הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal
2 ביוני 2020
פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.
בתוך אורגניזמים רב תאיים, רקמות מציגות מעלות גבוהות עוד יותר בכיוון המרחבי שלהן. תאים ליישר ולהציג טווח של עדיפות על פני מרחקים גדולים במהלך morphogenesis. כדי להבין כיצד הסידורים הפלינאריים של האפיתליה מושגים במהלך הפיתוח, חיוני לעקוב אחר כיווני התא ודינמיקת הצמיחה עם נאמנות זמנית ספיאלית גבוהה ב- vivo.
הפרוטוקול המתואר נועד לדמיין ולנתח התנהגויות תאים ברמות גלובליות ומקומיות באפידרמיס הפופאלי drosophila. מתודולוגיה זו יכולה לספק תובנות על תיאוריה שונה של מחקר, ביולוגיה של התא, מורפוגנזה וקוטביות תכנן, ו ניתן ליישם אותה על ניתוח של רקמות, מבנים ומודלים אחרים. כל השלבים יכולים להתבצע בקלות לאחר תרגול כלשהו.
הם דורשים דיוק. הדמיה של פרוטוקול זה מסייעת בהשגת תוצאות מיטביות בזמן קצר יותר. ניתוח הגוונים מורכב.
כדי להתחיל, להשתמש במברשת צבע לחה להעביר מבוים לבן pre-pupae לבקבוקון פלסטיק טרי, ולשמור אותם שם כל עוד יש צורך ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר כל גלם מקיר הבקבוקון בעזרת מטלות. הדבק את הצד הגחוני של כל גולם על מגלשת זכוכית מכוסה בקלטת דביקה דו צדדית.
הקש בעדינות על צריחי הראש ועל פני השטח הגביים של הגור עם קצות המדפים כדי להבטיח את הדבקה של מארז הגווע לקלטת. התחל לנתח תחת מיקרוסקופ סטריאו על ידי הסרת בעדינות את אופרקולום מן puparium עם המדפים. הכנס קצה אחד של המלקחים במארז רדוד בין המארז הגורי לבין משטח הגופה דרך פתח הניתוח.
לקרוע את המקרה מכף אל זנב באופן משני בנדנדה אחת או יותר, הימנעות צביטת הגופה. מקפלים בחזרה את המקרה pupal סדוק לצדדים הצדדיים כפי שאתה ממשיך להמשיך עד הקצה האחורי. הסר את הגופה מן המקרה הגלוי נפתח על ידי החדרת בזהירות את המדפים מתחת לחיה בעדינות מושך למעלה.
הגופה נדבקת לקצה המדפים. מחזיקים את הגלימה בעדינות בצד הגחוני, ומעבירים את הגופה לצלחת עם תחתית זכוכית על גבי טיפה קטנה של שמן הלוקרבון חדיר לגז. מגלגלים חתיכת נייר טישו רטוב בשולי המנה ומכסים את המנה כדי לשמור על לחות.
לכוון את הגומד מעל טיפת השמן על המנות בתחתית הזכוכית על פי התחום ואת התהליך שיש להעריך. במשך זמן רב לחיות הדמיה של ההתפשטות המוקדמת של הקינים הגביים, הגבי לכוון את הגלם. כדי לדמיין את ההתפשטות המאוחרת שלהם ואת שיפוץ הרקמות, כוון את הגלמים.
מעבירים את המנה עם תחתית הזכוכית המכילה את הגלמים הרכובים לשלב המיקרוסקופ ומתמקדים על פני השטח של אזור הבטן באמצעות אור משודר. כדי להשתמש recombination mitotic כדי לגרום פסיפסים גנטיים באפיתל הבטן, להכין נקבות בתולה נושאת flipase הלם חום בלתי ניתן לעיכול, אתר FRT במיקום גנומי מסוים, ו דיסטל סמן הסלולר לזיהוי לאתר FRT. הכינו זכרים מוטנטים הנושאים אתר FRT במיקום הגנומי המקביל.
חוצים כמה נקבות וזכרים בפרופורציה אחת עד שלוש בבקבוקון פלסטיק ב 25 מעלות צלזיוס במשך ארבעה עד חמישה ימים. כדי ליצור שיבוטים סומטיים בהיסטובלסטים, בצע טיפול בהלם חום בשלב הזחל השלישי של צאצאי הצלב על ידי טביעה של בקבוקוני הפלסטיק המכילים את בעלי החיים באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עד שעה. בתוכנת התמונה J, השתמש בפונקציית ההקרנה בעוצמה המרבית כדי להגן על פרוסות מחסנית Z שנרכשו על-ידי מיקרוסקופ קונפוקל ב- 2D.
