315-14-100UG</td><td>משמש למדיית הבדיקה</td></tr><tr><td>PBS 1%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>משמש למאגר FACS</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין ( 10,000 U/mL)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>משמש למדיית הבדיקה</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>P1304MP</td><td>המשמש למיון LSK</td></tr><tr><td>סוסון ים XFp תרבית תאים Miniplate</td><td>Agilent Technologies</td><td>103025-100</td><td>משמש לזריעת LSK</td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td> <td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td>משמש למדיית הבדיקה</td></tr><tr><td>Streptavidin eFluor 450 מצומד</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>משמש למיון LSK</td></tr><tr><td>XF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>100840-000</td><td>משמש לאיזון מחסניות</td></tr><tr><td>XF מדיה</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>משמש לבדיקת המדיה</td></tr><tr><td>XFp Glycolysis ערכת בדיקת מאמץ</td><td>Agilent Technologies</td><td>103017100</td><td>תרופות לבדיקת מאמץ גליקוליזה</td></tr><tr><td>XFp מיטוכונדריה ערכת בדיקת מאמץ</td><td>Agilent Technologies</td><td>103010100</td><td>תרופות לבדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי</td></tr><tr><td>מחסנית חיישן XFp</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td>משמשת לגליקוליזה ובדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי</td></tr></tbody></table>

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

המטפאות בתאי הגזע (HSPCs) יש הפלסטיות המטבולית ברורים, אשר מאפשר להם מעבר מהמצב השקט שלהם למצב בידול כדי לקיים את הדרישות של היווצרות הדם. עם זאת, היה קשה לנתח את מצב חילוף החומרים (הנשמה מיטוכונדריאלי) של HSPCs בשל המספרים המוגבלים שלהם וחוסר פרוטוקולים ממוטבים עבור HSPCs שברירית, שברירי. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות למדוד נשימה מטבולית (שיעור צריכת החמצן; OCR) ו גליקוליזיס (שיעור חמצה מסחטות; ECAR) של מח עצם מורין-השושלתמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs. פרוטוקול זה מספק כמות גבוהה יותר של LSK HSPCs מ מח עצם murine, משפר את הכדאיות של HSPCs במהלך הדגירה, מאפשר ניתוח השטף החילוץ של שאינם חסיד HSPCs, ומספק פרוטוקולי הזרקה אופטימיזציה (ריכוז וזמן) עבור תרופות מיקוד זרחון חמצוני ומסלולים גליקוליטיות. שיטה זו מאפשרת חיזוי מעמד חילוף החומרים ובריאות HSPCs במהלך פיתוח דם ומחלות.

שיטת החילוץ שלנו אפשרה לנו לקצור עד ~ 80,000 LSK HSPCs לכל עכבר. הכדאיות והמספרים של תאים LSK שופרו עם השיטה שלנו, כי אנחנו: (1) מח עצם משולב מגפיים העליון והתחתון, עצמות הירך, עצם החזה, צלעות כלוב, ועמוד השדרה, (2) נמנע באמצעות מאגר לפירוק התאים האדומים כי היה להגדיל את מוות התאים והשיא, ( השתמשו בצפיפות ההפרדה הבינונית של תאים מונו-נוקלאובטים, ו (4) נמנע באמצעות מאגר טרום מקורר שהיה גורם לאובדן תאים מעניינים במקבצים.
למרות ניתוח השטף מעמיק המשמש באופן מסורתי עבור תאים חסיד, השימוש שלנו ציפוי...

מעבר ממצב השקט למצב בידול בשל הפלסטיות המטבולית שלהם במהלך היווצרות הדם. כאן, אנו מציגים שיטה ממוטבת למדידת נשימה מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס של HSPCs.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

