Name: סרטן השחלות האיתור באמצעות פוטואקוסטי זרימה Cy, לנסות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למדו לזהות תאי גידול שחלות מסתובבים בדם באמצעות מערכת זרימה פוטואקוסטית מותאמת אישית עם ננו-חלקיקי סולפיד נחושת. שיטה זו מציעה זיהוי ספציפי, עלות נמוכה ויישומים קליניים רחבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר את מדלן האוול על עזרתה עם סינתזה, מתיו החזה על עזרתו עיצוב מערכת הזרימה, ואיתן מרשהכל לקבלת סיוע עם SolidWorks.

1. סינתזה הננו-חלקיק והפונקציונליזציה
הערה: סינתזה של ה-FA-CuS NPs מושגת באמצעות שיטת סינתזה של סיר אחד המותאמת לפרוטוקול21שפורסם בעבר. התראה: כל הסינתזה אמורה להופיע במיזוג כימי מאוורר.
<ol><li>לפני סינתזה, לסנן כ 300 mL של מים מוכי (DI) למרות 0.2 יקרומטר מסנן סטרילי.</li>
	<li>נקה בקבוקון זכוכית 250 mL עם פתרון לניקוי ולשטוף עם מים DI. הוסף 0.0134 g של CuCl2 לתוך 100 mL של מים די כדי ליצור פתרון 1 מ"מ.</li>
	<li>הוסף 0.015 גרם של חומצה פולית (FA) לפתרון CuCl2 ומערבבים עבור ~ 5 דקות באמצעות בר מגנטי מעורר.</li>
	<li>הוסף Na2S · 9h2O (0.024 g ב 100 μl די מים) מעל כ 10 S לתערובת התגובה ניצול של 200 μl. הערה: בעת הוספת Na2S · 9h2O, הפתרון ישתנה צבע מצהוב בהיר לחום כהה.</li>
	<li>מניחים את התגובה ואת המקום באמבט שמן, שנקבע עד 90 ° c, וממשיכים לערבב עם בר מגנטי מעורר. לאחר כ -15 דקות, או כאשר אמבטיית השמן הגיעה ל-85-90 ° c, אפשר להמשיך בתגובה לשעה נוספת. התערובת שלך צריכה להפוך בהדרגה לצבע ירוק כהה. הערה: הקפד לפרוק את המערכת תוך חימום תערובת התגובה כדי למנוע הצטברות לחץ.</li>
	<li>הסירו את כלי התגובה ממרחץ השמן והצוננים לזמן קצר בטמפרטורת החדר במשך כ -10 עד 15 דקות לפני המעבר לאמבט קרח.</li>
	<li>לאחר תערובת התגובה התקרר מתחת 20 ° צ', להתאים את ה-pH כדי 10 ניצול של 1M NaOH לפזר את שארית חומצה פולית לתוך הפתרון.</li>
	<li>לטהר את תערובת התגובה פא-קוס באמצעות 30 kDa צנטריפוגה טור. הוסף פתרון ב -15 אצוות mL לעמודה ולצנטריפוגה ב 3,082 x g עבור 15 דקות.</li>
	<li>לאחר כל תערובת התגובה היה מרוכז, לשלב מחדש את השברים מרוכז לשטוף 4x עם 15 מ ל של pH 10 NaOH ב 30 kDa צנטריפוגה טור.</li>
	<li>עבור מדידות המסה, לקחת 1/3 של הפתרון (~ 66 μL) ולפצל לתוך שלושה מבחנות זכוכית. יבש בתנור ואקום לילה בשעה 40 מעלות צלזיוס תחת ואקום של ~ 27 Mhg.</li>
	<li>מפזר את 2/3 האחרים של הפתרון המרוכז לתוך 250 μL של PBS ולאחסן ב 4 ° צ' עד שימוש נוסף.</li>
	<li>לפני ניצול הפא-קוס, sonicate אותם 30 דקות באמבטיה sonicator בסביבה גבוהה.</li>
</ol>2. אפיון NP
<ol><li>לבצע פיזור אור דינמי (DLS) להוסיף 10 μL של מרוכז פא-קוס NPS בתמיסה PBS משלב 1.1.14 עד 2 מ ל של מים DI. לפני אפיון על ידי DLS, sonicate את החלקיקים עבור 30 דקות באמבטיה sonicator על הגדרה גבוהה ולסנן דרך מסנן 0.2 יקרומטר סטרילי להסיר אבק שיורית.</li>
	<li>ביצוע שידור אלקטרון מיקרוסקופ (TEM): להוסיף 10 μL של מרוכז פא-קוס NPS בפתרון PBS לפיסת נייר שעווה. היפוך רשת הנחושת מצופה formvar בחלק העליון של ה-droplet ולתת לשבת 2 דקות. גע בקצה של רשת מצופה formvar כדי פיסת נייר סינון כדי להסיר את עודפי הנוזלים. . תן לאוויר להתייבש תמונה של רשת הנחושת ניצול מיקרוסקופ אלקטרונים במתח מואץ של 80 kV. הערה: תוצאות טיפוסיות מאפיון הפא-קוס מוצגות באיור 1.</li>
</ol>3. תרבית תאים
<ol><li>פרוטוקול זה מנצל את התאים סקוב-3. אלא אם צוין אחרת, התרבות סקוב-3 תאים במדיום 5A של מקוי בתוספת עם 10% FBS, 100 U/mL פניצילין, ו 100 μg/mL סטרפטומיצין, ולתחזק ב 37 ° c בתוך מחולל לחות 5% CO2 חממה.</li>
</ol>4. תיוג פלורסנט של פא-קוס NPS למיקרוסקופיה
<ol><li>הוסף טקסס-אדום-X סוכות, אסתר (0.2 mg מומס ב DMSO בריכוז של 10 מ"ג/mL) לפתרון המכיל 2 מ"ג של פא-CuS בתוך 1 מ ל של 0.1 M נחקו3 (pH ~ 9) מאגר.</li>
	<li>מערבבים את תערובת התגובה באמצעות פס מגנטי במשך 1 h, הרחק מן האור בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לרכז את תערובת התגובה בעמודה 4 mL 30 kDa MWCO צנטריפוגה על ידי ספינינג ב 4,000 x g עבור 10 דקות.</li>
	<li>לשטוף את הפתרון מרוכז 3x עם 4 מ ל של 0.1 M נחקו3 מאגר (pH ~ 9) בעמודה צנטריפוגה. לאחר מכן, לשטוף את הפתרון מרוכז עם 4 מ ל של מים DI 3x או עד רק כמות מעקב של זריחה נשאר גלוי הפרח דרך על ידי UV-VIS.</li>
</ol>5. פא-CuS לספיגת השחלות על ידי סרטן שחלות תאים
<ol><li>לפני הדגירה עם פא-קוס NPs, דגירה סקוב-3 תאים בבקבוקון T75 עם 8-15 מ ל של מדיה פולית-חומצה-1640 חינם RPMI עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין עבור לפחות 24 h.</li>
	<li>תאי הזרע ב 0.5 מ ל של חומצה פולית חינם RPMI-1640 מדיה צמיחה מלאה בצפיפות של 0.1 x 106 תאים/mL לתוך הצלחת 24 הבאר.</li>
	<li>ביום שלמחרת, התאים מודניים עם 400 μg/mL פא-CuS ב-0.5 mL של חומצה פולית-RPMI חינם-1640 להשלים את מדיית הצמיחה עבור 2 h.</li>
	<li>בעקבות דגירה זו, טריזיסיזציה של התאים עם 0.5 mL של 0.25% טריפסין עם EDTA. הוסף לפחות 1 מ ל של RPMI-חומצה פולית-1640 להשלים מדיית הצמיחה כדי לנטרל את טריפסין, ו צנטריפוגה את התאים ב 123 x g עבור 6 דקות.</li>
	<li>הסר את הסופרנטאנט, השהה מחדש את התאים ב-2 מ ל של PBS, וצנטריפוגה ב 123 x g עבור 6 דקות. בצע שטיפת זה שלב 2x כדי להסיר את כל NPs לא מאוגד.</li>
	<li>השהה את התאים ב-1-2 מ ל של PBS עם 2% רצף הפתרון.</li>
	<li>לספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר וטריקון כחול. עוד לדלל תאים אם ספירת תאים גבוהים מדי. לדלל תאים ב-PBS עם 2% רצף הריכוז הנבחר לאיתור.</li>
	<li>התאים עכשיו מוכנים להיות מנותח על ידי מערכת ה-פכ.</li>
</ol>6. מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית של ספיגת פא-קוס של NPS
<ol><li>חזור על הצעדים המפורטים בשלב 5.1 והמשך בפרוטוקול שלהלן לצורך מיקרוסקופ.</li>
	<li>תאי הזרע בצפיפות של 0.1 x 106 תאים/ml ב 0.5 mL של פולית-חומצה חינם RPMI-1640 להשלים את מדיית הצמיחה על שמיכות זכוכית בצלחת 24 הבאר.</li>
	<li>ביום למחרת, מודתיאת התאים עם פלואור מתויג פא-CuS NPs בטרילקאט, בריכוזים של 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, ו400 μg/mL בשנת 0.5 mL של חומצה פולית ללא RPMI-1640 להשלים מדיה צמיחה.</li>
	<li>מודב את התאים עם NPs עבור 2 h בחממה 37 ° c</li>
	<li>בעקבות תקופת הדגירה הזו, לשטוף את התאים 3x עם PBS. הערה: עבור כל שלבי הכביסה, הוסף בזהירות את הפתרון בצד צלחת הבאר כדי לא להפריע לתאים. לאחר בנוסף, להטות בזהירות את הצלחת ולסגת את הפתרון מהצד של הבאר.</li>
	<li>דגירה את התאים עם 0.5 mL של 3.7% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב-PBS עבור 15 דקות ולהעביר את שמיכות זכוכית לצלחת חדשה 24 היטב. התראה: המטה הוא מסרטן ידוע. עשו כל קיבעון בתוך מכסה כימי מאוורר וללבוש ציוד הגנה אישי מתאים.</li>
