קביעת יחסי התאימות של העצמי והאינטר-(ב) משמש שילוב יד-האבקה, מיקרוסקופיה וניתוחים גנטיים
16 ביוני 2020
אנו מציגים מתודולוגיה להקמת הצרכים של האבקה של משמש (שזיף armeniaca L.) המשלבים את התאימות העצמית (in) של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית עם זיהוי של ה-S-גנוטיפ על ידי ניתוח PCR.
שיטה זו יכולה לסייע בקביעת דרישות האבקה במינים שונים ולבסס יחסי אי התאמה בין זנים. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שהיא מאפשרת להעריך מספר אי התאמה בתנאי מעבדה. הימנעות מבעיות רבות שעלולות להתרחש בניסויים המבוצעים בתנאי שדה.
זה מאפשר זיהוי יחד עם מסירות של מספר cultivar לקבוצות אי תאימות המתאימות. קביעת הקשר הבין-תאימותי בין זנים. גישה זו יכולה גם להיות שימושית כדי לקבוע את חוסר תאימות עצמית ואת יחסי אי תאימות בגידולים אחרים עץ פרי כמו דובדבן או שזיף.
התחל על ידי דגימת הפרחים בשדה. לאסוף את הפרחים בשלב בלון, אשר מתאים שלב 58 בסולם BBCH עבור משמש כדי למנוע האבקה קודמת. במעבדה, להסיר את anthers של הפרחים מניחים אותם על פיסת נייר להתייבש בטמפרטורת החדר.
לאחר 24 שעות, לנטר את גרגרי האבקה עם רשת בסדר 26 מילימטר. לסרס קבוצה של 30 פרחים באותו שלב התפתחותי בלון עבור כל האבקה עצמית צולבת ולה מניחים את האקדחים על קצף הפרחים במים 24 שעות לאחר סירוס ולהאביק את האקדחים באמצעות מברשת צבע עם אבקה מפרחים של אותו cultivar. להאביק קבוצה נוספת של אקדחים של כל cultivar עם אבקה מפרחים של מאביק תואם כפקד.
לאחר 72 שעות, להסיר את האקדחים מקצף הפרחים הרטובים ולתקן את האקדחים בתמצית תיקון של 3:1 אתנול לחומצה אצטית לפחות 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השלך את התיקון והוסף 75%אתנול, וודא שהדגימות שקועות לחלוטין בפתרון. דגימות ניתן לאחסן באתנול ב 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.
מפזרים את גרגרי האבקה של אותם זנים המשמשים להאבקות הבקרה במדיום נביטת אבקה מוצק ומתבוננים בהם מתחת למיקרוסקופ לאחר 24 שעות. הכינו את האקדחים למיקרוסקופיה על ידי שטיפתם 3 פעמים במים מזוקקים במשך שעה אחת לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, להשאיר אותם 5% נתרן סולפיט ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
ואז autoclave אותם בקילוגרם אחד סנטימטר בריבוע במשך 10 דקות נתרן סולפיט כדי לרכך את הרקמה. מניחים את האקדחים autoclaved מעל מגלשת זכוכית ולהשתמש אזמל כדי להסיר את trichomes סביב השחלה. ואז למחוץ את האקדח עם כיסוי.
החל טיפה של כחול אנילין על ההכנות כתם תצהירים קשוחים במהלך צמיחת צינור אבקה ולצפות צינורות אבקה לאורך הסגנון עם מיקרוסקופ על פי הוראות כתב היד. השתמש בערכה מסחרית כדי לחלץ דנ"א גנומי מעלים צעירים שנאספו באביב. לאחר מכן הגדר את PCR על-ידי שילוב רייגנטים בהתאם לכיווני כתב היד.
מערבולת התגובה לערבב ולהפיץ אותו בין בארות בצלחת PCR. הוסף מיקרוליטר אחד של דילול הדנ"א לכל באר והפעל את PCR באמצעות תוכנית התרמו-רכיבה על אופניים המתוארת בכתב היד. לאחר השלמת התגובה, לנתח את התוצאות באמצעות אלקטרופורזה נימי או אלקטרופורזה ג'ל אגרוז.
עבור אלקטרופורזה נימי להוסיף 1 microliter של המוצר PCR לתוך באר של צלחת הקורא יחד עם 1 טיפה של שמן מינרלי כדי למנוע אידוי מים. לאחר מכן הכינו את לוח ההפרדה על-ידי הוספת מאגר הפרדה. השתמש בתוכנה המסחרית עבור מנתח הגנים כדי ליצור צלחת מדגם חדשה ולשמור את שמות המדגם עבור כל בארות על הצלחת.
לאחר מכן בחר את שיטת הניתוח והכנס את שתי הלוחות לתוך מנתח הגנים. ממלאים את מערך נימי במים מזוקקים. לטעון את ג'ל פוליאקרילמיד ליניארי ולחץ לרוץ.
