סרטן השחלות האיתור באמצעות פוטואקוסטי זרימה Cy, לנסות

פרוטוקול מוצג כדי לזהות במחזור תאים סרטניים בשחלות ניצול מערכת מותאמת אישית של הזרמת פוטואקוסטית וממוקד חומצה פולית-הכתיר נחושת גופרתי.

האמצעים הנוכחיים לגילוי סרטן השחלות הקליניות אינם ספציפיים וחוסר נקודת טיפול בזיהוי תאים סרטניים במחזור. מערכת הזרימה הפוטית שלנו מאפשרת לבדוק דגימות של חולים עבור סמני סרטן השחלות הספציפיים בזרם הדם. הליך זה מספק טכנולוגיית פלטפורמה ייחודית עם שיפורים בטכניקות הנוכחיות מבחינת פשטות, עלות נמוכה, מגבלות מבטיחות של זיהוי ויכולת ליישם יישומים רחבים.

באמצעות עבודה זו, אנו שואפים לבנות את מערכת חלקיקים ממוקדת שלנו לסרטן השחלות כדי לבדוק דגימות חולה אקס ויוו עבור CTCs. מערכת PAFC רב-תכליתית זו מסוגלת להתרחב לשימוש קליני, ולבחן את נוכחותם של מגוון רחב של סמנים ביולוגיים בדם. יישור אופטי נכון הוא קריטי לזיהוי מטרות בתוך מערכת ציטומטריית זרימה פוטואקוסטית.

יתר על כן, כדי להבטיח צימוד אקוסטי תקין, ודא שאין בועות בין מגלשת הזכוכית המתמר. בשל האופי המותאם אישית של מערכת הזרימה ומרכיביה, הדמיה של השיטה מועילה לרבייה מדויקת. במכסה המנוע של אדים כימיים מאווררים, סנן כ-300 מיליליטר של מים שעברו דה-מיון באמצעות מסנן מיקרומטר סטרילי של 0.2.

הוסף 0.0134 גרם של נחושת כלוריד ו 100 מיליליטר של מים deionized לבקבוק תחתון עגול נקי 250 מיליליטר כדי ליצור פתרון כלוריד נחושת מילימולר אחד. מוסיפים 0.015 גרם של חומצה פולית לבקבוק ולהשתמש בר ערבוב מגנטי לערבב את הפתרון במשך כחמש דקות. ואז לערבב 0.024 גרם של נתרן סולפיד nonahydrate עם 100 microliters של מים deionized.

השתמש פיפטה 200 microliter לאט להוסיף פתרון זה לתערובת התגובה על פני משך של כ 10 שניות. תכסה את כלי התגובה. מניחים את הכלי באמבט שמן להגדיר 90 מעלות צלזיוס ולהמשיך לבחוש.

לאחר כ -15 דקות או כאשר אמבט השמן הגיע לטווח הטמפרטורה בין 85 ל 90 מעלות צלזיוס, לאפשר את התגובה להמשיך במשך שעה נוספת. כאשר התגובה הושלמה, להסיר את כלי התגובה מן אמבט השמן ולתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות לפני העברתו לאמבט קרח. לאחר התגובה מקורר, להתאים את ה- pH כ 10 באמצעות נתרן טוחן אחד הידרוקסיד.

מוסיפים את התערובת לעמודת צנטריפוגה של 30 קילודלטון ב-15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-3, 082 פעמים גרם במשך 15 דקות כדי לטהר את תערובת התגובה. ראשית, מערבבים את חומצה פולית כתרים נחושת גופרית חלקיקים בריכוז הנכון במדיה RPMI טרי. הוסף פתרון חלקיקי זה לכל באר של צלחת 24 באר מוכן המכיל SK-OV-3 תאים בריכוז של 400 מיקרוגרם למיליליטר.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שעתיים. לאחר מכן, נסה את התאים עם 0.5 מיליליטר של 0.25%trypsin ו- EDTA. כדי לנטרל את טריפסין, להוסיף לפחות מיליליטר אחד של חומצה פולית ללא RPMI 1640 מדיה צמיחה מלאה צנטריפוגה התאים ב 123 פעמים g במשך שש דקות.

כדי לשטוף את התאים, להסיר את supernatant, resuspend התאים בשני מיליליטר של PBS וצנטריפוגה ב 123 פעמים g במשך שש דקות. חזור על שלב שטיפה זה פעמיים כדי להסיר חלקיקים לא מאוגדים. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים עם 1-2 מיליליטר של פתרון 2%Tween ב- PBS.

לספור את התאים באמצעות המוציטומטר ו טריפאן כחול. לדלל את התאים בתב"ג של 2%Tween ב- PBS לריכוז שנבחר לגילוי. השתמש בקובץ STL התלת-ממדי שסופק כדי להדפיס תלת-ממד את מיכל הזרימה עם פלסטיק תרמופלסטי או PLA של ABS.

לאחר הדפסת המיכל, נקה והרכב את המערכת לשימוש. מניחים כיסויי זכוכית מעל מילימטר אחד על ידי חריץ שלושה מילימטר ואת החור סנטימטר אחד במערכת הזרימה בזהירות לאטום עם סיליקון כדי למנוע דליפה. לאחר מכן, התאימו את צינור נימי לצינורות נרפא הסיליקון.