	<li>מודטה את התאים בתמיסה של 3.7% בתחתית עם 0.1% טריטון-X ב PBS עבור 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 0.5 mL של PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד ולהעביר את שמיכות לצלחת חדשה.</li>
	<li>דגירה את התאים עם 0.5 mL של פתרון PBS המכיל DAPI (20 μL/mL של 0.5 mg/mL מלאי פתרון משמש עבור כתמים) עבור 5 דקות, הרחק מן האור.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם PBS 3x.</li>
	<li>בעקבות השטיפה הסופית של ה-PBS, יש לטעון את הכיסויים בשקופיות עם הרכבה בינונית.</li>
	<li>התאים מוכנים כעת להיות. בתמונה על-ידי מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית איור 2 מציג דוגמה לאפיון תאים טיפוסי של מיקרוסקופ פלואורסצנטית.</li>
</ol>7. ארכיטקטורת מערכת זרימה
<ol><li>בניית תאי זרימה הערה: קובץ SolidWorks של מיכל זרימה תלת-ממדי מודפס ניתן למצוא בחומרים המשלימים.<ol>
<li>באמצעות הקובץ המסופק SolidWorks, 3D להדפיס את המיכל הזרימה באמצעות שימוש בחומרים תרמופלסטיים או בפלסטיק PLA. ממדים מסופקים להלן אם SolidWorks אינה זמינה. איור 3מראה ייצוג של מודל זה. הגוף של טנק הזרימה הוא 2.5 ס"מ x 1.5 ס"מ x 7.5 ס"מ. הקצוות הרחוקים של מיכל הזרימה כוללים חורים כ 5 מ"מ קוטר כדי לאפשר כניסת אבובים המכיל את צינור נימי. הערה: למיכל הזרימה יש חור בגודל 1 ס מ, בניצב לכיוון צינור הקפילר, למיקום מתמר האולטרסאונד. שחול גלילי עם אותו קוטר פנימי כמו החור מרחיב 6 מ"מ לתוך המיכל. עבור הדמיה בזמן אמת, מיכל הזרימה יש חריץ 1 מ"מ x 3 מ"מ ישירות מתחת לצינור נימי.</li>
		<li>לאחר הדפסת מיכל זרימה תלת-ממדי, נקו והרכיבו את המערכת לשימוש.</li>
		<li>המקום שמיכות זכוכית על החריץ 1 מ"מ x 3 מ"מ ואת החור 1 ס"מ במערכת הזרימה.</li>
		<li>חותם בזהירות עם סיליקון כדי למנוע דליפה.</li>
		<li>להתאים את צינור נימי לתוך הסיליקון לרפא צינורות. הכנס את הצינורות לתוך תא הזרימה למרות הצד של מיכל הזרימה כגון צינור נימי זכוכית הוא ישירות מעל ולפני החריץ 3 מ"מ והחור 1 ס מ.</li>
		<li>חותם את אבובים באמצעות סיליקון כדי למנוע דליפה.</li>
	</ol></li>
	<li>התקנת מערכת זרימה אקוסטית הערה: איור 3B ואיור 3ג הצג דוגמה לארכיטקטורת מערכת הזרימה.<ol>
<li>חבר את ההמתמר לאולטרסאונד/מקלט. הגבר את האות עם רווח 59 dB.</li>
		<li>חבר את הפלט של המסנן לטווח הרחב הניתן להגדרה מחדש המצויד במערך שער מובנה לתיכנות בשדה.</li>
		<li>חברו את אחד הצינורות המגיעים מחדר הזרימה לצומת T, המחובר לשני משאבות מזרק בכל ענף.</li>
		<li>למלא את אחד משאבות מזרק באוויר ואת המשאבה השנייה עם המדגם להיות מנותח. הגדר את המשאבה המכילה אוויר לקצב הזרימה של 40 μL/min והמשאבה המכילה את המדגם לקצב זרימה של 20 μL/min. זרימת שני השלבים וכתוצאה מכך יפיק כרכים לדוגמה של 1 μL. בקצב זרימה זה, המערכת תבחן כ-6.4 דגימות לדקה. הערה: כדי לשמור על התפלגות עקבית של תאים, מערבולת קלות כל דגימה מיד לפני שנבדק. בנוסף, לסובב את המזרק כל כמה דקות כדי למנוע את התאים להתיישב בפתרון.</li>
		<li>חבר את הצינורית הנותרת ליציאה ממערכת הזרימה למכל עם 10% אקונומיקה, כדי להיפטר מתאים לאחר יציאה ממערכת הזרימה. הערה: לפני ניצול מערכת הזרימה, בדוק אם יש דליפות, כפי שאלה יכולים להשפיע על הזרימה. תאים חייבים להיות כלולים במערכת סגורה כדי לשמור על בטיחות ביולוגית במהלך ההליך.</li>
		<li>העיצוב של המיכל המודפס תלת-ממד מאפשר יישור עקבי לשחזור בין אור מתמר לייזר עם כיול מינימלי. כאשר ממוקם נכון בתוך המיכל מותאם אישית, צינור נימי הקוורץ מבטיח כי מתמר ולייזר מיושרים ישירות.</li>
		<li>מניחים את הקטע של צינור נימי הקוורץ ביישור ישיר עם התמר, בתחום התצוגה של המיקרוסקופ, ומאפשר מיקום קפדני של הסיבים האופטיים מעל המדגם, כך שהוא מאיר את כל רוחב הצינור.</li>
		<li>הצגת המדגם באמצעות סיבים אופטיים תקשור מוצק דיודה שאוב לייזר המצב הפעלה באורך גל של 1,053 ננומטר. האירוע אור לייזר על המדגם ואת מתמר השתמשו כדי למדוד את האפקט פוטואקוסטי הם לא ממוקדים.</li>
		<li>האנרגיה של האירוע לייזר על המדגם הוא כ 8 mJ ו 10 הרץ שיעור לייזר מספיק כדי להאיר כל מדגם פעמים מרובות כפי שהוא עובר דרך המערכת.</li>
		<li>מניחים את מערכת הזרימה על גבי מיקרוסקופ הפוך ולהבטיח הן את הדופק לייזר ואת הנתיב של המדגם גלויים כמו המדגם עובר למרות מערכת הזרימה. זרימת שיא באמצעות מצלמה רכוב מיקרוסקופ.</li>
		<li>הקלט את רכישות האולטרסאונד באמצעות תוכנת רכישת נתונים (ראה טבלת חומרים). ההדק אולטרסאונד ולייזר פעמו באמצעות FPGA. לנצל את ה-PBS עם 2% רצף, ואת פא-CuS NPs בריכוז של 100 μg/mL ב-PBS 2% יצירת רצף, כפקדים שליליים חיוביים, בהתאמה.</li>
		<li>ניצול המצלמה רכוב מיקרוסקופ, להקליט הן את הירי של הלייזר ואת המעבר של דגימות למרות מערכת הזרימה. הקלטות אלה יהיה מנוצל כדי לתאם את האות האקוסטי שהוקלט על ידי מתמר עם ירי של הלייזר. כמו הדגימות לעבור מול הירי של הלייזר, האות יכול להיות מתואם את האות פוטואקוסטי המתקבל לניתוח. בקצב דגימה של 10 הרץ, הלייזר יאיר את כל התקע מספר פעמים.</li>
	</ol></li>
</ol>8. לאחר העיבוד
<ol><li>עבור כל רכישת אותות, s (t), חשב את ההמרה של הילברט, H [s (t)], כדי ליצור אות אנליטי.</li>
	<li>צור מעטפה מורכבת, se(t), על-ידי חישוב סדר הגודל של האות <img src="/files/ftp_upload/60279/60279eq1.jpg"> האנליטי, כגון זה ושילוב המעטפה כדי למדוד את האות הכולל הנובע מכל רכישה. השווה את האותות מכל קבוצת בדיקה (כלומר, PBS, תאים מתויגים, פא-קוס NPs, תאים בלבד) ניצול מבחן t ב-R בתוכנה סטטיסטית. אותות פוטואקוסטיים גולמיים ושינויי הילברט שלהם מוצגים באיור 4.</li>
	<li>לשחזור תמונה, לנרמל את המעטפה המורכבת בהתבסס על השיא המקסימלי לאורך כל ההפעלה. אם השוואת סידרת רצפים, נרמל את המעטפה המורכבת באמצעות השיא המקסימלי לאורך כל הסידרה. לאחר הנורמליזציה, המירו כל אחת מהרכישות לסדרה של ערכי פיקסלים. מייצגים כל סדרה של ערכי פיקסלים כעמודה בשחזור התמונה. השחזורים הנציגים של ה-PBS והאותות של הפא-קוס מוצגים באיור 5, כאשר שתי התמונות היו מנורמלות באמצעות השיא המקסימלי לאורך שני הריצות.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+global+cancer+incidence+and+mortality+in+2018%3A+GLOBOCAN+sources+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods.</a> International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer+and+their+clinical+value+as+a+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis.</a> PLoS One. 10 (6), e0130873(2015).</li>
<li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+value+of+HE4%2B+circulating+tumor+cells+in+patients+with+suspicious+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer.</a> Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).</li>