אם מנתחים את תוצאות ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל, הכינו ג'ל 1%agarose על ידי המסת אגרוז במאגר פועל אלקטרופורזה בהתאם לכיווני כתב היד. לאחר מכן מוסיפים 4 מיקרוליטרים של כתם חומצת גרעין לג'ל ומערבבים בעדינות. הגדר מגש ג'ל עם מסרק והאטה לשפוך את הג'ל באמצע דואג להימנע בועות.
השאירו את הג'ל בטמפרטורת החדר עד שהתמצקות מלאה, כ-30-45 דקות. ואז לשים בתא אלקטרופורזה. הסר את המסרק ולכסות אותו עם מאגר TAE 1x.
לטעון את הג'ל עם סולם ה-DNA ואחריו מוצרי PCR מעורבב עם טעינת צבע. לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב 90 וולט במשך 60-90 דקות עד קו הצבע הכחול הוא כ 75% של נתיב ג'ל. לאחר השלמת הריצה, דמיינו את הג'ל באמצעות טרנסילומינטור.
צמיחת צינור האבקה עצמית והאבקה צולבת נצפתה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לקבוע תאימות עצמית (ב) עבור כל cultivar. זנים נחשבו עצמית עולה בקנה אחד כאשר צמיחת צינור אבקה נעצר ותואם את עצמו כאשר לפחות צינור אבקה אחד הגיע לבסיס של הסגנון. 5 שילובי זוג פריימרים שימשו לזיהוי S-alleles באמצעות PCR בשילוב עם אלקטרופורזה נימי או ג'ל.
ראשית, ה-S-alleles זוהו על ידי הגברה של ה-S-RNase intron הראשון באמצעות זוג פריימר SRc. ואז האסטרון השני של RNase הוגבר עם שלושה סטים פריימר להבחין S6, S9, S1, ו S7 אללים. ואזורי משתנה V2 ו- HVB של הגן SFB הוגברו עם פריימר AprFBC8 להגדיר לזהות את אללים Sc ו- S8.
לאחר שזוהו ה- S-alleles, ניתן ליצור קבוצות שונות של אי-תאימות עם הגנוטיפים שאינם תואמים זה לזה. חשוב לזכור להשתמש בשליטה באלקטרופורזה נימית, שכן הם משתמשים במערכת ניתוח שברים אוטומטית שיכולה לדווח על הבדלים נוספים בגודל הקטע וגורמים לזיהוי אלל לא מדויק. השילוב של תצפיות מיקרוסקופיות וניתוח גנטי הביא לגישה שימושית מאוד כדי לקבוע אי התאמה עצמית של משמש ולבסס את יחסי אי התאמה בין זנים.
אי התאמה עצמית היא כיום הקישור למקומיים משמש. נראה כי קביעת הגורמים מעורבת. מאמץ עתידי צריך להיות ממוקד בהטמימות הגנטית של הכת הזו במ משמש.
השילוב של גישה תיעודית זו הוא תוצאה של מידע רב ערך עבור הבחירה המתאימה של זנים במטעים מסחריים גנוטיפים דפוס בתוכניות רבייה משמש. גישה דומה ניתן להשתמש בגידולים רב שנתיים עציים אחרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מתודולוגיה לקביעת דרישות ההאבקה של זני שמיש באמצעות הערכת תאיריות או אי-תאיריות להאבקה עצמית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וזיהוי הגנוטיפ של S באמצעות אנליזת PCR. גישה זו ניתנת ליישום גם עבור גידולי עצי פרי אחרים, ובכך היא תורמת להבנת מערכות היחסים של אי-תאיריות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- ביולוגיה של ההאבקה
- גנטיקה
רקע
- הבנת דרישות ההאבקה חיונית להפקת פירות.
- אי-תאימות עצמית משפיעה על קצב יישירת הפירות ועל היבול.
- ניסויי שטח מסורתיים עלולים להיות בעייתיים בשל משתנים סביבתיים.
- שיטות מעבדה יכולות לספק תנאים מבוקרים יותר לניתוח.
מטרת המחקר
- לקביעת דרישות ההאבקה עבור זני משמש.
- לזיהוי אי-תאימות עצמית ומערכות יחסי אי-תאימות.
- לספק שיטה מהימנה להערכת זנים במסגרת מעבדה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להערכת תאימות או אי-תאימות עצמית.
- ניתוח PCR לזיהוי גנוטיפי S.
- ניסויי מעבדה מבוקרים להערכת אי-תאימות.
- ניתוח השוואתי בין זנים שונים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של מספר קבוצות חוסר-תאימות בין זני משמש.
- ביסוס מערכות יחסים של תאימות הדדית.
- הדגמת ישימותה של השיטה לעצי פרי אחרים.
- הבנה משופרת של מנגנוני חוסר-תאימות עצמית.
