התצוגה פפטיד בקטריאלי לבחירת הרומן הביוטילדירוג אנזימים

פרוטוקול זה מספק מערכת תצוגה חיידקית יעילה מאוד לבידוד של גרסאות חדשות של BirA המאפשר biotinylation ספציפי של חלבונים מקומיים. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא בוחרת גרסאות BirA באמצעות בחירת סטרפטבידין זיקה גבוהה. פעולה זו מבטיחה הסרת שיבוטים לא פעילים, ובכך יוצרת תהליך בחירה יעיל ביותר.

כדי להתחיל, בעורך פלסמיד, עצב את פריימר קדימה כך שיכלול את 30 הנוקלאוטידים האחרונים של המשלים ההפוך של רצף הקידוד של הפפטיד, והוסף את רצף הנוקלאוטידים הכריכה הפלסמידית לקצה חמשת הפריימים שלו. עצבו את פריימר ההפוך כך שיכלול את 30 הנוקלאוטידים הראשונים של המשלים ההפוך של רצף הקידוד של הפפטיד, והוסיפו את רצף הנוקלאוטידים הכריכה הפלסמידית לקצה חמשת הפריימים שלו. לאחר מכן, כדי להגדיר תגובת PCR של 20 מיקרוליטר, הוסף את ריאגנטים בצינור PCR דק קיר.

מעבירים את הצינור לעגלה תרמית, ולבצע PCR על פי כתב היד. לאחר מכן, הפעל חמישה מיקרוליטרים של תגובת PCR על ג'ל 1%agarose כדי לאשר את ההגברה של מוצר PCR שישה קילו-באז, ולהמשיך על פי כתב היד. עכשיו, כדי לסנתז את מגה-פרימרים מוטנטים עם BirA hexahistidine קדימה ו פריימרים הפוכים, בצינור PCR, להוסיף ננוגרם אחד של pBAD-BirA-eCPX עם רצף פפטיד היעד מוכן כתבנית.

הגדר 35 מחזורי PCR עם טמפרטורת חישול של 60 מעלות צלזיוס על פי הוראת היצרן. לאחר מכן, הפעל חמישה מיקרוליטרים של תגובת ההגברה על ג'ל 1%agarose כדי לאמת את ההגברה של מוצר PCR 984 בסיס. לטהר את המוצר PCR מ 45 microliters הנותרים של תגובת הגברה באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרית, ולהשתמש ספקטרופוטומטר לכמת את תשואת ה-DNA.

בצינור PCR דק קירות, מוסיפים את ריאגנטים מגה-פרימרים מוטנטים מוכנים כדי להכין את תגובת המדגם. מעבירים את תערובת התגובה למחזור תרמי, ולהפעיל את PCR על פי כתב היד. אחסן את תגובת ההגברה בארבע מעלות צלזיוס או על קרח.

לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של אנזים הגבלת Dpn1 ישירות לתגובת ההגברה, ומערבבים בעדינות. מסובבים את תערובת התגובות, ומטמיבים במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים, להפוך T7 אקספרס lysY / Iq מוכשר E.coli תאים בצינור עם שני microliters של תגובת Dpn1.

ראשית, לחסן 100 מיליליטר של LB המכיל 1%גלוקוז ו 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין עם מיליליטר אחד של ספריית BirA, ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד. לאחר מכן, לחסן חמישה מיליליטר של LB המכיל 1%גלוקוז ו 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין עם 100 microliters של תרבות הלילה. דגירה במשך שעתיים ו 30 דקות או עד התרבות מגיעה OD600 של כ 0.5.

לאחר מכן, לגרום ביטוי eCPX ו BirA עם 0.2% משקל לפי נפח L-arabinose, 100 מיקרומולר IPTG, ו 100 מיקרומולר ביוטין. לנער את התרבות ב 200 סל"ד במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התרבות במשך 10 דקות ב 5, 000 פעמים גרם, ולהסיר את supernatant.

תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של PBS קר כקרח, וצנטריפוגה ב 5, 000 פעמים g במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את התאים ב-400 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח, ואחסנו תאים על קרח. לאחר מכן, העבר 10 מיקרוליטרים של התאים המתווכים מחדש לתוך צינור 1.5 מיליליטר שכותרתו קלט.

חנות על קרח. לאחר מכן, לשטוף 20 microliters של חרוזים מגנטיים סטרפטבידין במיליליטר אחד של PBS קר כקרח בצינור, ולמקם את הצינור במפריד חלקיקים מגנטיים על הספסל במשך שתי דקות, ולהסיר בזהירות את supernatant. תוכלו להשתמש מחדש ב-20 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח, ולהעביר את פתרון חרוזים ל-390 המיקרוליטרים הקודמים של תאים מתווסלים.