<li>Lianidou, E., Hoon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((9+-+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Principles+and+Applications+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA.</a> Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC cancer. 12 (1), 178(2012).</li>
<li>Galanzha, E., Zharov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+detection+and+capture+by+photoacoustic+flow+cytometry+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo.</a> Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).</li>
<li>Nedosekin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+noninvasive+analysis+of+graphene+nanomaterial+pharmacokinetics+using+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).</li>
<li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry%3A+principle+and+application+for+real-time+detection+of+circulating+single+nanoparticles%2C+pathogens%2C+and+contrast+dyes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optic%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo.</a> Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).</li>
<li>Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic micropipette.</a> Applied Physics Letters. 113 (26), 264103(2018).</li>
<li>Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrauterine+photoacoustic+and+ultrasound+imaging+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe.</a> Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).</li>
<li>Galanzha, E. I., Zharov, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry.</a> Methods. 57 (3), 280-296 (2012).</li>
<li>O'Brien, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+of+circulating+tumor+cells+using+photoacoustic+flowmetry+and+two+phase+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221(2012).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry+for+single+sickle+cell+detection+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Cellular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo.</a> Analytical Cellular Pathology. 2016, 11(2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment%2C+photoacoustic+diagnosis%2C+and+photothermal+purging+of+infected+blood+using+multifunctional+gold+and+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles.</a> PLoS One. 7 (9), e45557(2012).</li>
<li>Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indocyanine+green-loaded+photoacoustic+nanodroplets%3A+dual+contrast+nanoconstructs+for+enhanced+photoacoustic+and+ultrasound+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging.</a> ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).</li>
<li>Kim, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+plasmonic+assemblies+of+gold+nanoparticles+with+multimodal+function+for+targeted+cancer+theragnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17327(2017).</li>
<li>Ku, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+sulfide+nanoparticles+as+a+new+class+of+photoacoustic+contrast+agent+for+deep+tissue+imaging+at+1064+nm%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm.</a> ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).</li>
<li>Parker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+expression+in+carcinomas+and+normal+tissues+determined+by+a+quantitative+radioligand+binding+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay.</a> Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).</li>
<li>Cheung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+folate+receptor+alpha+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Targeting folate receptor alpha for cancer treatment.</a> Oncotarget. 7 (32), 52553(2016).</li>
<li>Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theranostic+CuS+nanoparticles+targeting+folate+receptors+for+PET+image-guided+photothermal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy.</a> Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).</li>
<li>Lusk, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+Flow+System+for+the+Detection+of+Ovarian+Circulating+Tumor+Cells+Utilizing+Copper+Sulfide+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+circulating+tumor+cells+%28CTCs%29+captured+by+microfluidic+device+in+patients+with+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).</li>
<li>Blassl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+single+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer-Establishment+of+a+multi-marker+gene+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel.</a> Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+living+circulating+tumor+cells+in+patients+by+immunomagnetic+negative+enrichment+coupled+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry.</a> Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).</li>
<li>Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+capture+of+breast+cancer+cells+with+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007(2016).</li>
<li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+monitoring+of+circulating+single+cancer+cells+and+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents.</a> Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liquid+biopsy+using+Cytophone+platform+for+photoacoustic+detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma.</a> Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857(2019).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+early+malaria+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis.</a> Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment+and+multiplex+photoacoustic+detection+of+circulating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 855(2009).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול זה הוא שיטה ישירה לזיהוי של CTCs השחלות ניצול פג ו סוכן ניגודיות ממוקד של CuS. שיטות רבות נחקרו לאיתור ctcs השחלות, כולל התקנים microflu, RT-PCR, ו זרם הזריחהcy, 22,24,25. טווח זה במורכבות, עלות ודיוק, הגבלת האפקטיביות שלהם בהגדרות הקליניות. פגלה מציג מספר יתרונות על פני שיטות מסורתיות אלה לאיתור CTCs, כולל היכולת לזהות CTCs בתוך דגימות החולה, ואת קלות התרגום שלה ביישומים vivo. פלק הוכח לזהות במדויק את ctcs ב מבחנה ובvi...