שינויים מטבוליים בגזע hematopoietic ותאי אביהם מאפשרים להם לעבור מהמדינה ההפוגה שלהם למצב התברואה כדי לקיים את הדרישות של היווצרות הדם. שינוי בפלסטיות מטבולית של גזע hematopoietic ותאי צאצא מוביל להפרעות המטולוגיות. הפרוטוקול שלנו יעזור למדוד את הרגולציה המטבולית ואת הבריאות של גזע hematopoietic ותאי ההמה במהלך התפתחות הדם ומחלות.ניתוח של הנשימה המיטוכונדרית וגליקוליזה של גזע hematopoietic ותאי הצאצא קשה כפי שהם אוכלוסייה שברירית ונדירה. הפרוטוקול האופטימי שלנו מאפשר בידוד של כמות גבוהה יותר של תאי גזע וצאצאים מהמורין עצם, משפר את הכדאיות שלהם במהלך הדגירה, מקל על ניתוח שטף חוץ-תאי של HSPCs שאינם חסידים, ומספק פרמטרי הזרקה אופטימליים לתרופות המכוונות לזרחון חמצוני כמו גם מסלולים גליקוליטיים. כדי להתחיל בהליך זה, למלא את הבארים של צלחת השירות ואת התאים סביב הבארים עם מים סטריליים.להטביע את מחסנית החיישן לתוך לוח השירות לוודא כי החיישנים מכוסים לחלוטין על ידי מים. לאחר מכן מניחים את המחסנית שקועה בצלחת השירות באינקובטור שאינו CO2 ב 37 מעלות צלזיוס כדי להדגור בן לילה. בארונות biosafety מסוג II, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של פתרון מסחרי זמין של 0.1%PLL לכל באר של צלחת ההתמדה.מכסים את צלחת ההסגר עם המכסה המסופק בערכה ודורגים את הצלחת הסגורה בטמפרטורת החדר מתחת למכסה המנוע במשך שעה. לאחר מכן, השתמשו בהשראה סטרילית המבוססת על ואקום כדי להסיר את הפתרון העודף ולייבש את הצלחת מתחת למכסה המנוע. כדי לקצור תאי מח עצם מורין מונונוקלציה, להוסיף חמישה מיליליטר של בינוני שיפוע צפיפות לצינור חרוט 15 מיליליטר.לאט להוסיף חמישה מיליליטר של המתלה תא מח העצם לוודא כי התאים נשארים כשכבה מעל המדיום שיפוע צפיפות. צנטריפוגה ב 500 פעמים g ו בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לוודא כי הצנטריפוגה היא ההאצה הנמוכה ביותר האפשרית. לקצור את הממשק האמצעי של תאים mononucleated לתוך צינור טרי 15 מיליליטר.לאחר מכן לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של PBS 1X המכיל 2%FBS. צנטריפוגה ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים ב- 300 מיקרוליטרים של PBS 1X המכילים 2%FBS.לאחר מכן, aliquot 10 microliters של ההשעיה התא עבור שליטה לא מוכתמת או חד-צבעית בצינור FACS. כדי לקצור LSK HSPCs מתאים חד-גרעיניים של מח עצם מורין, הוסיפו 15 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים ביוטין ל-300 מיקרוליטרים של תאי מח עצם חד-גרעיניים. כדי לקצור LSK HSPCs מתאים חד-גרעיניים של מח עצם מורין, הוסיפו 15 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים ביוטין ל-300 מיקרוליטרים של תאי מח עצם חד-גרעיניים.מניחים את הצינורות בדלי קרח ממוקם על שייקר במקרר כדי דגירה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה במשך 30 דקות. לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של PBS 1X מקורר מראש המכיל 2%FBS לתאים. צנטריפוגה ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולת התא ב-400 מיקרוליטרים של 1X PBS המכילים 2%FBS. בקצרה מערבולת microbeads אנטי ביוטין לפני השימוש. מוסיפים 80 מיקרולייטרים של המיקרוביאדים לכל דגימה ומערבבים היטב.דגירה במשך 20 דקות נוספות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של PBS מקורר מראש המכיל 2%FBS לתאים. צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולת התא במיליליטר אחד של PBS המכיל 2%FBS. אחסן את מתלי התא בארבע מעלות צלזיוס בעת הגדרת יחידת ההפרדה המגנטית. מקם את העמודה בשדה מגנטי עבור מפריד מיון התאים בסיוע מגנטי בארבע מעלות צלזיוס.הכן את העמודה להפרדה מגנטית על ידי שטיפתה בשלושה מיליליטר של PBS 1X המכיל 2% FBS תחת זרימת כבידה בארבע מעלות צלזיוס. מוסיפים את מתלי התא לעמודה הרטובה מראש בארבע מעלות צלזיוס. אפשר לכל התאים לעבור דרך העמוד בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את הצלם בצינור חרוט 15 מיליליטר.לאחר מכן, לשטוף את העמוד עם שלושה מיליליטר של 1X PBS ו 2% FBS בארבע מעלות צלזיוס. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים. לאסוף את הזרימה דרך ולשמור אותו בארבע מעלות צלזיוס.