מערבבים על ידי צינורות בעדינות. ואז, דגירה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מניחים עמוד עם כדורים פרומגנטיים במפריד חלקיקים מגנטיים, ולשטוף עם חמישה מיליליטר של PBS קר כקרח.

מעבירים את התאים ואת חרוזים מגנטיים סטרפטבידין מהצינור לתוך העמוד המחובר במפריד. לאחר מאגר העמודים ריק, לשטוף את העמוד עם נפח כולל של חמישה מיליליטר של PBS קר כקרח ב 500 microliters בכל פעם. לאחר מכן, הסר את העמודה מהמפריד והצב אותה בצינור של 1.5 מיליליטר.

פיפטה מיליליטר אחד של PBS קר כקרח על העמוד, ולהשתמש בוכנה כדי לחמק התאים המסווים מגנטית. לאחר מכן, מניחים את הצינור 1.5 מיליליטר לתוך מפריד ספסל, ולשטוף את התא שכותרתו מגנטית עם מיליליטר אחד של PBS קר כקרח. יש לעכל בעדינות את התאים המסווים מגנטית במיליליטר אחד של ה-PBS הקר כקרח.

העבר 10 מיקרוליטרים של ההתעברות לתוך צינור 1.5 מיליליטר שכותרתו פלט. לחסן 100 מיליליטר של LB המכיל 1%גלוקוז ו 100 מיקרוגרם לאמפיצילין מיליליטר עם תאים המסומנים מגנטית, ודגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד. למחרת, לשלב 10 מיליליטר של תרבות הלילה ב LB עם גליצרול לריכוז סופי של 15% ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי להפוך את מלאי המקפיא.

השתמש 100 microliters של תרבות הלילה לסיבוב הבא של הבחירה. עכשיו, להוסיף 990 microliters של PBS קר כקרח הן את דגימות הקלט והפלט, ולתייג את הצינורות קלט 10 למינוס שתיים ותפוקה 10 למינוס שתיים, בהתאמה. בצע דילול סדרתי פי 10 של שתי הדגימות ב- PBS קר כקרח עד לדילול סופי של 10 למינוס 10 בדגימה הקלט ו -10 למינוס ארבע בדגימה של הפלט.

צלחת 100 microliters של דגימות מקלט 10 כדי מינוס שש, קלט 10 למינוס שמונה, קלט 10 למינוס 10, פלט 10 למינוס שתיים, פלט 10 למינוס שלוש, ותפוקה 10 למינוס ארבע על לוחות LB-ampicillin בודדים, ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. בבוקר, לספור את מספר המושבות על הלוחות עם מושבות מופרדות בבירור. הכפל את ספירת המושבות עם גורם הדילול כדי להשיג את ספירת ריכוז החיידקים לכל 100 מיקרוליטרים.

בפרוטוקול זה, לאחר יצירת ספרייה שעברה מוטציה אקראית של גרסאות BirA, ביטוי BirA ו- eCPX-AP היה המושרה. חיידקים הודגרו עם זיקה בריאגנט, חיידקים לא מאוגדים הושלכו, וחיידקים נבחרים הוגברו. כתם מערבי של pBAD-BirA-eCPX-AP המביעים חיידקים הפיק רצועה 22 קילודלטון סטרפטבידין בתגובה עולה בקנה אחד עם המשקל המולקולרי של eCPX הן תרבויות לא מיושר ומושרה.

עם זאת, הם לא היו נוכחים בהקסהיסטידין BirA. ביוטינילציה משטח חזק eCPX-AP הבעת חיידקים גרמה צבירה על תוספת של חרוזים מגנטיים סטרפטבידין היווצרות גלולה בתחתית הצינור, אשר לא נצפתה עם eCPX עם ליסין לחיידק ביטוי מוטציה אלנין. ניתוח של המשקע מן ההתכווצות סטרפטבידין הציג ברור 22 קילודלטון סטרפטוודין-תגובה אנטי הקסהיסטידין הלהקה בדגימות מתרבויות eCPX-AP אבל לא eCPX-AP עם ליסין לתרבויות מוטציה אלנין.

באופן דומה, ספירת החיידקים הקשורים חמוזי סטרפטבידין היה גבוה באופן משמעותי eCPX-AP מאשר ליסינוס eCPX-AP לתרבויות מוטציה אלנין. הצעד החשוב ביותר הוא שטיפה מחמירה של חיידקים הקשורים סטרפטבידין. כביסה מחמירה מבטיחה כי רק חיידקים עם ביוטין המוצג על פני השטח נבחרים.

לאחר העשרה ברורה של חיידקים הוא ציין, שיבוטים מבודדים ניתן לשנות עוד יותר ובכך לפתח גרסאות BirA פעיל מאוד המאפשרים biotinylation ספציפי של חלבונים מקומיים.