סרטן השחלות הוא אחד ממאירות גינקולוגית הקטלנית והביא המשוער 184,800 מקרי מוות ברחבי העולם ב 20181. מחקרים מרובים הראו את הקורלציה בין התקדמות סרטן השחלות (כלומר, גרורות) ונוכחות של ctcs2,3,4. השיטה הנפוצה ביותר לאיתור ובידוד של CTCs מנצל את מערכת Cellsearch, אשר מטרות קולטן EpCam5. ביטוי EpCam, עם זאת, הוא מוסדר באפיתל למעבר mesenchymal, אשר היה מעורב גרורות סרטן6. למרות ההתקדמות, הטכנולוגיות הקליניות הנוכחיות עדיין סובלות מדיוק נמוך, מעלות גבוהה וממורכבות. בשל החסרונות האלה, טכנולוגיות חדשות לגילוי וספירה של CTCs השחלות הפך לאזור חשוב למחקר.
לאחרונה, פלק התפתחה כשיטה יעילה לזיהוי לא פולשני של תאים סרטניים, ניתוח של ננו, זיהוי של חיידקים7,8,9. פגבי שונה מן זרם הזריחה המסורתית cy, לנסות על ידי זיהוי האנליטים בזרימה על ידי ניצול פוטואקוסטיקה. אפקט פוטואקוסטי מופק כאשר אור לייזר נספג על ידי חומר שגורם הרחבה תרמואלסטית, הפקת גל אקוסטי שניתן לזהות על ידי מתמר אולטרסאונד10,11. היתרונות של פטוג מעל הזרימה המסורתית של השיטות הללו כוללות פשטות, תרגום קלות להגדרות קליניות, ואיתור ctcs בעומקים חסרי תקדים בדגימות החולה12,13. מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו מערכות פלק לאיתור תאים באמצעות אנדודוגני ו בניגוד אקסוגני14,15. ליד אינפרא אדום (ניר) האור סופג סוכני ניגודיות כגון לצבוע ירוק indocyanine, ו מתכת NPs (למשל, זהב ו-CuS) שימשו תיוג סלקטיבי של תאים ורקמות בשילוב עם הדמיה פוטואקוסטית16,17,18. בשל עומק החדירה המשופר של אור ניר בתוך רקמות ביולוגיות, זיהוי פוטואקוסטי של בולמי ניתן לבצע בעומקים גדולים יותר עבור יישומים קליניים. בשל הפוטנציאל הגדול שלה לשימוש במרפאה, השילוב של סוכני ניגוד ממוקד של ניר עם פלק יצר עניין רב באיתור CTCs.
בשילוב עם סוכני ניגודיות ממוקדים מספק גישה משופרת לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות מטופלים עם דיוק משופר וזיהוי ממוקד של CTCs. אחת מאסטרטגיות הזיהוי העיקריות של CTCs היא המיקוד הספציפי של חלבונים ממברנה נוכח בתא העניין. אחד המאפיינים הבולטים של CTCs השחלות הוא ביטוי יתר של קולטני חומצה פולית הממוקם על הממברנה החיצונית שלהם19. קולטן חומצה פולית מיקוד היא אסטרטגיה אידיאלית לזיהוי של CTCs השחלות בדם בגלל תאים אנדוגניים, אשר יש ביטוי גבוה יותר של קולטני חומצה פולית, הם בדרך כלל לומיאל ויש להם חשיפה מוגבלת למחזור הדם20. נחושת גופרתי NPs (קוס NPs) הכירו לאחרונה על יכולתם למקד קולטני חומצה פולית הביע על תאים סרטניים21. בשילוב עם תאימות ביולוגית שלהם, קלות הסינתזה והקליטה עמוק בניר, סוכני הניגודיות של NP אלה משלבים אסטרטגיית פילוח אידיאלית לאיתור השחלות CTCs באמצעות פכ.
עבודה זו מתארת את הכנת הפא-קוס NPs והשימוש בהם לאיתור תאים סרטניים בשחלות במערכת הזרמת פוטואקוסטית. CuS NPs משתנים עם חומצה פולית כדי במיוחד למקד CTCs השחלות לפלוט אות פוטואקוסטי כאשר מגורה עם 1,053 ננומטר לייזר. התוצאות מצביעות על גילוי מוצלח של תאים סרטניים בשחלות מודבטים עם אלה הסוכנים הניגוד פוטואקוסטי בתוך מערכת פכ. תוצאות אלה מציגות זיהוי של תאים סרטניים בשחלות למטה לריכוזים של תא 1/μL, ומיקרוסקופ פלואורסצנטית מאשרת ספיגה מוצלחת של חלקיקים אלה על ידי סקוב-3 סרטן השחלות תאים22. עבודה זו מספקת תיאור מפורט של סינתזה פא-קוס NPs, הכנת דגימות עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטית, בנייה של מערכת הזרימה פוטואקוסטית, וזיהוי פוטואקוסטי של תאים סרטניים בשחלות. השיטה המוצגת מציגה זיהוי מוצלח של CTCs השחלות בזרימה ניצול פא-CuS NPs. העבודה העתידית תתמקד ביישום הקליני של טכנולוגיה זו לקראת גילוי מוקדם של גרורות סרטן השחלות.