צנטריפוגה הצינור חרוט המכיל את הזרימה דרך ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והעבר את התאים ב- 0.5 מיליליטר של 1X PBS עם 2%FBS והעבר את ההשעיה לצינור FACS. לאחר מכן הוסיפו 24 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים LSK לכל 10 מיליון תאים.מכסים את הצינור בנייר כסף ודגירה בחושך בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה במשך שעה. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של PBS 1X עם 2%FBS לצינור FACS. צנטריפוגה ב 500 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים המסומן בנוגדנים במיליליטר אחד של 1X PBS המכיל 2%FBS. רגע לפני המיון, מוסיפים מיקרוליטר אחד של מיליגרם אחד למיליליטר פרופידיום יודיד לתליית התא ולהשתמש מסננת 40 מיקרומטר כדי לסנן את התוכן של צינור FACS. ראשית, צנטריפוגה תאים LSK שנאספו ב 500 פעמים g ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים במדיה מלאה לריכוז סופי של לפחות 70,000 תאים לכל 40 מיקרוליטרים. זרעים 40 microliters של ההשעיה תא זה לתוך הבארים של צלחת מצופה 8 בארות הקפדה להשאיר את כל בארות הפינה ריקות. צנטריפוגה הצלחת ב 450 פעמים g ו בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת.השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי להבטיח שהתאים מחוברים לתחתית בארות. לאחר מכן, להוסיף 135 microliters של מדיה מלאה לתאים בכל באר להביא את הנפח הסופי של כל באר ל 175 microliters. הוסף 175 מיקרוליטרים של מדיה מלאה לשתי הפינות של הלוח כריק.דגירה התאים באינקובטור שאינו CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן הגדר תוכנית עבור המנתח כדי להוסיף תרופות לכל באר של הלוח כפי שמתואר בטבלה 2 וטבלה שלוש של פרוטוקול הטקסט. לבדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי, אחזר את מחסנית החיישן בצלחת השירות מהחמה כך שלכל באר יש ריכוז סופי של שני אוליגומיצין מיקרומולרי, 1.5 מיקרומולרי FCCP ו- 0.5 מיקרומולר של רוטנונה ואנטי מיצין A לפי הצורך.הסר את המכסה ממחסנית החיישן והצב אותו על מגש המכשיר. התחל את תהליך הכיול שייקח 20 דקות. לאחר השלמת הכיול, הסר את לוחית השירות והחליף אותה בצלחת ההתקלה המכילה את תאי LSK.לחץ על המשך כדי להפעיל את התוכנית הקודמת שנקבעה. לאחר השלמת התוכנית, אחזר את הנתונים ונתח אותם. במחקר זה, כמות מקסימלית של HSPCs LSK מורין קיימא מבודדים חילוף החומרים גליקוליזה המיטוכונדריאלי שלהם נמדד עם מנתח שטף חוץ תאיים.למרות ניתוח שטף חוץ תאי משמש באופן מסורתי עבור תאים חסידים, שיטה זו עושה LSK HSPCs דבק בארות מצופה PLL המאפשר מדידה של שטף חוץ תאי ובכך בריאות מטבולית של LSK HSPCs. על מנת למדוד את הנשימה המיטוכונדרית באמצעות קצב צריכת החמצן וגליקוליזה באמצעות שיעור החומציות החוץ תאית בתנאי בסיס ומתח, תרופות המפריעות לגליקוליזה ולנשימה מיטוכונדרית מוזרקים ברצף. כצפוי, הרמה הבסיסית של שיעור החומציות החוץ-תאית גבוהה יותר עבור LSK HSPCs בתרבות של גלוקוז ופירובט מדיה חיובית בהשוואה לאלה שתורבת במדיה שלילית.הזריקה עם גלוקוז לא לשנות את שיעור חומציות חוץ תאית עבור התאים מתורבתים בתקשורת חיובית, אבל זה הגביר את גליקוליזה של תאים במדיה שלילית. עם זאת, הרמה הבסיסית של תאים אלה עדיין נותרה נמוכה יותר בקבוצה החיובית. הזריקה עם אוליגומיצין הפעילה את הגליקוליסיס ברמתו המרבית בקבוצה החיובית, אך לא השפיעה על הקבוצה השלילית.ההזרקה עם אנלוגי הגלוקוז ב-2-DG החזירה את קצב החומציות החוץ-תאי לרמות שאינן גליקוליטיות. לבדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי, הזריקה של אוליגומיצין היפרפולרית הממברנה המיטוכונדרית מונעת שאיבת פרוטון יותר דרך קומפלקסים ETC ובכך להפחית את קצב הנשימה המיטוכונדרית. הזרקת FCCP דוחפת את שיעור צריכת החמצן למקסימום כאשר תאים מנסים לשחזר את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית.הזריקה עם שני מעכבי שרשרת הובלת אלקטרונים אחרים גורמת לנשימה המיטוכונדרית להפסיק לחלוטין ובכך קצב צריכת החמצן חזר לרמתו המינימלית. נא הימנע משימוש במאגר תותים של תא אדום לבידוד התא המונונוקליארי. אנו ממליצים על הפרדת מעבר צבע Ficoll כדי למנוע היווצרות גוש ולהפחית את אובדן LSK.באמצעות השיטה האופטימלית שלנו, אנו יכולים למדוד נשימה מיטוכונדרית וגליקוליזה של גזע hematopoietic נדיר ושברירי ותאי הצאצאים וחקר רמזים מטבוליים לווסת hematopoiesis נורמלי וממאאיר.