לקנים צורה אופיינית שמכווןת אותם במערכת קואורדינטות פלנארית לפנים שמאלה ודורסל למעלה. כדי להשיג תוצאות מיטביות עם ניתוח זה, יש לרכוש את תמונת הקלט ברזולוציה גבוהה. כדי להשיג ערכי כיוון איכותיים בקצוות תאים מקומיים, לחץ על תפריט התוסף ובחר באפשרות התפלגות J בכיוון.
הגדר את סיגמא החלון הגאוסיאני לפיקסל אחד, spline מעוקב למילוי הדרגתי, קוהרנטיות מינימלית ל- 20 אחוזים ואנרגיה מינימלית לאחוז אחד. השתמש באפשרות סקר הצבעים של התוסף. הגדר את הגוון לכיוון, לרוויה לקוהרנטיות ולבהירות כדי להזין תמונה.
צבע זה מקודדים כיוון קצה תא יחסית למערכת הקואורדינטות התבלתי-תכולה. לאחר מכן, תחת תפריט התוסף, השתמש באפשרות מדידת J בכיוון כדי לכמת כיוונים סלולריים ותא כיווני ליישור תאים. צור אזורים קטנים, סמוכים שאינם חופפים של עניין במשקל אחיד סביב 20 מיקרומטר פעמים 20 מיקרומטר בתוך האזור שנכבש על ידי ההיסטובלסטים.
מדידה לוחצת מחשבת את הכיוון המקומי הדומיננטי ואת הקוהרנטיות של ה- ROIs. במחקר זה, המתודולוגיה המשמשת מסוגלת ליצור סרטים ברזולוציה גבוהה של הגלמים המתפתחים לתקופות של עד 48 שעות ללא הלבנת תמונות משמעותית או רעילות תמונה. דוגמאות של שיבוטים מסוג פראי המסומנים על ידי היעדר RFP NLS ואת כתמים התאומים שלהם ב 26 שעות לאחר היווצרות puparium מוצגים כאן.
השיבוטים התארכמו לאורך גבולות המקטעים. שיבוטים תאומים מסודרים במקביל או במקביל. מורפולוגיה של שיבוט מסוג פראי ב 26 שעות ו 47 שעות לאחר היווצרות פופאריום מראה מורפולוגיה גבול מורכבת בשני השלבים.
חלקות קופסה ושפם עבור פרמטרים גיאומטריים ב 26 שעות ו 47 שעות לאחר היווצרות puparium להראות את השטח הממוצע ואת ההיקף גדל באופן משמעותי בחלון זמן זה. כיוון השיבוט נמשך במהלך התרחבות ושיפוץ. פרמטרי צורה ב 26 שעות ו 47 שעות לאחר היווצרות puparium מצביעים על חספוס, מעוגל ועגול בקושי השתנה שיבוטים סוג פראי.
הקפד לא לפגוע בגלם, אחרת הוא ימות תוך כמה שעות, וישפיע על ההדמיה החיה. פרוטוקול זה אינו דורש להשתמש בריג'נט או בכלי סרקטוס. הימנע צובט את עצמך בעת לנתח.
על ידי יישום מתודולוגיות אלה ניתן ליצור סרטים ברזולוציה גבוהה לתקופות ארוכות באמצעות טכניקות לדמיין שונים. מוקד לדיסקים פוטון או ספינינג. ניתוח כלורל יכול להיות מועסק כדי לחקור תגובות לא אוטונומיות מאז תאים אקראיים להקל בזיהוי של שיחות צולבת או מנגנוני תקשורת סלולרית.
ניתן להתאים שיטות אלה בקלות לחקר מגוון רחב של תופעות מורפגנטיות, כולל תיאום של התפתחות אפידרמיס, שרירים ונוירו במהלך מטמורפוזה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מיועד לדימות וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים וצמיחת הרקמות באפיתל הבטן של הדרוזופילה בזמן שזבוב הפירות עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן יכולה לשמש לחקר שלבים שונים של התפתחות, רקמות ומבנים תת-תאיים בדרוזופילה או באורגניזמים מודליים אחרים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מורפוגנזה
- קוטביות פלנרית
רקע
- רקמה מציגה דרגות גבוהות של כיוון מרחבי בתוך אורגניזמים רב-תאיים.