<table><tbody><tr><td>0.025% טריפסין עם EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ומיקרו; יחידת סינון ואקום m 1,000 מ"ל</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td>לסינון כמויות גדולות יותר של מי DI.</td></tr><tr><td>0.2 ומיקרו; מסנן מזרק סטרילי m</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr>טנק <td></td><td>מודפס בתלת מימד</td> כרטיס רכישה <td>בהתאמה</td><td></td>אישית</tr> National <tr><td></td><td>Instruments PXIe-5170R</td><td>250 MS/s, 8 ערוצים, 14 סיביות</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985-1.8KG</td><td>חומר ניקוי המשמש לניקוי כלי זכוכית.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 מסננים צנטריפוגליים</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 מסננים צנטריפוגליים</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hematocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) כלוריד</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>206532500</td><td></td></tr><tr><td>צימוד אובייקטיבי</td><td>Thorlabs</td><td>LMH-10x-532</td><td>לזוג אור פועם לסיב אופטי.</td></tr><tr><td>שלב צימוד</td><td>ניופורט</td><td>F-91-C1-T</td><td>שלב לצימוד אור פועם למטרה. מחזיק FP-1A ו-LMH-10x-532</td></tr><tr><td>CPX סדרת ניקוי דיגיטלי אולטרסאונד אמבטיה</td><td>פישרברנד</td><td>דגם CPX3800</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת רכישת נתונים</td><td>National Instruments NI</td><td>LabVIEW 2017 (32 סיביות)</td><td>LabVIEW המשמשת לסנכרון פולסי לייזר עם רכישת נתונים.</td></tr><tr><td>תוכנה לעיבוד נתונים</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2016a</td><td>שחזורים וגרפים שהופקו באמצעות תוכנת Matlab.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>סיבים צ'אק</td><td>ניופורט</td><td>FPH-DJ</td><td>משמש להחזקת הסיבים החשופים.</td></tr><tr><td>מצמד סיבים</td><td>ניופורט</td><td>FP-1A</td><td>שלב 3 צירים למיקום צ'אק סיבים וסיבים אופטיים במוקד המטרה.</td></tr><tr><td>חומצה פולית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F7876-10G</td><td></td></tr><tr><td>Formvar מצופה TEM רשתות</td> אלקטרונים <td>מדעי מיקרוסקופיה</td><td>FCF300-CU-SB</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96420-14</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A בינוני</td><td>ATCC</td><td>30-2007</td><td></td></tr><tr><td>נורמה-הזרקה 10 מ"ל מזרקים</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>4100-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>סיבים אופטיים</td><td>Thorlabs</td><td>FG550LEC</td><td>משמש לחשיפת הדגימה לאור פועם.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62036</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>לייזר פועם</td><td>RPMC לייזרים בע"מ</td><td>Quantus-Q1D-1053</td><td>מקור לייזר פועם עם מפרט 1053 ננומטר, דופק 8 ns, מקסימום 10 הרץ.</td></tr><tr><td>פולסר/מקלט</td><td>Olympus</td><td>5077PR</td><td>מקבל, מסנן ומגביר אותות פוטו-אקוסטיים. מופעל עם רווח של 59 dB.</td></tr><tr><td>מכשיר סאטר</td> <td>צינור נימי קוורץ</td><td>QF150-75-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Midum 1640 (1x) ללא חומצה פולית</td><td>Gibco</td><td>27016-021</td><td></td></tr><tr><td>סיליקון</td><td>Momentive Performance Materials, Inc.</td><td>GE284</td><td></td></tr><tr><td>SKOV-3 תאים</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>נתרן קרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7795-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד חרוזים</td><td>BDH</td><td>BDH9292-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן גופרתי Nonahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431648-50G</td><td></td></tr><tr><td>משאבות מזרק</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>DUAL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X-Succinimydl ester</td><td>Invitrogen</td><td>1949071</td><td></td></tr><tr><td>מתמר</td><td>Olynmpus</td><td>V214-BB-RM</td><td>גלאי אולטרסאונד עם תדר מרכזי של 50 מגה-הרץ ורוחב פס חלקי של -6 dB של 82%.</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0.4%</td> <td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>אולטרסאונד ג'ל</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>ג'ל אולטרסאונד Aquasonic 100</td><td>לצימוד מתמר</td></tr></tbody></table>