analysis-of-hematopoietic-stem-progenitor-cell-metabolism

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

המושבה להרכיב (CFC) assay התא assay במבחנה שבה אבות hematopoietic טופס מושבות בינוני חצי מוצק. שילוב של מורפולוגיה המושבה, מורפולוגיה התא cytometry זרימה משמשים כדי להעריך את היכולת של אבות להתרבות להבדיל לאורך שושלות hematopoietic שונים.

יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

פרוטוקול זה מספק הנחיות שלב אחר שלב להגדרת ניסויים תחרותיים בהשתלת מח עצם של עכבר כדי לחקור את תפקוד תאי הגזע/אב המטופויאטיים ללא טיהור מוקדם של תאי גזע על ידי מיון תאים.

השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic

אנו מתארים שיטה עבור שימוש בזרימה רב פרמטרים cy, לנסות לזהות מיני מיטוכונדריאלי מינים חמצן (ROS) ב מורטין גזע בריא המטבית ובתאי מחולל (HSPCs) ותאי לוקמיה ממודל העכבר של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מונע על ידי MLL-AF9.

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

משאבות xenoביוטיקה פעילים מאוד בתאי גזע ומחולל קדמון (HSPCs) ולגרום שחול TMRM, קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאל לצבוע פלורסנט. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במדויק פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי ב HSPCs על ידי TMRM בנוכחות Verapamil, מדכא משאבת משאבה.

שיפור הדיוק של הערכה להערכת הזרימה של הפוטנציאל לממברנה מיטוכונדריאלי בתאי המטפאות ובתאים באמצעות עיכוב של משאבות אפלוקס

כאן אנו מתארים שיטה אמינה למדוד מסה מיטוכונדריאלי פוטנציאל קרום בתאי גזע vivo המטפאות לשעבר תאים T.

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

השיטה המוצגת כאן מסכמת פרוטוקולים ממוטבים להערכת ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים שאינם דבקים ובתאי אב פרימיטיביים (HSPCs) תוך שימוש במנתח השטף החוץ-תאי כדי למדוד את קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) ואת קצב צריכת החמצן (OCR) של HSPCs בזמן אמת.

הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

מוצגת כאן טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה המאפשרת למדוד בו זמנית את מספר חלוקות התא, פנוטיפ תאי פני השטח וקרבה תאית. ניתן לבדוק תכונות אלה באופן סטטיסטי באמצעות מסגרת מבוססת תמורות.

הערכה סימולטנית של קרבה, מספר חלוקה ופנוטיפ באמצעות ציטומטריית זרימה עבור תאי גזע המטופויטיים ותאי אב

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידה מדויקת ואמינה של מטבוליטים בסוגי תאים נדירים. שיפורים טכניים, כולל נוזל מעטפת שונה למיון תאים ויצירת דגימות ריקות רלוונטיות, מאפשרים כימות מקיף של מטבוליטים עם קלט של 5000 תאים בלבד לדגימה.

מטבולומיקה ממוקדת על תאים ראשוניים נדירים

למדו פרוטוקול משופץ לבידוד וניתוח מטבוליזם של תאי גזע המטופאות ממח עצם מוריני. השיטה מאפשרת מדידה מדויקת של נשימת מיטוכונדריה וגליקוליזה בתאים עדינים ונדירים אלה.

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

גלה סרטונים נוספים