מסקנות
- המתודולוגיה מספקת מסגרת חסונה למחקר של ההאבקה בשריש (משמשים).
- ניתן להתאימה לשימוש בגידולי פרי אחרים.
- התוצאות יכולות להנחות תוכניות Breeding ושיטות גידול.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
קביעת יחסי אי-התאמה עצמית והסגיתה (inter-incompatibility) בזני משמש מספקת נתונים קריטיים לאופטימיזציה של אסטרטגיות האבקה במטעים מסחריים ובתוכניות רבייה. גישה זו, המבוססת על מעבדה, מפחיתה את ההסתמכות על ניסויי שדה ומאפשרת הערכה חזויה של תאימות זנים תחת תנאים מבוקרים. המתודולוגיה תומכת בקבלת החלטות מותאמות סיכון בבחירת זנים ובזיהוי קווי הורים לשיפור עצי הפרי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנוני אי-תאימות עצמית גמטופיטית באמצעות תצפית ישירה על עצירה או צמיחה של צינור הפollen.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הערכת תאימות באמצעות מיקרוסקופיה ו-PCR, המפחיתה שונות הנובעת מגורמים סביבתיים.
- ערך ניבוי: תומך בזיהוי של S-alleles לצורך ניבוי יכולת הכלאה והכוונת בחירת ההורים בתהליכי בידוד ושיבוב.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: משלב מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ואנליזה גנטית ליצירת תהליך עבודה הניתן לשחזור עבור סריקת אי-התאמה.
- יכולת הרחבה: מאפשר הערכה של מספר זנים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של האבקה ידנית ואלקטרופורזה.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ניתן להתאים את המתודולוגיה למינים אחרים ממשפחת ה-Rosaceae, כגון דובדבן ושזיף, עבור יישום רחב יותר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין נתונים מולקולריים של הגנוטיפ S לבין התנהגות פנוטיפית של צינור הפollen לצורך תיקוף של קשרי אי-תאימות.
- תמיכה בbreeding: קובע קבוצות אי-תאימות כדי להנחות את בחירת המאבקים בתכנון המטעים ובתכנון ההכלאות.
- הפחתת סיכונים: מפחית כשלים במאמצי היברידיזציה על ידי סריקה מוקדמת של תאימות גנטית לפני השתילה בשדה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משלבת תצפית פנוטיפית ואנליזה גנוטיפית כדי לתמוך בשלבי הגילוי המוקדמים בביהור עצי פרי, החל מבדיקת השערות ועד לבחירת מועמדים מובילים.
- ביולוגיה של גילוי: בוחן את השערת התאימות/חוסר-תאימות העצמית על ידי מתאם בין פלואורסצנציה של צינור הפollen לבין פרופילי גנוטיפ של S.
- אנליטיקה: משתמש באלקטרופורזה נימיות או ג'ל לכימות מקטעי אלל S, מה שמאפשר גנוטיפיקה אובייקטיבית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין סממנים גנטיים לתוצאות תפקודיות בצמיחת צינור הפollen, ובכך תומך בתיקוף דמוי-סמן ביולוגי.
- שימוש חוזר ארגוני: פרוטוקול סטנדרטי המאפשר יישום בין-זנים ובין-מינים במסלולי הערכת חומר זרע גנטי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנה מכניסטית לגבי GSI על ידי קישור של וריאנטים של הגנים S-RNase ו-SFB לעיכוב של צינור הצמיחה של הפולן.
- ערך תפעולי: מאפשר בדיקת תאימות בספיקות גבוהות ללא תלות במגבלות עונתיות בשטח.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות (go/no-go) בתוכניות השבחה על ידי זיהוי זוגות תואמים בשלב מוקדם של התהליך.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על קידום מותגים מותאמי סיכונים עם אמינותהבייה מאושרת של ההאבקה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, טיפול באבקנים ובטכניקות של גנוטיפיקה מולקולרית.
- תלוי בגישה לתרמוציקלרים, למערכות אלקטרופורזה ולמיקרוסקופים פלואורסצנטיים עם סטים מתאימים של מסננים.
- מחייב הכנה סטנדרטית של דגימות של עלי גביע ואבקנים כדי להבטיח צביעה וויזואליזציה עקביות.
- יש להתחשב ביעילות של פריימרים ספציפיים לאלל בעת תכנון פאנלים של PCR לזיהוי S-genotype.
- מוגבל למינים בעלי פריימרים מאופיינים ל-S-locus; התאמה לגידולים חדשים דורשת תיקוף (validation) של הפריימרים.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Self- and Cross-Pollination in the Laboratory
2:14
Evaluating Pollen Viability through In Vitro Pollen Germination
2:30
Evaluating Self(in)compatibility by the Observation of Pollen Tube Growth
3:22
S-allele Identification
5:40
Results: Determination of Self-(in)compatibility and Identification of S-genotype in Apricot Cultivars
6:58
Conclusion