סרטן השחלות האיתור באמצעות פוטואקוסטי זרימה cy, לנסות

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

מחקרים רבים מראים כי הספירה של תאים סרטניים במחזור (CTCs) עשוי להראות הבטחה ככלי התחזיות לסרטן השחלות. אסטרטגיות נוכחיות לאיתור CTCs כוללות זרימה cy, התקנים מיקרו-פלואידים, ותגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR). למרות ההתקדמות האחרונה, שיטות לאיתור גרורות סרטן השחלות המוקדמות עדיין חסר רגישות וספציפיות הנדרשות עבור תרגום קליני. כאן, שיטה הרומן מוצג לאיתור של תאים סרטניים במחזור השחלות על ידי הזרמת פוטואקוסטית cy, שימוש במערכת הדפסה תלת ממדית מותאמת אישית (3D), כולל תא זרימה ומשאבת מזרק. שיטה זו משתמשת חומצה פולית-הכתיר נחושת ננו חלקיקים (פא-CuS NPs) כדי למקד את סקוב-3 תאים סרטניים בשחלות על ידי פכ. עבודה זו ממחישה את האהדה של סוכני הניגוד האלה לתאים סרטניים בשחלות. התוצאות מציגות אפיון NP, זיהוי פג, ו קליטת NP על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית, ובכך להפגין את הפוטנציאל של המערכת הזאת הרומן לזהות CTCs השחלות בריכוזים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

איור 1A מראה תמונה אופיינית של חלקיקים מסונתז. הגודל הממוצע של ננו-חלקיק אופייני הוא כ 8.6 ננומטר ± 2.5 nm. מדידת ננו-חלקיק בוצעה ב-ImageJ. הפונקציות של הסף ופרשת השדה הוחלו כדי להפריד בין החלקיקים למדידה. הקטרים האופקיים והאנכיים של כל חלקיק נמדדו בניצב אחד לשני וממוצעים עוד יותר. עבור DLS, מדידה ייצוגית מוצגת באיור 1ב. קוטר ההידרודינמי הממוצע לחלקיקים אלה הוא 73.6 ננומטר. חלקיקי נחושת גופרתי יש...

פרוטוקול מוצג כדי לזהות במחזור תאים סרטניים בשחלות ניצול מערכת מותאמת אישית של הזרמת פוטואקוסטית וממוקד חומצה פולית-הכתיר נחושת גופרתי.