- תאים מסתדרים ומפגינים עדיפות על פני מרחקים גדולים במהלך מורפוגנזה.
- מעקב אחר כיווני התאים ודינמיקת הצמיחה חיוני להבנת סידורים אפיתליים.
- מחקר זה מתמקד באפידרמיס הגולם של הדרוזופילה.
מטרת המחקר
- לדמות ולנתח התנהגויות תאים ברמה גלובלית ומקומית.
- לספק תובנות לתיאוריות של ביולוגיה של התא ומורפוגנזה.
- ליישם את המתודולוגיה על רקמות ואורגניזמים מודליים שונים.
שיטות ששימשו
- טכניקות דימות למעקב אחר כיוון התאים.
- ניתוח של דינמיקת צמיחת הרקמה.
- תצפית in vivo של התפתחות הדרוזופילה.
- יישום הפרוטוקול על שלבי התפתחות שונים.
תוצאות עיקריות
- נאמנות מרחבית-זמנית גבוהה במעקב אחר התנהגויות התאים.
- תובנות על הדינמיקה של כיוון התאים במהלך המטמורפוזה.
- יישומים פוטנציאליים לרקמות ואורגניזמים מודליים אחרים.
- המתודולוגיה נגישה לאחר תרגול.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את ההבנה של המורפוגנזה האפיתלית.
- ניתן להתאים אותו ליישומי מחקר שונים בביולוגיה של התא.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל את המתודולוגיה לתובנות רחבות יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding tissue-level organization and growth dynamics is critical for de-risking target validation in complex disease models. This protocol enables high-fidelity tracking of cellular alignment and morphogenetic processes, supporting mechanistic insights into epithelial patterning. Such quantitative spatial-temporal data enhances predictive confidence in preclinical models by linking cellular behaviors to tissue-scale outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tissue-scale organization to validate hypotheses about planar polarity and cellular coordination in morphogenesis.
- Operational Value: Provides reproducible imaging and analysis workflows for assessing cellular alignment and directional growth in epithelial systems.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking molecular perturbations to measurable changes in tissue orientation and clonally resolved growth dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative orientation and coherency metrics from defined regions of interest, enabling objective comparison of cellular behaviors across conditions.
- Operational Value: Standardizes live imaging protocols using gas-permeable halocarbon oil and mounted pupae for long-term, high-resolution time-lapse acquisition.
- Assay Readiness: Facilitates screening-ready readouts such as clone elongation, border morphology, and area/perimeter changes over time for phenotypic assessment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage observations of histoblast clone dynamics to broader tissue remodeling processes relevant to wound healing and regeneration models.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of non-autonomous responses via clonal analysis and genetic mosaics to dissect cell communication mechanisms in developing epithelia.
- Predictive Confidence: Sustained orientation and stable shape parameters during expansion provide baseline benchmarks for assessing aberrant morphogenesis in disease-relevant perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of planar cell polarity and extends to lead identification by enabling quantitative assessment of cellular responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cellular alignment and tissue orientation during morphogenetic events such as histoblast nest expansion and remodeling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized live imaging and orientation analysis of epithelial sheets over 48-hour periods with minimal photo toxicity.
- Analytics: Generates dominant local orientation and coherency measurements from 20x20 micrometer regions of interest using OrientationJ plugins for objective, quantitative comparison.
- Translational Research: Connects clonal dynamics and border morphology changes to preclinical continuity in tissue repair and regeneration models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform adaptable to other tissues, developmental stages, and model organisms beyond Drosophila pupal epidermis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epithelial morphogenesis and planar polarity pathways.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of live imaging and quantitative orientation analysis across laboratories and model systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of aberrant tissue organization, reducing late-stage biological risk in preclinical programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable, morphology-based readouts that correlate with functional tissue states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, pupal dissection, and live imaging under stereo and confocal microscopy.
- Dependent on gas-permeable halocarbon oil, glass-bottomed dishes, and stable humidity maintenance for long-term imaging.
- Necessitates standardized image acquisition protocols and plugin-based analysis (OrientationJ) for consistent orientation and coherency quantification.
- Requires adaptation of mounting orientation (dorsal vs. dorsal-lateral) based on the specific biological process being imaged (early expansion vs. late remodeling).
- Practical limitations include sensitivity to dissection-induced damage, which can compromise pupal viability and live imaging quality if not performed with precision.
