החיפוש אחר זנים מחיידקים לפיתוח בימתן ומוצרי פרוביוטיקה עבור המחקר והשימור של מטאפיאורגניזם

אנו יכולים לבודד ולהרכיב פרוביוטיקה שיכולה גם לקדם את בריאות האלמוגים וגם להקל על ההשפעה מזיהום וזה יכול לתרום להתמדה של שונית בעולם המשתנה. גישת הבידוד וההקרנה המתוארת יכולה לשמש לבחירת מיקרואורגניזמים המציגים פעילויות מטבוליות מרכזיות כגון השפלת מזהמים או מאפיינים מועילים אחרים לאורגניזמים ימיים כגון אלמוגים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי לבודד מיקרואורגניזמים מסוגלים להשפיל כל מזהמים.

בנוסף, מקורות אחרים של חומר ניתן להשתמש בדגימות סביבתיות אחרות כגון צמחים, אדמה, מים, כל דבר. ללמוד את הספרות ולנסות להתמקד זנים שיכולים להיות מועמדים טובים למטרה שלך. במידת האפשר, לכוון את שיטות הבידוד עבור זנים אלה ולהימנע פתוגנים ידועים.

ואם אתם שואפים להשתמש קונסורציום של חיידקים, חשוב מאוד גם לחקור תחילה אם חברי הקונסורציום יש פעילות עוינת אחד נגד השני. מכיוון שאלמוגים נמצאים בסכנת הכחדה גוברת, מתודולוגיה זו מתחילה להתחיל ברחבי העולם ויש צורך להפיץ ולתקנן את השיטה. כמו כמה חוקרי אלמוגים אין ניסיון עם מיקרוביולוגיה קונבנציונלית, לכן הם כבר לעתים קרובות מבקשים עצה על איך להמשיך עם גישה כזו.

כדי להתחיל, מכל אתר דגימה ממוקד, השתמש בבקבוקים סטריליים עם כובעי בורג כדי לאסוף 500 מיליליטר מים ב- triplicate. אם עיבוד מדגם קורה מאוחר יותר, לשמור את הבקבוקים בארבע מעלות צלזיוס. השתמש בזוג צבת סטרילי ומדפים כדי לחתוך שברי אלמוגים מאותו אתר דגימה של דגימות המים.

יש לשטוף את שבר האלמוגים לדוגמה באמצעות 20 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית של 3% או מי ים מלאכותיים כדי להיפטר מהחיידקים החופשיים המחוברים באופן רופף של מי הים. בעזרת מדפים, מניחים כל שבר אלמוג במיכל סטרילי עם מכסה בורג המכיל תמיסת מלח סטרילית. באמצעות מטלפים סטריליים וצבת, שוקלים חמישה גרם של שברי אלמוגים בצלחות פטרי סטריליות בסולם שקילה.

מעבירים את חמשת גרם דגימת האלמוגים למרגמה סטרילית ומעבירים אותה באמצעות עלה סטרילי. באמצעות מרית סטרילית, להעביר את המדגם macerated לבקבוק תרבות סטרילית המכיל 25 מיליליטר של 3% פתרון סטרילי נתרן כלורי ו 10 עד 15 חבילות זכוכית של 2.5 מילימטרים. השתמש 20 מיליליטר תמיסת מלח סטרילית לשטוף את המרגמה לתוך הצינור כדי לשחזר את הכמות המרבית של macerate.

כדי לנתק מיקרואורגניזמים מתאי אלמוגים שונים, יש לשמור את הבקבוקים תחת תסיסה מתמדת פי 150 גרם למשך 16 שעות בטמפרטורת המים של אתר הדגימה. כדי לבחור חיידקים, בצע תחילה דילול סדרתי של עד 10 עד לתשע השלילי בתמיסת מלח סטרילית לדגימות אלמוגים עד 10 לשש השליליות לדגימות מים. פיפטה מדלל למעלה ולמטה חמש פעמים לפני השלכת הקצה.

ואז מערבולת כל אחד. Vortex הדגימות במשך חמש שניות בכל פעם לפני ביצוע הדילול הסדרתי הבא. פיפטה 100 מיקרוליטרים של כל דילול על מנות פטרי המכיל 3% נתרן כלורי lysogeny מרק אגר בינוני צלחת אותם.

הדגירה את הצלחות במשך יום עד שלושה ימים בטמפרטורת היעד, למשל 26 מעלות צלזיוס. תבדוק את הצלחות פעם ביום. בחר ובודד את המושבות המציגות מורולוגיות צמיחה נפרדות על לוחות חדשים באמצעות טכניקת לוח הפס.

חזור על שלב זה פעמים רבות ככל הדרוש כדי לקבל מושבות טהורות גדל על הצלחות. אחסן את המבודדים בארבע מעלות צלזיוס או בגליצרול כמתואר בכתב היד. כדי לבצע בדיקת יכולת השפלה EE2, בחר מושבה אחת מהצלחות הטריות וחסן בשני מיליליטר של מדיום LB סטרילי בצינור.

