ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש את הצורה של קנדידה אלביקנס תא ולוקליזציה במערכת העיכול היונקים.

פרוטוקול זה הניב כמה מהתובנות הטובות ביותר שיש לנו עד כה על האופן שבו קנדידה אלביקנים מאכלסת את מערכת העיכול של היונקים. לדוגמה, עד לאחרונה, לא ממש ידענו היכן קנדידה מותאמת בתוך המעיים או אילו צורות מורפולוגיות רבות היא מניחה בתוך נישה זו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לדמיין את קנדידה בתוך הסביבה הטבעית שלה מבלי לשבש את האינטראקציות התלת מימדיות שיש לפטריה עם מבנים מארחים או עם חיידקים במיקרוביוטה.

מכיוון שהבטן היא סביבה מורכבת, קשה מאוד לדגמן במעבדה ולכן זה היה מאוד מספק למצוא דרך לחקור את הביולוגיה של קנדידה ישירות במודל מארח. רכיבים מסוימים של המיקרוביוטה במעיים כולל קנדידה אלביקנים חשודים לשחק תפקידים במחלות כגון מחלות מעי דלקתיות. טכניקה זו יכולה לשמש באופן פוטנציאלי כדי לאבחן את נוכחותם של מיקרואורגניזמים ספציפיים בדגימות ביופסיה המתקבלות מחולים.

שליטה בטכניקת gavage ואת היכולת לנתח מקטעים במערכת העיכול מבלי לקרוע את האיברים חשוב להשגת תוצאות אופטימליות. כדי להתחיל, gavage כל בעל חיים עם נפח מחושב של inoculum נתון. חבר מחט האכלה של בעלי חיים אוטוקלאבים למזרק מיליליטר אחד ומלא את המזרק בנפח gavage אחד המוודא להסיר את כל הבועות.

מניחים את המזרק על משטח סטרילי. כדי לאבטח את החיה, החזק אותה בבסיס הזנב ביד הדומיננטית והחלק את היד הלא דומיננטית בגב החיה לעור הרופף ממש מאחורי האוזניים. לאסוף את המוזג יחד בחוזקה עם האגודל והאגודל.

להרים את החיה על ידי scruff, להפוך אותו לולאה האצבע הקטנה של אותה יד סביב הזנב כדי לשתק את החיה על כף היד. בעדינות להאריך את ראשו של החיה, כך שהוא בקו ישר עם הגוף. ואז להרים את המזרק עם היד הדומיננטית ולהחזיק אותו בניצב לחיה עם המחט המעוקלת מצביע למטה.

השתמש בכדור המחט כדי לחבר בעדינות פינה פנימית של הפה ולקדם את המחט לאורך הצד של הפה אל החלק האחורי של הגרון, ולאחר מכן להזיז את המחט למרכז. ברגע שהכדור של המחט נמצא בחלק האחורי של גרונו של החיה, להטות את המחט כלפי מעלה, כך שהוא מקביל עם קו הגוף של החיה ולאפשר לו להחליק בצורה חלקה במורד הגרון. אם המחט אינה מחליקה בצורה חלקה במורד הגרון, המחט לא יכולה להיות ממוקמת כראוי ויש לסגת כדי למקם מחדש ולנסות שוב.

לקדם בצורה חלקה את המחט המאפשרת לחיה לבלוע את המחט עד שרק מילימטרים ספורים יישארו גלויים. בדוק כי הכדור של המחט הוא בבטן על ידי קידום בעדינות את הבוכנה ואם אין התנגדות, להמשיך לספק את inoculum. לאט למשוך את המחט לאחר inoculum כבר מנוהל ולהחקין את החיה בכלוב שלה.

המשך לעקוב אחר החיה במשך חמש עד עשר דקות לסימנים של נשימה או מצוקה רפואית ולוודא שהיא חוזרת לפעילות תקינה זמן קצר לאחר gavage. אם אותו inoculum ישמש עבור החיה הבאה, לנקות את המחט עם לנגב אלכוהול. אם נעשה שימוש ב- inoculum אחר, החלף את המחט.

השתמש מדפים קהה סוף כדי לצבוט חלק של עור הבטן ולהסית את העור ואת fascia הבסיסית ליד הבסיס של האגן באמצעות מספריים. מרחיבים את החתך בצורת U לאורך כל צד של חלל האף-לידתי עד לבית החזה, ואז מרימים את העור מהדרך. השתמש מטלפים קהה-ים כדי לחלץ בעדינות את cecum מחלל צפק באמצעות מספריים כדי לנתק את הקשרים בין cecum לבין המעי הדק והמעי הגס.

מניחים את כל הקברן בקלטת היסטולוגיה כך שהיא לא תיווסף ותשכב שטוחה. מניחים את כרית הקצף השנייה על גבי ולסגור את הקלטת. לאחר מכן מניחים את הקלטת לתוך צנצנת כובע בורג המכיל מתקארן.

Excise את החלק של המעי הגס המכיל אחד עד שני כדורי צואה ויש לו אורך פחות מזה של הקלטת. מניחים את הרקמה לתוך הקלטת שמירה על זה שטוח ולא wwisted. שכב אותו עם כרית הקצף השנייה, סגור את הקלטת והנח אותה במתקארן.