סרטן השחלות האיתור באמצעות פוטואקוסטי זרימה Cy, לנסות

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

האמצעים הנוכחיים לגילוי סרטן השחלות הקליניות אינם ספציפיים וחוסר נקודת טיפול בזיהוי תאים סרטניים במחזור. מערכת הזרימה הפוטית שלנו מאפשרת לבדוק דגימות של חולים עבור סמני סרטן השחלות הספציפיים בזרם הדם. הליך זה מספק טכנולוגיית פלטפורמה ייחודית עם שיפורים בטכניקות הנוכחיות מבחינת פשטות, עלות נמוכה, מגבלות מבטיחות של זיהוי ויכולת ליישם יישומים רחבים.באמצעות עבודה זו, אנו שואפים לבנות את מערכת חלקיקים ממוקדת שלנו לסרטן השחלות כדי לבדוק דגימות חולה אקס ויוו עבור CTCs. מערכת PAFC רב-תכליתית זו מסוגלת להתרחב לשימוש קליני, ולבחן את נוכחותם של מגוון רחב של סמנים ביולוגיים בדם. יישור אופטי נכון הוא קריטי לזיהוי מטרות בתוך מערכת ציטומטריית זרימה פוטואקוסטית.יתר על כן, כדי להבטיח צימוד אקוסטי תקין, ודא שאין בועות בין מגלשת הזכוכית המתמר. בשל האופי המותאם אישית של מערכת הזרימה ומרכיביה, הדמיה של השיטה מועילה לרבייה מדויקת. במכסה המנוע של אדים כימיים מאווררים, סנן כ-300 מיליליטר של מים שעברו דה-מיון באמצעות מסנן מיקרומטר סטרילי של 0.2.הוסף 0.0134 גרם של נחושת כלוריד ו 100 מיליליטר של מים deionized לבקבוק תחתון עגול נקי 250 מיליליטר כדי ליצור פתרון כלוריד נחושת מילימולר אחד. מוסיפים 0.015 גרם של חומצה פולית לבקבוק ולהשתמש בר ערבוב מגנטי לערבב את הפתרון במשך כחמש דקות. ואז לערבב 0.024 גרם של נתרן סולפיד nonahydrate עם 100 microliters של מים deionized.השתמש פיפטה 200 microliter לאט להוסיף פתרון זה לתערובת התגובה על פני משך של כ 10 שניות. תכסה את כלי התגובה. מניחים את הכלי באמבט שמן להגדיר 90 מעלות צלזיוס ולהמשיך לבחוש.לאחר כ -15 דקות או כאשר אמבט השמן הגיע לטווח הטמפרטורה בין 85 ל 90 מעלות צלזיוס, לאפשר את התגובה להמשיך במשך שעה נוספת. כאשר התגובה הושלמה, להסיר את כלי התגובה מן אמבט השמן ולתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות לפני העברתו לאמבט קרח. לאחר התגובה מקורר, להתאים את ה- pH כ 10 באמצעות נתרן טוחן אחד הידרוקסיד.מוסיפים את התערובת לעמודת צנטריפוגה של 30 קילודלטון ב-15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-3, 082 פעמים גרם במשך 15 דקות כדי לטהר את תערובת התגובה. ראשית, מערבבים את חומצה פולית כתרים נחושת גופרית חלקיקים בריכוז הנכון במדיה RPMI טרי. הוסף פתרון חלקיקי זה לכל באר של צלחת 24 באר מוכן המכיל SK-OV-3 תאים בריכוז של 400 מיקרוגרם למיליליטר.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שעתיים. לאחר מכן, נסה את התאים עם 0.5 מיליליטר של 0.25%trypsin ו- EDTA. כדי לנטרל את טריפסין, להוסיף לפחות מיליליטר אחד של חומצה פולית ללא RPMI 1640 מדיה צמיחה מלאה צנטריפוגה התאים ב 123 פעמים g במשך שש דקות.כדי לשטוף את התאים, להסיר את supernatant, resuspend התאים בשני מיליליטר של PBS וצנטריפוגה ב 123 פעמים g במשך שש דקות. חזור על שלב שטיפה זה פעמיים כדי להסיר חלקיקים לא מאוגדים. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים עם 1-2 מיליליטר של פתרון 2%Tween ב- PBS.לספור את התאים באמצעות המוציטומטר ו טריפאן כחול. לדלל את התאים בתב"ג של 2%Tween ב- PBS לריכוז שנבחר לגילוי. השתמש בקובץ STL התלת-ממדי שסופק כדי להדפיס תלת-ממד את מיכל הזרימה עם פלסטיק תרמופלסטי או PLA של ABS.לאחר הדפסת המיכל, נקה והרכב את המערכת לשימוש. מניחים כיסויי זכוכית מעל מילימטר אחד על ידי חריץ שלושה מילימטר ואת החור סנטימטר אחד במערכת הזרימה בזהירות לאטום עם סיליקון כדי למנוע דליפה. לאחר מכן, התאימו את צינור נימי לצינורות נרפא הסיליקון.הכנס את הצינורות לתא הזרימה דרך צד מיכל הזרימה כך שצינור נימי הזכוכית נמצא ישירות מעל וחזית חריץ שלושת המילימטרים והחור בסנטימטר אחד. לאטום את הצינורות עם סיליקון. ואז לחבר את המתמר לפולסר אולטרסאונד ומקלט.להגביר את האות עם רווח דציבלים 59. חבר את הפלט של המסנן לאוסטילוסקופ רב תכליתי שניתן לשנות את תצורתו, המצויד במערך שערים מובנה הניתן לתיוכנת שדה. חבר את אחד הצינורות המגיעים מתא הזרימה לצומת T המחובר לשתי משאבות מזרק בכל ענף.מלאו את אחת ממשאבות המזרק באוויר ואת המשאבה השנייה עם הדגימה שיש לנתח. הגדר את המשאבה המכילה אוויר לקצב זרימה של 40 מיקרוליטר לדקה והגדר את המשאבה המכילה את הדגימה לקצב זרימה של 20 מיקרוליטר לדקה. לאחר מכן, חבר את הצינור הנותר היוצא ממערכת הזרימה למיכל של 10%bleach כדי להיפטר מהתאים לאחר שהם יוצאים ממערכת הזרימה.מניחים את החלק של צינור נימי קוורץ ביישור ישיר עם מתמר בתצוגת השדה של המיקרוסקופ כדי לאפשר מיקום זהיר של הסיב האופטי מעל המדגם, כך שהוא מאיר את כל רוחב הצינור. הקרין את הדגימה באמצעות סיב אופטי תקשור לייזר מצב מוצק שאוב דיודה הפועל באורך גל של 1, 053 ננומטר. השתמש במצלמה רכוב מיקרוסקופ כדי לתעד את הזרימה, הירי של הלייזר, ואת המעבר של דגימות דרך מערכת הזרימה.במחקר זה, ציטומטריית זרימה פוטואקוסטית ואת סוכן מיקוד נחושת גופרתי ממוקד משמשים כדי לזהות תאים סרטניים במחזור השחלות. תמונת TEM טיפוסית של הננו-חלקיקים מסונתזים מראה כי הגודל הממוצע של חלקיק טיפוסי הוא כ 8.6 ננומטר. הקוטרים האופקיים והאנכיים של כל חלקיק נמדדים בניצב זה לזה וממוצעים עוד יותר.הקוטר ההידרודינמי הממוצע לחלקיקים אלה הוא 73.6 ננומטר. ננו-חלקיקי נחושת גופרית יש עקומת ספיגה אופיינית המשתרעת לתוך אינפרא אדום הקרוב. יש חפץ קל סביב 850 ננומטר שנגרם על ידי החלפת לייזרים על ידי ספקטרופוטומטר.תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות של תאים דגירה עם חלקיקים מתויגים פלואורסצנטי להראות כי ספיגת חלקיקים ניתן לדמיין על ידי נוכחות של פלואורסצנטיות על פני התא. תאים לא דגירה עם חלקיקים להראות שום אות פלואורסצנטי. נוכחותו של אות פלואורסצנטי זה מצביעה על ספיגה מוצלחת של החלקיקים ועל יכולתם להתגלות במערכת הזרימה.דוגמאות לאותות טיפוסיים של רכישת נתונים מוצגות כאן. הנתונים הגולמיים מצביעים על הבדלי האות בין התאים המתויגים בננו-חלקיקים, PBS וננו-חלקיקי נחושת גופרית מצופים חומצה פולית. באמצעות תצוגת מעבדה מותאמת אישית ותוכנתי MATLAB, שחזורי תמונה עשויים מהפקדים החיוביים והשליליים בזמן אמת ורכישת פוסט בהתאמה.מעטפות בודדות מומרות לאחר מכן לערכי פיקסלים ומוצגות כעמודות עצמאיות. הבדלים ברורים באות פוטואקוסטי מתרחשים בין PBS לבין חומצה פולית כתרים נחושת סולפיד חלקיקים בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר. במהלך הליך זה, זה קריטי כדי ליישר כראוי את מתמר אולטרסאונד, מיקרוסקופ וסיבים אופטיים בתוך מערכת cytometry זרימה פוטואקוסטיטי.אשר את יישור המערכת על-ידי בדיקת פקדים חיוביים ושליליים. בשל הרבגוניות של טכניקות פילוח פוטואקוטיות והמגוון הרחב של יישומים אפשריים באמצעות PAFC, טכניקה זו סוללת את הדרך ליישומים קליניים ומחקריים חשובים מבחינה תרגום. כדי להבטיח יישום קליני, מחקרים נוספים צריכים להתמקד בבדיקות של דגימות המטופל וצמצום הצעדים הפרוצדורליים.הסינתזה של הננו-חלקיקים צריכה להיכנס למכסה המנוע הכימי תוך שימוש בציוד המגן הנכון. קווי תאים אנושיים חייבים להיות מטופלים בהתאם להנחיות המוסד שלך. השימוש בלייזר דורש אימון בטיחות קרינה ו- PPE מתאים.שימוש בלייזר ובדיקות פוטו-אסטיות צריכים להתבצע רק על ידי אנשי צוות מיומנים.

ovarian-cancer-detection-using-photoacoustic-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פיתחנו cytometer הזרימה באמצעות אולטרסאונד לייזר המושרה לזהות במחזור בתאי מלנומה אינדיקטור מוקדם של מחלה גרורתית.