במקרה זה הוא מלאי גליצרול, לקחת 10 microliters של מלאי חיידקי גליצרול פס על צלחות אגר LB. דגירה ב 24 עד 28 מעלות צלזיוס לילה יש מושבות בודדות גדל. מניחים את הצינור המכיל LB בינוני נוטה תחת תסיסה מתמדת ב 150 פעמים גרם ב 24 עד 28 מעלות צלזיוס לילה.

לאחר צמיחת חיידקים, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 8, 000 פעמים גרם במשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. השלך את העל-טבעי. כדי לשטוף את מרק LB הנותר, להוסיף שני מיליליטר של מים מלוחים כדי resuspend התאים.

חזור על הכביסה פעמיים כדי להבטיח כי אין עקבות של מקור פחמן. לחסן את התאים שטף מחדש במדיום תרבות בושנל האס המינימלי המכיל EE2 כמקור הפחמן היחיד. להעריך את צמיחת החיידקים על ידי צפיפות אופטית ב 600 ננומטר ואת המושבה שלנו להרכיב יחידות על LB אגר בינוני לאחר 16 עד 72 שעות של דגירה.

כדי להכין מדיה מינימלית המכילה שבר מסיס במים ושמן-מים שבר בלתי מסיס כמקור הפחמן היחיד, להוסיף 1-2% שמן גולמי ל 500 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים בבקבוק מסנן המכיל שסתום בתחתית. שמור את הבקבוק תחת תסיסה מתמדת ב 24 עד 28 מעלות צלזיוס ב 150 פעמים g במשך 48 שעות. לאחר מכן, מניחים את הבקבוק על משטח יציב ומחכים 10 עד 20 דקות כדי לאפשר לשבר המסיס והבלתי מסיס להיפרד.

לאחר מכן פתח את בקבוק המסנן התחתון כדי להעביר את שבר מסיסים מים שמן לבקבוק סטרילי חדש חוסך את שבר מסיסים מים שמן. ואז להכין שני בקבוקים של בושנל האס אגר בינוני מינימלי. תסגור את זה אוטומטית.

לשלב עם שבר מסיסים במים שמן כמקור הפחמן היחיד לעשות 500 מיליליטר של אגר בינוני. לעשות את אותו הדבר עם שבר מסיסים מים שמן ולהעביר כ 25 מיליליטר של כל מדיום על מנות פטרי בודדות. כדי לבודד חיידקים משפילי שמן, יש לעשות שימוש חוזר בדגימות מדוללות בעבר ובדגימות של 100 מיקרוליטרים של כל דילול על צלחות פטרי המכילות אגר מדיום וצלחת אותן.

זכור לשמור פקדים שליליים עבור הצלחות שלך. הדגירה את הכלים במשך יום עד שלושה ימים בטמפרטורת היעד ולחזור על הליכי הבידוד כבעבר. בפרוטוקול זה, מיקרואורגניזמים בודדו ממקורות מים שונים ונובינים אלמוגים המציגים מאפייני BMC מכניסים ומסוגלים להשפיל סוגים שונים של מזהמים.

באמצעות דגימות מים שנאספו במפעל לטיהור שפכים שהתקבל מהמרכז הניסויי לתברואה סביבתית של האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו, 33 זנים חיידקיים מסוגלים להשפיל EE2 היו מבודדים. בנוסף, באמצעות הטכניקה לבחירת חיידקים משפילים שמן, 20 זנים מסוגלים להשפיל הן שבר מסיסים מים שמן ושבר מסיסים מים שמן היו מבודדים. מאפייני BMC Putative הוקרן מיקרואורגניזמים, ביניהם זן המציג פעילות עוינת חזקה נגד פתוגן האלמוגים Vibrio כולרה lyticus, זנים מסוגלים להשפיל אוריאה, מפיק קטלאז טוב, מיקרואורגניזמים המציגים גנים מועילים פוטנציאליים נמצאו.

באמצעות חיסון ביולוגי וחיסון BMC, ניתן היה לחזות אלמוגים מהשפעות חשיפה לנפט. קונסורציום PBMC של ביו-חומר נפט שבודד מהאלמוגים חוסן על נובינים אלמוגים שנחשפו ל-1% שמן. זה הראה יכולת פוטוכימית שמורה יותר בהשוואה לבריאות האלמוגים ללא חיסון.

אל תשאירו דגימות בטמפרטורת החדר יותר מדי זמן. אחרת, הקהילה המיקרוביאלית עשויה להשתנות ומיקרואורגניזמים הקשורים למחלות עלולים להחרים אחרים. נפט גולמי הוא רעיל.

אנא הקפד להשתמש בציוד מגן אישי מתאים בעת עבודה עם זה או כל מזהם אחר שתחליט להשתמש בו. הטכניקה סללה דרך חדשנית בתחום שיקום האלמוגים והמדיה הביולוגית באוקיינוסים כדי למזער את ההשפעות הכלכליות, האקולוגיות והחברתיות הנגרמות על ידי שינוי גלובלי.