הכנס את הצינורות לתא הזרימה דרך צד מיכל הזרימה כך שצינור נימי הזכוכית נמצא ישירות מעל וחזית חריץ שלושת המילימטרים והחור בסנטימטר אחד. לאטום את הצינורות עם סיליקון. ואז לחבר את המתמר לפולסר אולטרסאונד ומקלט.

להגביר את האות עם רווח דציבלים 59. חבר את הפלט של המסנן לאוסטילוסקופ רב תכליתי שניתן לשנות את תצורתו, המצויד במערך שערים מובנה הניתן לתיוכנת שדה. חבר את אחד הצינורות המגיעים מתא הזרימה לצומת T המחובר לשתי משאבות מזרק בכל ענף.

מלאו את אחת ממשאבות המזרק באוויר ואת המשאבה השנייה עם הדגימה שיש לנתח. הגדר את המשאבה המכילה אוויר לקצב זרימה של 40 מיקרוליטר לדקה והגדר את המשאבה המכילה את הדגימה לקצב זרימה של 20 מיקרוליטר לדקה. לאחר מכן, חבר את הצינור הנותר היוצא ממערכת הזרימה למיכל של 10%bleach כדי להיפטר מהתאים לאחר שהם יוצאים ממערכת הזרימה.

מניחים את החלק של צינור נימי קוורץ ביישור ישיר עם מתמר בתצוגת השדה של המיקרוסקופ כדי לאפשר מיקום זהיר של הסיב האופטי מעל המדגם, כך שהוא מאיר את כל רוחב הצינור. הקרין את הדגימה באמצעות סיב אופטי תקשור לייזר מצב מוצק שאוב דיודה הפועל באורך גל של 1, 053 ננומטר. השתמש במצלמה רכוב מיקרוסקופ כדי לתעד את הזרימה, הירי של הלייזר, ואת המעבר של דגימות דרך מערכת הזרימה.

במחקר זה, ציטומטריית זרימה פוטואקוסטית ואת סוכן מיקוד נחושת גופרתי ממוקד משמשים כדי לזהות תאים סרטניים במחזור השחלות. תמונת TEM טיפוסית של הננו-חלקיקים מסונתזים מראה כי הגודל הממוצע של חלקיק טיפוסי הוא כ 8.6 ננומטר. הקוטרים האופקיים והאנכיים של כל חלקיק נמדדים בניצב זה לזה וממוצעים עוד יותר.

הקוטר ההידרודינמי הממוצע לחלקיקים אלה הוא 73.6 ננומטר. ננו-חלקיקי נחושת גופרית יש עקומת ספיגה אופיינית המשתרעת לתוך אינפרא אדום הקרוב. יש חפץ קל סביב 850 ננומטר שנגרם על ידי החלפת לייזרים על ידי ספקטרופוטומטר.

תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות של תאים דגירה עם חלקיקים מתויגים פלואורסצנטי להראות כי ספיגת חלקיקים ניתן לדמיין על ידי נוכחות של פלואורסצנטיות על פני התא. תאים לא דגירה עם חלקיקים להראות שום אות פלואורסצנטי. נוכחותו של אות פלואורסצנטי זה מצביעה על ספיגה מוצלחת של החלקיקים ועל יכולתם להתגלות במערכת הזרימה.

דוגמאות לאותות טיפוסיים של רכישת נתונים מוצגות כאן. הנתונים הגולמיים מצביעים על הבדלי האות בין התאים המתויגים בננו-חלקיקים, PBS וננו-חלקיקי נחושת גופרית מצופים חומצה פולית. באמצעות תצוגת מעבדה מותאמת אישית ותוכנתי MATLAB, שחזורי תמונה עשויים מהפקדים החיוביים והשליליים בזמן אמת ורכישת פוסט בהתאמה.

מעטפות בודדות מומרות לאחר מכן לערכי פיקסלים ומוצגות כעמודות עצמאיות. הבדלים ברורים באות פוטואקוסטי מתרחשים בין PBS לבין חומצה פולית כתרים נחושת סולפיד חלקיקים בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר. במהלך הליך זה, זה קריטי כדי ליישר כראוי את מתמר אולטרסאונד, מיקרוסקופ וסיבים אופטיים בתוך מערכת cytometry זרימה פוטואקוסטיטי.

אשר את יישור המערכת על-ידי בדיקת פקדים חיוביים ושליליים. בשל הרבגוניות של טכניקות פילוח פוטואקוטיות והמגוון הרחב של יישומים אפשריים באמצעות PAFC, טכניקה זו סוללת את הדרך ליישומים קליניים ומחקריים חשובים מבחינה תרגום. כדי להבטיח יישום קליני, מחקרים נוספים צריכים להתמקד בבדיקות של דגימות המטופל וצמצום הצעדים הפרוצדורליים.

הסינתזה של הננו-חלקיקים צריכה להיכנס למכסה המנוע הכימי תוך שימוש בציוד המגן הנכון. קווי תאים אנושיים חייבים להיות מטופלים בהתאם להנחיות המוסד שלך. השימוש בלייזר דורש אימון בטיחות קרינה ו- PPE מתאים.

שימוש בלייזר ובדיקות פוטו-אסטיות צריכים להתבצע רק על ידי אנשי צוות מיומנים.