עבור כל קטע של המעי הדק שיש לדגום, excise קטע אחד עד שני סנטימטר המכילים קצת חומר העיכול. מניחים את הרקמה לתוך הקלטת, שכבת-על עם כרית הקצף השנייה, סוגרים את הקלטת ומכניסים אותה למתקארן. כאשר כריתת הקיבה, לנתק את הקשרים הוושט ואת המעי הדק.

מניחים את הרקמה לתוך הקלטת ומנחים את הקלטת במתקארן. השאירו את הקלטות בתסרון מתקארן בטמפרטורת החדר לפחות שלוש שעות אבל פחות משבועיים. לאחר קיבעון, להסיר את רפידות קצף ולהחזיר כל קטע רקמה שלם לתוך הקלטת שלה.

לאחר מכן לשטוף את הרקמות פעמיים במשך 35 דקות ב 100% מתנול, פעמיים במשך 25 דקות ב 100% אתנול, ופעמיים במשך 20 דקות קסילן. טופטים את הקלטות יבשות על מגבת נייר ומניחים אותן בשעווה פרפין מומסת מראש במשך שעתיים בטמפרטורה של 70 מעלות בתנור הכלאה. לאחר מכן להסיר את הקלטות מן השעווה, לאפשר שעווה עודף לנקז ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר עד שהם מוטבעים בלוקים שעווה.

דה-שעווה הפרפין מוטבע קטעים היסטולוגיים על ידי החדרת השקופיות לתוך צנצנת מחוממת מראש מלא קצילן. השאירו את הצנצנת ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ולאחר מכן להשליך את לשטוף קסילן. יוצקים קסילן טמפרטורת חדר טרי לתוך הצנצנת וחוזרים על הדגירה.

לאחר מכן מלאו את הצנצנת ב-100% אתנול והו דגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, להסיר את השקופיות מן הצנצנת אוויר לייבש אותם. כדי להכתים את C.albicans עם בדיקה דגים, להתחיל על ידי ציור עיגול סביב סעיף הרקמה באמצעות עט פט.

פיפטה 50 microliters של בדיקה המכילה פתרון הכלאה על הרקמה הקבועה בעדינות להפיץ אותו עם קצה פיפטה. כיסוי הנוזל עם כיסוי הכלאה הקפדה למנוע בועות. לאחר מכן לאטום את המגלשות בתא הכלאה הדוק מים ולהדקר את החלקים במשך שלוש שעות ב 50 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה בחושך.

לאחר הדגירה, מוסיפים את תסריט הכביסה לצנצנת קופלין. הסר בזהירות את המכסה מהמגלשה במדפים והצב את השקופית בתסכום הכביסה. מכסים את הצנצנת בנייר אלומיניום ומדרגים אותה ב-50 מעלות במשך 20 דקות.

לאחר מכן, לשטוף את השקופיות על ידי שפיכת את פתרון הכביסה ומילוי הצנצנת עם PBS. מיד לשפוך ול מילוי עם PBS טרי חוזר על התהליך עבור סך של שתי שטיפות. פתיל את PBS עם משימה עדינה לנגב ולהקיף את החלק רקמת המעי עם עט פט.

מניחים את השקופיות במיכל פלסטיק אטום ומוסיפים 50 מיקרוליטרים של פתרון הכתמת מוצין גרעינים למקטע הרקמה. מכסים את המיכל בנייר אלומיניום ומדרגים אותו בארבע מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. לאחר הדגירה, לשים את השקופיות בצנצנת קופלין ולשטוף אותם פעמיים עם PBS.

הקש משם PBS עודף על מגבת נייר ולאחר מכן פתיל משם טיפות הסופי עם טישו. מניחים טיפה אחת של מדיום הרכבה על כל קטע ומכסים אותו בכיסוי זכוכית ומוודאים למנוע בועות. תן למדיום ההרכבה להתפשט מתחת לכיסוי כולו.

לעגן את כיסוי במקום עם לק בפינות תמונה השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה יכול לשמש פלואורסצנטי תווית C.albicans במבחנה ברקמות המארח. בהיפאי הופץ במבחנה, תאי שמרים עגולים, תאי מעיים ותאים אטומים היו קבועים, מחלחלים, ונבדלו עם פלואורסצנטיות ומיקרוסקופיה ניגודיות פאזה.

שמרים עגולים והיפאי מוארך מאוד דימויו במעי הגס של העכבר. הרקמות המארחות היו מוכתמות בגשוש הספציפי של הסי-אלביקנים או בגשוש הפנפונגלי. C.albicans היה שכותרתו אדום, תא מארח גרעינים כחולים, ואת שכבת ריר ירוק.

C.albicans זוהה בחלקים שונים של מערכת העיכול מורין כולל האזורים הסמוכים מיד רירית המארח ואזורים מרכזיים יותר של לומן הבטן. עבור מדענים שלא ביצעו בעבר את טכניקת gavage, חשוב להשיג הכשרה מיוחדת לפני שתנסה שיטה זו. לאחר כתמי דגים, ניתן להשתמש בטכניקות immunofluorescent כדי להכתים תכונות נוספות של רירית המארח.

זה יכול לאפשר אפיון של נזק לרקמות או תגובות חיסוניות של המארח. טכניקה זו אפשרה לנו לאפיין את הקשר בין מורפולוגיה של תאים פטרייתיים של מוטנטים קנדידה אלביקנים והישרדות בתוך המארח לקדם את ההבנה שלנו של קנדידה אלביקנים ביולוגיה שניתן לנצל בעת פיתוח טיפולים.