איתור בידוד של תאים מלנומה במחזור באמצעות Flowmetry photoacoustic

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקה המאפשרת הפנמה של ננו-חלקיקי נחושת גופרתית מכוסים חומצה פולית (CuS NPs). ל-CuS NPs הפונקציונליים על ידי חומצה פולית יש את היכולת להתמקד בקולטני חומצה פולית אשר באים לידי ביטוי יתר בתאי סרטן שחלות רבים.

מיקוד ננו-חלקיקים פונקציונלי של סרטן השחלות: טכניקה להקל על ספיגת חומר ניגוד ננו-חלקיקים מצומדים בחומצה פולית על ידי תאי סרטן השחלות

בסרטון זה אנו מציגים זיהוי ציטומטרי של זרימה פוטואקוסטית של תאי סרטן השחלות הנושאים ננו-חלקיקים בתא זרימה במבחנה. טכניקה לא פולשנית זו מזהה בהצלחה תאי גידול במחזור במערכת זרימה באמצעות חומר ניגוד.

ציטומטריית זרימה פוטואקוסטית במבחנה: טכניקה פוטואקוסטית לא פולשנית לזיהוי תאי סרטן שחלות נושאי ננו-חלקיקים

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להכנת דגימות על ידי תרבית משותפת של צמחי שחלה עם תאי סרטן החצוצרה. דגימות אלה מוצגות באמצעות ספקטרוסקופיית מסות הדמיה, או IMS, כדי לזהות חילופי מולקולות קטנות בין התאים והרקמות המובילים להתפתחות הגידול.

מידול תקשורת סרטן השחלות לצורך הדמיה ניתוח ספקטרומטריית מסות: שיטה לזיהוי מתקשרים כימיים של מולקולות קטנות בהתפתחות גידול שחלות גרורתי

cystography photoacoustic (PAC) יש פוטנציאל גדול כדי למפות שלפוחיות השתן, איברים פנימיים רגישים קרינה במטופלי ילדים, ללא כל שימוש בקרינה מייננת או חומר ניגוד רעיל. כאן אנו מדגימים את השימוש בPAC למיפוי שלפוחיות השתן עם הזרקה של קליעים נותבים אופטיים אטומים...

Cystography photoacoustic

אנו מתארים פלטפורמת הדמיה לא פולשנית של בעלי חיים המאפשרת זיהוי, כימות וניטור של צמיחה והישנות של סרטן השחלות. מודל קסנוגרפט תוך-צפקי זה מחקה את הפרופיל הקליני של חולות עם סרטן השחלות.

דגם Murine הדמיה בלתי פולשנית לזיהוי ומעקב סרטן השחלות הישנות

גרורות סרטן השחלות מאופיינת בנגעים תוך-צפקיים מפוזרים רבים, כך שכימות חזותי מדויק של עומס הגידול הוא מאתגר.  כאן אנו מתארים שיטה לכימות במקום ומחוץ לגוף של עומס גידול גרורתי באמצעות תאי גידול עם חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) והדמיה אופטית.

כימות של גרורות סרטן השחלות תוך הצפק

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעריך חומר משטח תכונות אופטיות באמצעות אפקט photoacoustic בשילוב עם השתקפות פנימית מוחלטת. טכניקה זו photoacoustics חלוף מבוססות בשטח שניתן להשתמש בהם כדי ליצור מערכת מטרולוגיה photoacoustic להעריך עוביים 'חומרים, בתפזורת ומדדי השבירה סרט דק, ולחקור התכונות האופטיות שלהם.

חלוף שדה בהתבסס Photoacoustics: הערכת נכס אופטית על משטחים

סרטן השחלות טפסים גרורות לאורך כל חלל הצפק. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להפוך, שימוש חומצה פולית-קולטן ממוקד תהודה משופרת משטח nanoprobes פיזור ראמאן לגלות נגעים עם ירידה לפרטים גבוהה באמצעות הדמיה רציומטרי. Nanoprobes מנוהלים intraperitoneally חי לעכברים, הדימויים נגזר לתאם עם היסטולוגיה.

ראמאן תהודה משופרת השטח פיזור Nanoprobe Ratiometry לגילוי סרטן השחלות מיקרוסקופיים באמצעות חומצה פולית קולטן מיקוד

אנו מדווחים על פרוטוקול אולטרסאונד והדמיה פוטואקוסטית להדמיה טרנס-וגינלית של נגעים בשחלות/אדנקסל. הפרוטוקול עשוי להיות בעל ערך למחקרי הדמיה פוטואקוסטית תרגומית אחרים, במיוחד אלה המשתמשים במערכי אולטרסאונד מסחריים לזיהוי אותות פוטואקוסטיים ואלגוריתמים סטנדרטיים ליצירת אלומות השהיה וסכום להדמיה.

פרוטוקול אולטרסאונד והדמיה פוטואקוסטית להדמיה טרנס-וגינלית של נגעים בשחלות

שינויים בזרימת הדם בשחלות בתקופה שלפני הביוץ חיוניים לביוץ. אולטרסאונד דופלר שימש בבני אדם ובבעלי חיים גדולים כדי להעריך המודינמיקה של השחלות וזלוף. מוצג פרוטוקול ליישום אולטרסאונד דופלר להערכת המודינמיקה של השחלות במהלך השלבים הקדם-ביוציים והפרי-ביוץ בעכברים.

אולטרסאונד דופלר להדמיה חיה וכימות של תפקוד כלי הדם בשחלות בעכברים

למדו לזהות תאי גידול שחלות מסתובבים בדם באמצעות מערכת זרימה פוטואקוסטית מותאמת אישית עם ננו-חלקיקי סולפיד נחושת. שיטה זו מציעה זיהוי ספציפי, עלות נמוכה ויישומים קליניים רחבים.

סרטן השחלות האיתור באמצעות פוטואקוסטי זרימה Cy, לנסות

גלה סרטונים נוספים